Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt finansiering från Nya Zeeland Marsden Fund (Grant UOO1305), och ett blockbidrag från Medicinska fakulteten, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De vill tacka Universitetet i Otago för att ha gett G. Madani ett doktorandstipendium. Författarna vill också uttrycka sin tacksamhet till professor Stefan Raunser och hans kollegor, Dr Amir Apelbaum, och Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, för deras stöd och övervakning under ett 6-månaders besök av G. Madani vid Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Författarna tackar också den tyska akademiska utbytestjänsten (DAAD) för att ge G. Madani ett forskningsanslag (57381332) för att besöka MPIMP.

1. Beredning av färska eller frysta lager av omvandlings kompetenta ADΔ- och ADΔΔ-celler
<ol><li>Inokulera 25 ml 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextros), 0,079 % (w/v) CSM (komplett tilläggsblandning)]35 medium med en enda jästkoloni och inkubera över natten (o/n) i 16 timmar vid 30 °C med skakningar vid 200 varv per minut (varvtal).</li>
	<li>Inokulera 225 ml 2x YPCD-medium med 25 ml o/n-odling och kontrollera cellens optiska densitet vid 600 nm (...

Trots de senaste framstegen i den strukturella analysen av membranproteiner finns det för närvarande ingen 3D-struktur för Cdr1, eller någon annan PDR-transportör. Så att få kunskap om Cdr1-strukturen och dess biokemiska egenskaper är viktigt, eftersom detta inte bara kommer att ge insikt i rationell design av nya läkemedel för att övervinna spillflödesmedierad läkemedelsresistens, men också i funktionsmekanismen hos en viktig underfamilj av ABC-proteiner.
Ett av de viktigaste kr...

Extraktionen av integrerade membranproteiner från deras inhemska lipidmiljö kan dramatiskt påverka deras struktur ochfunktion 1,2,3,4. Den komplexa lipidsammansättningen av biologiskamembran 5 säkerställer att kritiskt viktiga protein-lipidinteraktioner kan uppstå6. Lipider upprätthåller membranproteinernas strukturella integritet, vilket gör det möjligt för dem att fungera korrekt i sitt membranfack destination(er)7,8. Därför är ett kritiskt första steg i membranproteinrening extraktionen av proteinet från sin ursprungliga miljö utan att påverka dess struktur och / eller funktion.
Det finns många hinder för att karakterisera strukturen hos membranproteiner, varav de flesta är relaterade till deras hydrofobiska natur, och svårigheterna att uttrycka korrekt vikta och funktionella membranproteiner i de mängder som krävs för röntgenkristallografi eller kryoelektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Det finns tre typer av membranproteinuttryckssystem: homolog9, heterolog13,14,15och in vitro-uttryckssystem 16,17. De ofta låga uttrycksnivåerna, eller de oöverkomliga kostnaderna, för många uttryckssystem lämnar bara ett fåtal värdar som det föredragna alternativet att producera membranproteiner. De inkluderar bakterievärden, Escherichia coli, jästarna S. cerevisiae och Pichia pastoris, och högre eukaryoter som Sf9 insektsceller eller däggdjurscelllinjer18. Alla membranproteinuttrycksteknik har fördelar och nackdelar; S. cerevisiae är dock kanske den bäst studerade eukaryota modellorganismen som lämpar sig för produktion av membranproteiner. Det är mycket mångsidigt med tillämpningar inom genteknik, läkemedelsupptäckt, syntetisk biologi och uttryck av eukaryota membranproteiner14,19,20,21.
I denna studie användes en patenterad S. cerevisiae membran protein uttryckteknik 21, med S. cerevisiae ADΔ14 och ADΔΔ22 som de föredragna värdarna (Figur 1A), att överuttrycka och studera de stora C. albicans multidrug efflux pump Cdr1. Båda S. cerevisiae stammarna är derivat av AD1-8u- 23 som har antingen ura3 (ADΔ) eller både ura3 och his1 (ADΔΔ) gener raderas för att eliminera eventuella falska positiva uracil eller histidin prototroph transformanter som uppstår genom oönskad integration vid URA3 eller HIS1ic lokus. Borttagningen av de 7 stora multidrogutflödespumparna23, som anges i figur 1A, gör ADΔΔ utsökt känslig för de flesta xenobiotika. Den funktionsförstärkningsfaktorn Pdr1-3 orsakar det konstituerande överuttryck av heterologa membranproteiner som Cdr1 (röda åttagoner i figur 1A) efter integrering av den heterologa ORF-innehållande omvandlingskassetten (figur 1A) vid den genomiska PDR5-locusen (blå rektangel i figur 1A) via två homologa rekombinationshändelser. Korrekt plasmamembranlokalisering av C-terminally mGFPHis märkta proteiner kan bekräftas genom konfokal mikroskopi (Figur 1A), och His-taggen kan användas för nickel-affinitet rening av det märkta proteinet. Kloning av vissa svamp ABC-transportörer (t.ex. Candida krusei ABC1) till pABC3-härledda plasmider var dock inte möjligt eftersom de inte kunde förökas i Escherichia coli på grund av celltoxicitet. Detta föranledde utvecklingen av enstegskloning avmembranproteiner 14,24 märkta vid antingen deras N- eller C-ändstation med olika affinitet, epitop eller reportertaggar direkt i S. cerevisiae ADΔΔ ( Figur1C). S. cerevisiae (S. cerevisiae) ADΔΔ-stammar som överuttrycker olika CDR1-mutanter kan också skapas effektivt på detta sätt genom att använda upp till fem enskilda PCR-fragment som överlappar varandra med 25 bp (Figur 1C). Med hjälp av detta protokoll kan många ORF av intresse klonas, uttryckas och karakteriseras till låg kostnad och med hög effektivitet inom en mycket kort tidsperiod. Omvandlingseffektiviteten minskar endast ~2-faldigt med varje ytterligare PCR-fragment.
Om så önskas kan uttrycksnivåer också lätt manipuleras av primerdesign för att förutsägbart justera uttrycksnivåer ner till någonstans mellan 0,1%-50% av de vanligtvis höga, konstituerande uttrycksnivåerna25. Den optimerade, multifunktionella, pABC314 derivatkloningsvektorn, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) innehåller en HRV-3C proteas klyvningsplats (X; LEVLFQ| GP), en proteas som presterar bättre vid 4 °C än det ofta använda tobaksetsningviruset (TEV) proteas27. L är en fem aminosyra (GSGGS) linker, mGFP är en monomeric mutant (A206K)28,29 version av jästen förbättrad grön-fluorescens protein variant yEGFP330, och Hans är en tre aminosyra linker (GGS) följt av sex-hisoretidin (HHHHHH) nickel-affinitet protein rening tagg.
Denna uttrycksteknik har framgångsrikt använts vid läkemedelsupptäckt och studier av membranproteiner. Den första strukturen för ett svamp azole drog mål, S. cerevisiae Erg1131, löstes med hjälp av denna teknik. Det möjliggjorde också detaljerad karakterisering av C. albicans Cdr132,33,34 och skapandet av en cysteinbrist Cdr1-molekyl35 lämplig för cysteinkorslänkningsstudier för att verifiera framtida högupplöst struktur. Många andra ABC-transportörer från stora mänskliga svamppatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei och Fusarium solani artkomplex) har också studerats i detalj med hjälp av detta uttryck plattform24,36,37,38,39. Detta har gjort det möjligt för generationen av en panel av S. cerevisiae stammar överuttryckande efflux pumpar som har använts i hög genomströmningsskärmar att upptäcka den nya fluorescerande effluxpumpen substrat Nile röd40 ochspecifika 41 och bredspektrum14,33,42,43,44 efflux pumporer. Användningen av detta system möjliggjorde också upptäckten av clorgyline som den första i sitt slag bredspektrum svamp multidrug efflux pumphämmare42.
Fullständig löslighet av membranproteiner och skapandet av ett homogent membranprotein-micelle-preparat utan endogena lipider kräver höga tvättmedelskoncentrationer45. Men tyvärr inaktiverar detta också ofta membranetproteinet 5,8,45,46. Egenskaperna hos tvättmedelsmonomerer och deras aggregering i lösning påverkas av de fysiska egenskaperna hos den hydrofobiska svansen, alkylkedjans längd och förgrening, närvaron av en aromatisk kärna eller fluoralkyl sidokedja eller antalet polyoxyetylenenheter. Således är tvättmedel screening ett viktigt första steg för att bestämma det lämpligaste tvättmedlet för membranproteinlöslighet och rening.
C. albicaner är en stor mänsklig svamppatogen hos immunkomprometterade individer som kan orsaka allvarliga, livshotande invasivainfektioner 47, och det kan bli resistent mot azole antifungalläkemedel48,49. En av de viktigaste mekanismerna för C. albicans multidrogresistens är överuttryck av Cdr150, som är en typ II ATP-bindande kassett (ABC)transportör 51 av ABCG underfamilj belägen i plasmamembranet. Fullstora svamp ABCG transportörer (bestående av två nukleotid bindande domäner [NBDs] och två transmembran domäner [TMDs]) är mer allmänt kända som pleiotropa läkemedelsresistens (PDR) transportörer och kännetecknas av deras unika inverterade domän topologi [NBD-TMD]2. PDR transportörer finns endast i växter52,53 och svampar54. Trots deras betydelse finns det inga strukturer för PDR-transportörer, även om strukturer för mänskliga halvstora ABCG-transportörer nyligen har lösts vilket hjälpte till att skapa den första preliminära modellen för Cdr133. Våra senaste experimentella bevis tyder dock på att denna modell är bristfällig möjligen för att svamp PDR-transportörer har karakteristiska asymmetriska NBDs som möjligen resulterar i en unik transportmekanism. En högupplöst struktur av Cdr1 krävs därför för både rationell design av nya effluxpumphämmare som kan hjälpa till att övervinna spillvattenmedierad läkemedelsresistens och för att ge insikter om verkningsmekanismen för denna viktiga ABC-transportörfamilj.
Syftet med denna studie var att utveckla tillförlitliga protokoll för uttryck, löslighet och rening av Cdr1 i den genetiskt modifierade S. cerevisiae uttryck värd, med det slutliga syftet att få en högupplöst struktur för Cdr1. Som en del av denna process utformades en proteas-klyvbar mGFPHis dubbeltagg (figur 1B) med en 16-restlänkare som separerade taggen från CDR1: s C-ändstation, vilket förbättrade bindningen av den bifogade 6x Hans affinitetsmärke till nickel-affinitethartset och möjliggjorde övervakning av Cdr1-uttrycksnivåer i levande celler och under hela reningsprocessen. Ett reproducerbart protokoll för småskaliga jäst plasmamembran protein preparat som innehåller cirka 10% C. albicans Cdr1 (uppskattas av Coomassie färgning efter SDS-PAGE) utvecklades också, som kunde användas för biokemiska karakterisering av Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Den framgångsrika biokemiska och biofysiska karakteriseringen av ABC-transportörer beror starkt på valet av det heterologa uttryckssystemet. Under de senaste två decennierna har vi utvecklat en plattform för jästmembranproteinuttryck som har använts för att studera många viktiga svampmembranproteiner. Uttrycket värd Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ raderas i sju stora endogena ABC transportörer och det innehåller transkription faktorn Pdr1-3 med en vinst-av-funktion mutation som möjliggör den konstituerande överuttryck av heterologa membran protein gener stabilt integrerad som enskilda kopior vid den genomiska PDR5 locus. Skapandet av mångsidiga plasmidvektorer och optimeringen av enstegskloningsstrategier möjliggör snabb och exakt kloning, mutagenes och uttryck för heterologa ABC-transportörer. Här beskriver vi utvecklingen och användningen av en ny proteas-cleavable mGFPHis dubbel tagg (dvs. den monomeriska jästen förbättrade grönt fluorescerande protein yEGFP3 smält till en sex-histidin affinitet reningstaggg) som var utformad för att undvika eventuell störning av taggen med proteinet av intresse och att öka bindningseffektiviteten hos hans tagg till nickel-affinitet hartser. Fusionen av mGFPHis till membranproteinet ORF (öppen läsram) möjliggör enkel kvantifiering av proteinet genom inspektion av polyakrylamidgeler och detektion av nedbrytningsprodukter som behåller mGFPHis-taggen. Vi visar hur denna funktion underlättar tvättmedel screening för membran protein löslighet. Ett protokoll för effektiv, snabb och tillförlitlig isolering av de småskaliga plasmamembranpreparaten av C-terminally märkta Candida albicans multidrug efflux transportör Cdr1 överuttryckt i S. cerevisiae ADΔΔ, presenteras. Detta småskaliga plasmamembranisoleringsprotokoll genererar högkvalitativa plasmamembran inom en enda arbetsdag. Plasmamembranpreparaten kan användas för att bestämma enzymaktiviteterna hos mutantvarianterna Cdr1 och Cdr1.

En hög omvandlingsfrekvens av S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) uppnåddes med pYES2 (Figur 2B). Som förväntat gav kontrollen nr DNA (dvs. ddH2O) inga transformatorer, och 1 μg linjär CDR1-mGFPHis omvandlingskassett (Figur 1A) gav ~ 50 transformanter (figur 2C) med det optimerade ADΔΔ-omvandlingsprotokollet. CDR1-mGFPHis transformatorer testad...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Denna artikel presenterar ett småskaligt plasmamembran isolering protokoll för karakterisering av Candida albicans ABC (ATP-bindande kassett) protein Cdr1, överuttryckt i Saccharomyces cerevisiae. En proteas-cleavable C-terminal mGFPHis dubbeltagg med en 16-restlänkare mellan Cdr1 och taggen utformades för att underlätta rening och tvättmedelsscreening av Cdr1.

Småskalig plasmamembranpreparat för analys av Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Det småskaliga plasmamembranisoleringsprotokollet och mGFPHis dubbeltagg ger en ekonomisk, snabb, pålitlig och enkel metod för att karakterisera membranproteiner i den eukaryota modellorganismen Saccharomyces cerevisiae. Den största fördelen med denna teknik är hur lätt och snabb membranproteinuttrycksnivåer, ATP: s aktiviteter och tvättmedlet är bäst lämpat för deras rening kan bestämmas. Denna teknik är mycket användarvänlig.En viktig punkt att komma ihåg är dock att skörda celler som OD 600 av 2, vilket säkerställer låg mitokondriell förorening och högsta möjliga ATPase-aktiviteter. Börja med att förkultera en enda jästkoloni i 10 milliliter YPD-medium vid 30 grader Celsius i sju till åtta timmar vid 200 rotationer per minut. Använd 10 milliliter förkultur för att inokulera 40 milliliter färskt YPD-medium.Inkubera sedan cellerna vid 30 grader Celsius över natten vid 200 rotationer per minut tills celltätheten når en OD 600 av en till tre. Nästa dag skörda 40 optiska densitetsenheter, eller ODU, av logaritmiska ansiktsceller genom att centrifugera vid 4 200 gånger G per fem minuter vid fyra grader Celsius. Suspendera och tvätta celler med 40 milliliter iskallt sterilt dubbeldestillerat vatten.Upprepa tvätten med en milliliter iskallt vatten med centrifugalisering mellan tvättstegen. Suspendera pelleten i en milliliter iskallt sterilt vatten och överför cellfjädringen till ett mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter förkylt på is. Skörda celler vid 3 300 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius.Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i 500 mikroliter homogeniserande buffert som nyligen kompletterats med en millimolär fenal metylsulffa Neal fluor, eller PMSF. Förvara cellfjädringen på minus 80 grader Celsius tills den används vidare. Tina cellerna på is i ungefär en timme.Tillsätt sedan iskalla kiseldioxidpärlor med diametern 0,5 millimeter till cellfjädringens 500 mikroliter för att nå en total volym på en milliliter. För att bryta cellerna, virvel cellupphängning med maximal skakning intensitet i en minut, i sex cykler, med en tre minuters kylningsperiod på is efter varje cykel. Efter virvelvind, gör ett tunt hål längst ner på röret med ett uppvärmt skalpellblad och samla den trasiga cell homogenatet i en annan iskall 1,5 milliliter mikrocentrifugerör med en låg hastighet spinn i 10 sekunder.Centrifugera den insamlade cell homogenatet vid 5, 156 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius för att ta bort cellrester. Överför 450 mikroliter supernatant till ett iskallt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och tillsätt en milliliter iskall homogeniseringsbuffert kompletterad med en millimolär färsk PMSF. För att skörda plasmamembran centrifug cell suspension vid 17, 968 gånger G i en timme vid fyra grader Celsius.Ta bort supernaten och tillsätt 100 mikroliter homogeniserande buffert ny kompletterad med en millimolär PMSF. Lossa sedan plasmamembranpelleten genom att röra om med 100 mikroliterpipettspetsen och suspendera pelleten igen genom att upprepa pipetting upp och ner. Mät proteinkoncentrationen i plasmamembranberedningen med ett proteintestkit som är kompatibelt med buffertar som innehåller reducerande medel och tvättmedel.Förvara plasmamembranen på minus 80 grader Celsius, eller håll dem på is för omedelbar användning. Häll fyra till fem milliliter separat gel i den monterade gelapparaten upp till två centimeter från toppen. Lägg försiktigt en till två milliliter 0,1%SDS ovanpå och låt poly akrylamidgelen ställas in i 60 minuter vid rumstemperatur.Efter en timme ta bort 0,1%SDS-skiktet från den polymeriserade separerande gelén och skölj gelén med dubbelt destillerat vatten för att ta bort spår av SDS. Häll staplingsgelblandningen på avskiljgelen. Placera en kam i staplingsgelen och ta bort eventuella luftbubblor runt kammen.Låt sedan staplingsgelen ställas in i 60 minuter vid rumstemperatur. Ta bort kammen och skölj sedan gelspåren med vatten. Lägg gelén i geltanken och fyll geltanken till toppen med löpbuffert.Blanda fem till tio mikroliter plasmamembranprover med lika stora volymer av två gånger proteinbelastningsfärgämnet och ladda omedelbart provblandningen i enskilda gelspår, nedsänkta i löpbuffert. Ladda proteinmolekylviktsmarkörer i intervallet från 10 till 245 Kilodalton i en separat slits för att möjliggöra storleksuppskattning av enskilda proteinfragment. Utför gelelektrofores vid 200 volt tills det blå belastningsfärgämnet når botten av gelén.Undersök gelén för GFP-fluorescens i gel med ett gelavbildningssystem. Efter fluorescerande bildbehandling fix proteiner i 10 till 20 milliliter protein gel fixering lösning genom mild agitation av gelén i 15 minuter vid rumstemperatur. Skölj sedan två gångerna i 10 minuter med 10 milliliter dubbeldestillerat vatten och placera gelén i 10 milliliter kolloidal Kumasi-fläcklösning med skonsam skakning i en timme vid rumstemperatur för att visualisera proteinband.För förbättrad visualisering av proteinband, avfärga gelén en eller två gånger i 20 milliliter dubbeldestillerat vatten i en timme innan du spelar in bilder med gelavbildningssystemet. En hög frekvens av omvandling av Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta uppnåddes med den positiva kontrollplasmid PS2. Inga Eurocell Prototron transformantia erhölls för den negativa kontrollen.Cirka 50 URA cell prototroph CDR1-mGFPHis transformant erhölls efter inkubation omvandlade AD Delta celler på CSM minus URA plattor i tre dagar. Petite transformant som inte kan växa på YPG agarplattor eliminerades. CDR1-mGHPHis prover med varierande koncentrationer kvantifierades med in-gel fluorescens.MGFP fluorescens intensiteter var linjära över hela koncentrationsområdet med minimal bakgrund fluorescens. Varierande celltäthet indikerade att bryta 40 ODU av celler gav högsta kvalitet av plasmamembran med den högsta CDR1 ATPase aktivitet. Plasmamembranens utbyte ökade dock i proportion till ökande celltäthet.Förmågan hos 31 tvättmedel med olika egenskaper att lösliggöra CDR1-mGHPHis från råa plasmamembran av AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis celler testades med SDS sida. Beta och alfa DDM och Fos-kolin 13 var de bästa tvättmedel för att lösliggöra CDR1-mGHPHis. Fos-kolin 13 orsakar dock partiell hydrolys av CDR1-mGHPHis.Rå plasma membran protein lösligt med 1%tvättmedel separerades med hjälp av en superos sex ökade 10 300 GL storlek uteslutning kolumn. Kromatogram av maltosides och LMNG extraherade proteiner visade de flesta CDR1-mGHPHis gäcka som en snyggt formad Gaussian topp på 15,5 millimeter CDR1-mGHPHis löslig med glukos innehållande tvättmedel anspelade som en aggregerad eller bred aggregerad topp. De högre topparna för DDM anges att en stor del av DMN G lösliga CDR1-mGHPHis kan denatureras.I FSCC-kromatogrammen för zwitterionic Fos-cholines och två icke-joniska tvättmedel endast Digitonin och gav ett liknande kromatogram till DDM. Fos-kolin 13 gav en symmetrisk skarpformad topp, men det anspelade med en betydligt lägre elueringsvolym än den för DDM. Den optimerade dubbeltaggen förbättrar också reningsutbytet och hjälpte till att bestämma lokalisering, handel och termisk stabilitet hos membranproteiner.Den heterologa uttryckstekniken kan också användas vid läkemedelsscreening med hög genomströmning och detaljerad karakterisering av många andra membranproteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kvantitativ mätning av GLUT4 Translokation till plasmamembranet med flödescytometri

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskaliga nukleärextrakt för funktionella analyser av genuttryck maskinerier

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membrane Deformationer Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Produktions Protokoll för Småskalig Tillverkning av probiotiska fermenterade livsmedel

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestämning av plasmamembranet partitionering för perifert-associerade proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Karakterisering av MLKL-medierad plasmamembranet bristning i Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Provberedning för Mass-Spektrometri-baserad proteomik analys av okulär microvesselsna

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans: En omfattande CUT &amp; RUN-metod och dataanalysarbetsflöde

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...