Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Yazarlar, Yeni Zelanda Marsden Fonu'ndan (Grant UOO1305) ve Chulalongkorn Üniversitesi, Bangkok, Tayland Tıp Fakültesi'nden (M. Niimi) bir blok hibeyi minnetle kabul ediyorlar. Otago Üniversitesi'ne G. Madani'ye doktora bursu sağladığı için teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Profesör Stefan Raunser ve meslektaşları Dr. Amir Apelbaum ve Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam'a, G. Madani'nin Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü'nde (MPIMP), Dortmund, Almanya'da 6 aylık ziyaretinde destekleri ve gözetimleri için şükranlarını sunmak istiyor. Yazarlar ayrıca Alman Akademik Değişim Servisi'ne (DAAD) G. Madani'ye MPIMP'yi ziyaret etmesi için bir araştırma hibesi (57381332) sağladığı için teşekkür ediyor.

1. Taze veya dondurulmuş dönüşüm stoklarının hazırlanması yetkin ADΔ ve ADΔΔ hücreleri
<ol><li>2x YPCD'nin 25 mL'sini aşılayın [yani, 2x YPD; %2 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %4 (w/v) dekstroz), %0,079 CSM (tam takviye karışımı)] Tek maya kolonili35 ortam ve dakikada 200 devirde (rpm) sallanarak 30 °C'de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>25 mL o/n kültürü ile 225 mL 2x YPCD ortamını aşıla ve hücre optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD...

Membran proteinlerinin yapısal analizindeki son ilerlemeye rağmen, Cdr1 veya başka bir PDR taşıyıcısı için 3D yapı mevcut değildir. Bu nedenle, Cdr1 yapısı ve biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi edinmek önemlidir, çünkü bu sadece efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmek için yeni ilaçların rasyonel tasarımı hakkında değil, aynı zamanda ABC proteinlerinin önemli bir alt familyasının işlev mekanizmasına da içgörü sağlayacaktır.
Membran protein...

İntegral membran proteinlerinin doğal lipit ortamlarından çıkarılması, yapılarını ve işlevlerini önemli ölçüde etkileyebilir1,2,3,4. Biyolojik membranların karmaşık lipit bileşimi5, kritik öneme sahip protein-lipit etkileşimlerinin gerçekleşebilmesini sağlar6. Lipitler membran proteinlerinin yapısal bütünlüğünü korur, böylece membran bölmesi hedeflerinde(ler) 7,8'de doğru çalışmasını sağlar. Bu nedenle, membran proteini saflaştırmasında kritik bir ilk adım, proteinin yapısını ve/veya işlevini etkilemeden doğal ortamından çıkarılmasıdır.
Çoğu hidrofobik doğası ile ilgili olan membran proteinlerinin yapısını ve X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) 9 , 10,11,12içingerekli miktarlarda düzgün katlanmış ve fonksiyonel membran proteinlerini ifade etmenin zorluklarının karakterizesinde birçok engel vardır. Üç tür membran protein ekspresyon sistemi vardır: homolog9, heterolog13,14,15ve in vitro ekspresyon sistemleri16,17. Birçok ifade sisteminin genellikle düşük ifade seviyeleri veya yasaklayıcı maliyetleri, membran proteinleri üretmek için tercih edilen seçenek olarak sadece birkaç ana bilgisayar bırakır. Bakteri konakçısı, Escherichia coli, S. cerevisiae ve Pichia pastoris mayalarıve Sf9 böcek hücreleri veya memeli hücre hatları18gibi daha yüksek ökaryotlar içerir. Tüm membran protein ekspresyon teknolojilerinin avantajları ve dezavantajları vardır; bununla birlikte, S. cerevisiae belki de membran protein üretimi için uygun en iyi çalışılan ökaryotik model organizmadır. Genetik mühendisliği, ilaç keşfi, sentetik biyoloji ve ökaryotik membran proteinlerinin ekspresyasyonu14 , 19,20,21'dekiuygulamalarla çok yönlüdür.
Bu çalışmada, büyük C. albicans multidrug efflux pompaCdr1'i aşırı ifade etmek ve incelemek için S. cerevisiae ADΔ14 ve ADΔΔ 22 tercih edilen konaklar ( Şekil1A)ile patentli bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi21 kullanılmıştır. Her iki S. cerevisiae suşu da AD1-8utürevleridir -23, URA3 veya HIS1 genomik loci'deki istenmeyen entegrasyon yoluyla ortaya çıkan yanlış pozitif urasil veya histidin prototroph dönüştürücülerini ortadan kaldırmak için silinen ura3 (ADΔ) veya hem ura3 hem de onun1 (ADΔΔ) genlerine sahiptir. Şekil 1A'dabelirtilen 7 büyük multidrug efflux pompa23'ünsilinmesi, ADΔΔ'yi çoğu ksenobiyotiklere karşı mükemmel derecede hassas hale getirir. Fonksiyon kazancı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, Cdr1 (Şekil 1A'dakikırmızı sekizgenler) gibi heterolog membran proteinlerinin konsitülatif aşırı ekspresyonuna neden olur. heterolog-ORF içeren dönüşüm kasetinin (Şekil 1A) genomik PDR5 lokusunda (Şekil 1A'damavi dikdörtgen) iki homolog rekombinasyon olayı ile entegrasyonu. C-terminal mGFPHis etiketli proteinlerin uygun plazma membran lokalizasyonu konfokal mikroskopi (Şekil 1A) ile doğrulanabilir ve O etiketi etiketli proteinin nikel benzeşim saflaştırılması için kullanılabilir. Bazı mantar ABC taşıyıcılarının (örneğin, Candida krusei ABC1)pABC3 türevi plazmidlere klonlamaları, ancak hücre toksisitesi nedeniyle Escherichia coli'de yayılamadıkları için mümkün değildi. Bu,14,24 membran proteinlerinin N veya C-terminuslarında çeşitli benzeşim, epitop veya muhabir etiketleriyle etiketlenmiş tek adımlı klonlamanın doğrudan S. cerevisiae ADΔΔ'ye(Şekil 1C)geliştirilmesine neden oldu. S. cerevisiae Çeşitli CDR1 mutantlarını aşırı ifade eden ADΔΔ suşları, 25 bp(Şekil 1C)ile çakışan beş adede kadar ayrı PCR parçası kullanılarak da verimli bir şekilde oluşturulabilir. Bu protokolü kullanarak, birçok ilgi çekici ORF çok kısa bir süre içinde düşük maliyetle ve yüksek verimlilikle klonlanabilir, ifade edilebilir ve karakterize edilebilir. Dönüşüm verimliliği, her ek PCR parçasıyla yalnızca ~2 kat azaltır. 
İstenirse, ifade düzeyleri, genellikle yüksek, kesin ifade düzeylerinin% 0,1-% 50'si arasında herhangi bir yere kadar ifade düzeylerini tahmin edilebilir şekilde ayarlamak için astar tasarımı tarafından kolayca manipüle edilebilir25. Optimize edilmiş, çok fonksiyonlu, pABC314 türev klonlama vektörü, pABC3-XLmGFPHis26 (Şekil 1B) bir HRV-3C proteaz bölünme bölgesi (X; LEVLFQ| GP), sık kullanılan tütün etch virüsünden (TEV) daha iyi performans gösteren bir proteaz27. L beş amino asit (GSGGS) bağlayıcıdır, mGFP bir monomerik mutanttır (A206K)28,maya geliştirilmiş yeşil floresan protein varyantı yEGFP330'un29 versiyonudur ve His üç amino asit bağlayıcıdır (GGS) ve ardından altı-histidin (HHHHHH) nikel benzeşim proteini saflaştırma etiketidir.
Bu ifade teknolojisi ilaç keşfinde ve membran proteinlerinin incelenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Mantar azol ilaç hedefi olan S. cerevisiae Erg1131için ilk yapı bu teknoloji kullanılarak çözüldü. Ayrıca C. albicans Cdr132 , 33,34'ün ayrıntılı karakterizasyonunu ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapıları doğrulamak için sistein çapraz bağlama çalışmalarına uygun sistein eksikliği olan bir Cdr1 molekülü35'in oluşturulmasını sağladı. Büyük insan mantar patojenlerinden diğer birçok ABC taşıyıcısı (yani, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ve Fusarium solani tür kompleksi) de bu ifade platformu24, 36,37,38,39kullanılarak ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu, yeni floresan efflux pompa substratı Nil kırmızısı 40 ve spesifik 41 ve geniş spektrumlu 14 ,33,42 , 43 ,44 efflux pompa inhibitörlerini keşfetmek için yüksek verimli ekranlarda kullanılanefflux pompalarını aşırı ifade eden bir S. cerevisiae suşları panelinin üretilmesini sağlamıştır. Bu sistemin kullanımı ayrıca clorgyline'ın türünün ilk geniş spektrumlu mantar çokdrug efflux pompa inhibitörü42olarak keşfedilmesini sağladı.
Membran proteinlerinin tam çözünmesi ve endojen lipitlerden yoksun homojen bir membran protein-misel preparatının oluşturulması, yüksek deterjan konsantrasyonları gerektirir45. Ancak ne yazık ki, bu genellikle membran proteini 5 ,8,45,46'yıda devre dışı bırakmaktadır. Deterjan monomerlerinin özellikleri ve çözeltideki toplamaları, hidrofobik kuyruğun fiziksel özelliklerinden, alkil zincirinin uzunluğundan ve dallanmasından, aromatik bir çekirdeğin veya floroalkil yan zincirin varlığından veya polioksiyetil ünitelerin sayısından etkilenir. Bu nedenle deterjan taraması, membran proteini çözünmesi ve saflaştırılması için en uygun deterjanı belirlemek için önemli bir ilk adımdır.
C. albicans ciddi, hayatı tehdit eden invaziv enfeksiyonlara neden olabilen immün sistemi baskılanmış bireylerin önemli bir insan mantar patojenidir47ve azol antifungal ilaçlara dirençli hale gelebilir48,49. C. albicans multidrug direncinin ana mekanizmalarından biri Cdr150plazma membranında bulunan ABCG alt familyasının tip II ATP bağlayıcı kaseti (ABC) taşıyıcı51'dir. Tam boyutlu mantar ABCG taşıyıcıları (iki nükleotid bağlama etki alanı [NBD] ve iki transmembran etki alanından [TMD]) daha yaygın olarak pleiotropik ilaç direnci (PDR) taşıyıcıları olarak bilinir ve benzersiz ters etki alanı topolojisi [NBD-TMD]2ile karakterize edilir. PDR taşıyıcıları sadece52, 53ve mantar54 bitkilerinde bulunur. Önemlerine rağmen, PDR taşıyıcıları için hiçbir yapı yoktur, ancak insan yarı boyutlu ABCG taşıyıcıları için yapılar son zamanlarda cdr133için ilk belirsiz modelin oluşturulmasına yardımcı olan çözülmüştür. Bununla birlikte, son deneysel kanıtlarımız, bu modelin muhtemelen kusurlu olduğunu göstermektedir, çünkü mantar PDR taşıyıcıları karakteristik asimetrik NBD'lere sahiptir ve bu da muhtemelen benzersiz bir taşıma mekanizmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, Cdr1'in yüksek çözünürlüklü bir yapısı, hem efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek yeni efflux pompa inhibitörlerinin rasyonel tasarımı hem de bu önemli ABC taşıyıcı ailesinin etki mekanizması hakkında içgörüler sağlamak için gereklidir.
Bu çalışmanın amacı, Cdr1 için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek amacıyla, genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae ekspresyon konağında Cdr1'in ekspresyasyonu, çözünürlüğü ve saflaştırılması için güvenilir protokoller geliştirmekti. Bu sürecin bir parçası olarak, proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiket (Şekil 1B) etiketi Cdr1'in C-terminusundan ayıran 16 kalıntılı bir bağlayıcı ile tasarlanmıştır, bu da ekli 6x Benzeşim etiketinin nikel benzeşim reçinesine bağlanmasını iyileştirdi ve cdr1 ifade seviyelerinin canlı hücrelerde ve tüm saflaştırma işlemi sırasında izlenmesini sağladı. Cdr1'in biyokimyasal karakterizasyonu için kullanılabilecek, yaklaşık% 10 C. albicans Cdr1 (SDS-PAGE'den sonra Coomassie boyama ile tahmin edildiği gibi) içeren küçük ölçekli maya plazma membran protein preparatları için tekrarlanabilir bir protokol de geliştirilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

ABC taşıyıcılarının başarılı biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu büyük ölçüde heterolog ekspresyon sisteminin seçimine bağlıdır. Son yirmi yılda, birçok önemli mantar zarı proteinini incelemek için kullanılan bir maya zarı proteini ekspresyon platformu geliştirdik. Ekspresyon konağı Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ yedi büyük endojen ABC taşıyıcılarında silinir ve genomik PDR5 lokusunda tek kopya olarak bıçaklanmış heterolog membran protein genlerinin konsitütif aşırı ekspresyonunu sağlayan fonksiyon kazancı mutasyonu ile pdr1-3 transkripsiyon faktörünü içerir. Çok yönlü plazmid vektörlerin oluşturulması ve tek adımlı klonlama stratejilerinin optimizasyonu, heterolog ABC taşıyıcılarının hızlı ve doğru klonlanmasını, mutajenizini ve ekspresyonunu sağlar. Burada, yeni bir proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiketinin geliştirilmesini ve kullanımını anlatıyoruz (yani, monomerik maya geliştirilmiş yeşil floresan protein yEGFP3 altı-histidin benzeşim saflaştırma etiketine kaynaşmış) etiketin ilgi proteini ile olası müdahalesini önlemek ve O etiketinin nikel benzeşim reçinelerine bağlama verimliliğini artırmak için tasarlanmıştır. mGFPHis'in membran proteini ORF'ye (açık okuma çerçevesi) füzyonu, poliakrilamid jellerin incelenmesi ve mGFPHis etiketini koruyan bozulma ürünlerinin tespiti ile proteinin kolayca ölçülmesini sağlar. Bu özelliğin membran proteini çözünürlüğü için deterjan taramayı nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. S. cerevisiae ADΔΔ'de aşırı ifade edilen C-terminal etiketli Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1'in küçük ölçekli plazma membran preparatlarının verimli, hızlı ve güvenilir izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü, tek bir iş günü içinde yüksek kaliteli plazma membranları üretir. Plazma membran preparatları Cdr1 ve Cdr1 mutant varyantlarının enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılabilir.

pYES2(Şekil 2B)ile S. cerevisiae ADΔΔ'nin (~4 x10 4 transformant/μg) yüksek dönüşüm sıklığı elde edildi. Beklendiği gibi, DNA (yani, yalnızca ddH2O) kontrolü dönüştürücü vermedi ve doğrusal CDR1-mGFPHis dönüşüm kasetinin 1 μg'si (Şekil 1A) optimize edilmiş ADΔΔ dönüşüm protokolü ile ~50 dönüştürücü (Şekil 2C) verdi. CDR1-mGFPHis...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü ve mGFPHis çift etiket, ökaryotik model organizma saccharomyces cerevisiae membran proteinlerini karakterize etmek için ekonomik, hızlı, güvenilir ve kolay bir yöntem sağlar. Bu teknolojinin en büyük avantajı, membran protein ekspresyon seviyelerinin, ATP'nin faaliyetlerinin ve deterjanın saflaştırılması için en uygun olduğu kolaylık ve hızdır. Bu teknoloji çok kullanıcı dostudur.Bununla birlikte, hatırlanması gereken önemli bir nokta, hücreleri düşük mitokondriyal kontaminasyon ve mümkün olan en yüksek ATPase aktivitelerini sağlayan 2'nin OD 600'ü olarak hasat etmektir. Dakikada 200 dönüşte yedi ila sekiz saat boyunca 30 santigrat derecede 10 mililitre YPD ortamında tek bir maya kolonisini önceden kült ederek başlayın. 40 mililitre taze YPD ortamını aşılamak için 10 mililitre ön kültür kullanın.Daha sonra hücre yoğunluğu bir ila üç arasında bir OD 600'e ulaşana kadar hücreleri dakikada 200 dönüşte bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, dört santigrat derecede beş dakikada 4.200 kez G'de santrifüjleme yaparak logaritmik yüz hücrelerinin 40 optik yoğunluk birimini veya ODU'yu hasat edin. Hücreleri 40 mililitre buz gibi steril çift damıtılmış su ile yeniden askıya alın ve yıkayın.Yıkama adımları arasında santrifüjleme ile bir mililitre buzlu soğuk su kullanarak yıkamayı tekrarlayın. Peletin bir mililitre buz gibi steril suda yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarılması. Hücreleri 3,300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca hasat edin.Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir milimoler fenal metil sülfa Neal florür veya PMSF ile taze olarak desteklenmiş 500 mikrolitre homojenize tamponda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonu, daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Buzdaki hücreleri yaklaşık bir saat buzda çözün.Daha sonra toplam bir mililitre hacme ulaşmak için hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresine buz gibi 0,5 milimetre çapında silika boncukları ekleyin. Hücreleri kırmak için, hücre süspansiyonu bir dakika boyunca maksimum sallama şiddetinde, altı döngü boyunca, her döngüyü takip eden buz üzerinde üç dakikalık bir soğutma süresi ile girdap. Girdaplamadan sonra, ısıtmalı neşter bıçağı ile tüpün dibinde ince bir delik açın ve kırık hücre homojenliğini 10 saniye boyunca düşük hızlı dönüş ile başka bir buz gibi 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne toplayın.Toplanan hücre homojenliğini 5,156 kez G'de 4 santigrat derecede beş dakika boyunca hücre kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin. 450 mikrolitre süpernatantı buz gibi 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bir milimolar taze PMSF ile desteklenmiş bir mililitre buz soğuk homojenizatif tampon ekleyin. Plazma membranlarını toplamak için hücre süspansiyonu 17, 968 kez G'de dört santigrat derecede bir saat boyunca santrifüj.Süpernatantı çıkarın ve bir milimolar PMSF ile taze olarak desteklenmiş 100 mikrolitre homojenizatif tampon ekleyin. Daha sonra 100 mikroliter pipet ucu ile karıştırarak plazma membran peletini gevşetin ve pipetleme tekrarlayarak peletin tekrar tekrar askıya alın. Plazma membran preparatının protein konsantrasyonunu, azaltıcı madde ve deterjan içeren tamponlarla uyumlu bir protein test kiti ile ölçün.Plazma zarlarını eksi 80 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun. Birleştirilmiş jel aparatına üstten iki santimetreye kadar dört ila beş mililitre ayırma jeli dökün. Üzerine bir ila iki mililitre %0,1 SDS'yi dikkatlice katlayın ve poli akrilamid jelin oda sıcaklığında 60 dakika ayarlamasına izin verin.Bir saat sonra% 0.1 SDS tabakasını polimerize ayırma jelinden çıkarın ve SDS izlerini gidermek için jeli çift damıtılmış su ile durulayın. İstifleme jeli karışımını ayırma jelinin üzerine dökün. İstifleme jeline bir tarak yerleştirin ve tarağın etrafındaki hava kabarcıklarını çıkarın.Daha sonra istifleme jelinin oda sıcaklığında 60 dakika ayarlamasına izin verin. Tarağı çıkarın ve jel yuvalarını suyla durulayın. Jeli jel tankına koyun ve jel tankını çalışan tamponla üste doldurun.Beş ila 10 mikrolitre plazma membran numunesini iki kat protein yükleme boyası eşit hacimde karıştırın ve numune karışımını hemen çalışan tampona batırılmış bireysel jel yuvalarına yükleyin. 10 ila 245 Kilodalton aralığındaki protein moleküler ağırlık belirteçlerini ayrı bir yuvaya yükleyerek tek tek protein parçalarının boyut tahminini sağlayın. Mavi yükleme boyası jelin dibine ulaşana kadar 200 voltta jel elektroforezi gerçekleştirin.Jel görüntüleme sistemi ile jel içi GFP floresan için jeli inceleyin. Floresan görüntülemeyi takiben, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca jelin hafif ajitasyonu ile 10 ila 20 mililitre protein jel sabitleme çözeltisinde proteinleri sabitleyin. Daha sonra iki kez 10 mililitre çift damıtılmış su ile 10 dakika durulayın ve protein bantlarını görselleştirmek için oda sıcaklığında bir saat hafifçe sallanarak jeli 10 mililitre kolloidal Kumasi leke çözeltisine yerleştirin.Protein bantlarının daha iyi görselleştirilmesi için, jel görüntüleme sistemiyle görüntü kaydetmeden önce bir saat boyunca 20 mililitre çift damıtılmış suda jeli bir veya iki kez lekeden arındırın. Pozitif kontrol plazmid PS2 ile Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta'nın yüksek bir dönüşüm sıklığı elde edildi. Negatif kontrol için Eurocell Prototron transformantları elde edildi.CSM eksi URA plakalarında üç gün boyunca dönüştürülmüş AD Delta delta hücrelerinin inkübasyonundan sonra yaklaşık 50 URA hücre prototroph CDR1-mGFPHis transformant elde edildi. YPG agar plakalarında yetişemeyen minyon transformant ortadan kaldırıldı. Cdr1-mGHPHis örnekleri çeşitli konsantrasyonlarda jel floresan ile ölçülmektedir.mGFP floresan yoğunlukları, minimum arka plan floresan ile tüm konsantrasyon aralığında doğrusaldı. Hücre yoğunluğunun değişmesi, 40 ODU hücrenin kırılmasının en yüksek CDR1 ATPase aktivitesi ile en yüksek kalitede plazma zarı sağladığını gösterdi. Bununla birlikte, plazma zarlarının verimi artan hücre yoğunlukları ile orantılı olarak artmıştır.Çeşitli özelliklere sahip 31 deterjanın AD Delta Deltası'nın ham plazma membranlarından CDR1-mGHPHis'leri yatıştırma yeteneği, CDR1-mGHPHis hücreleri SDS sayfası ile test edildi. Beta ve alfa DDM Ve Fos-choline 13, CDR1-mGHPHis'i yatıştırmak için en iyi deterjanlardı. Bununla birlikte, Fos-choline 13 CDR1-mGHPHis'in kısmi hidrolizine neden olur.%1 deterjanla çözünen ham plazma membran proteini, altı artmış 10.300 GL boyutu dışlama sütunu kullanılarak ayrıldı. Maltosides ve LMNG çıkarılan proteinlerin kromatogramları, çoğu CDR1-mGHPHis'in 15,5 milimetre CDR1-mGHPHis'te güzel şekilli bir Gauss zirvesi olarak kaçtığını gösterdi. DDM için daha yüksek tepeler, DMN G çözünür CDR1-mGHPHis'in büyük bir kısmının denatüre olabileceğini gösterdi.Zwitterionic Fos-cholines için FSCC kromatogramlarında ve sadece Digitonin'e iki iyonik olmayan deterjan ve DDM'ye benzer bir kromatogram verdi. Fos-choline 13 simetrik keskin şekilli bir tepe verdi, ancak DDM'den önemli ölçüde daha düşük bir elution hacmi ile ima etti. Optimize edilmiş çift etiket ayrıca saflaştırma verimini artırır ve membran proteinlerinin lokalizasyonu, ticareti ve termal stabilitesinin belirlenmesine yardımcı oldu.Heterolog ifade teknolojisi, yüksek verimli ilaç taramasında ve diğer birçok membran proteininin ayrıntılı karakterizasyonunda da kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Probiyotik Fermente Gıdaların küçük ölçekli imalat için yeni Üretim Protokolü

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Candida albicans'ta Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Etkileşimlerinin Genom Çapında Profillenmesi: Kapsamlı Bir CUT&amp;RUN Yöntemi ve Veri Analizi İş Akışı

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...