Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم. نشكر شارلوت إيما بامبرجر لمساعدتها في الحصول على صور apotome.

لتحليل النمو الجنيني والنضج ، تم استخدام أقراص الأبقار. لتقييم انحطاط ال IVD، تم تحليل العينات البشرية.
تم الحصول على أنسجة IVD البشرية من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لانحطاط القرص القطني ، أو التدلي القرصي ، أو صدمة العمود الفقري في قسم جراحة العظام ، والمستشفى الجامعي ...

<ol>
	<li>Urban, J. P. G., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertebral+disc.">Degeneration of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).</li><li>Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+evaluation+of+osteoarthritis.">Radiographic evaluation of osteoarthritis.</a> Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).</li><li>Pye, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+disc+degeneration:+association+between+osteophytes,+end-plate+sclerosis+and+disc+space+narrowing.">Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).</li><li>Humzah, M. D., Soames, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intervertebral+disc:+structure+and+function.">Human intervertebral disc: structure and function.</a> The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organization+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Tschaikowsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof-of-concept+for+the+detection+of+early+osteoarthritis+pathology+by+clinically+applicable+endomicroscopy+and+quantitative+AI-supported+optical+biopsy.">Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).</li><li>Ciapetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+observation+of+human+intervertebral+disc+tissue+and+cells+isolated+from+degenerated+intervertebral+discs.">Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).</li><li>Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation.">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li><li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics.">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li><li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vivo+measurements+of+pressures+in+the+intervertebral+disc+in+daily+life.">New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life.</a> Spine. 24 (8), 755-762 (1999).</li><li>Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+and+limitations+of+using+the+bovine+tail+as+a+model+for+the+human+lumbar+spine.">Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine.</a> Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).</li><li>Hofmann, U. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix.">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li><li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration.">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).</li><li>Habermehl, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).</li><li>Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+of+the+pericellular+matrix+and+spatial+chondrocyte+organization-Two+highly+interconnected+hallmarks+of+osteoarthritis.">Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).</li><li>Bonnaire, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+among+gestation+length+and+health,+production,+and+reproduction+in+Holstein+cows+and+implications+for+their+offspring.">Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring.</a> Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).</li><li>Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Entwicklung+des+schwarzbunten+Niederungsrindes+von+der+Geburt+bis+zum+5.+Lebensjahr+mit+variationsstatistischen+Untersuchungen+einer+Population+solcher+Rinder+von+der+Geburt+bis+zum+3.+Lebensjahr.">Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+intervertebral+disc+injury+leads+to+organ+level+changes+in+structure,+cellularity,+and+biosynthesis.">Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).</li><li>Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury:+implications+for+regenerative+strategies.">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis.">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li><li>Johnson, W. E., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumours+of+my+death+may+have+been+greatly+exaggerated':+a+brief+review+of+cell+death+in+human+intervertebral+disc+disease+and+implications+for+cell+transplantation+therapy.">Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy.</a> Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).</li><li>Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+morphology+in+health+and+disease.">Disc morphology in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).</li><li>Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+clusters+in+intervertebral+disc+degeneration+and+its+relevance+behind+repair.">The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair.</a> Spine Research. 03, 15 (2017).</li><li>Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+cell+clusters+in+pathological+human+intervertebral+discs+are+associated+with+increased+stress+protein+immunostaining.">Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).</li><li>Freemont, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+cells+in+intervertebral+disc+development+and+degeneration.">Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration.</a> Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).</li></ol>

باستخدام المجهر الفلوري المعزز بتصوير الفسيفساء والقسم البصري ، قمنا بتقييم الترتيب المكاني للخلايا الشوندرية في أنولوس IVD القطني طوال التطوير والنضج والانحطاط. في حين يمكن حصاد الأنسجة التنكسية من المرضى الذين يتلقون جراحة العمود الفقري لانحطاط القرص ، وتحليل الفترة الجنينية ومرحلة ا?...

القرص الفقري (IVD) هو بنية تعتمد على الغضاريف التي كيميائيا بيولوجيا وفيما يتعلق العمارة الخلوية، للوهلة الأولى، يشبه في نواح كثيرة الغضاريف المفصلية1. في الواقع، يتميز كل من انحطاط IVD وهشاشة العظام (OA) من الغضاريف المفصلية بضيق المساحة المشتركة بسبب ارتداء الغضاريف، والكيس تحت الوخزات وتشكيل هشاشة العظام، والتصلب تحت الوخز2،3. على الرغم من هذه التشابهات الظاهرية تختلف العمارة والدور الوظيفي لكلا النسيجين. في حين تتكون مصفوفة الغضروف المفصلي بشكل رئيسي من شبكة الكولاجين من النوع الثاني المكونة للممرات ، يتكون IVD من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة: يأخذ اللبوس النواة الغني بالكولاجين من النوع الثاني في المركز الأحمال المحورية وينقلها إلى حلقة شاملة من ألياف الكولاجين الدائرية المعبأة بكثافة I والتي تسمى ليفية أنولوس. وظيفتها هي امتصاص الضغوط المحورية المترجمة التي تتلقاها النواة الغنية بالبروتيوغليكان والمياه مع قوة الألياف الطولية الشدية. في أعلى وأسفل كل نواة و anulus لوحة نهاية كارتيلاجينوس الهيالين يشكل تقاطع الفقرات المجاورة4 (الشكل 1).
في الغضاريف المفصلية، يمكن العثور على أربعة أنماط مميزة chondrocyte المكانية: أزواج، سلاسل، سلاسل مزدوجة، مجموعات صغيرة كبيرة على التوالي5،6،7 ( الشكل2). وترتبط التغيرات في هذا النمط مع بداية الزراعة العضوية والتقدم8،9. chondrocyte المكانية المنظمة هي أيضا مؤشرا على خاصية وظيفية مباشرة من الغضاريف، وهي صلابة لها، مما يؤكد على الصلة الوظيفية لهذا النهج الدرجات القائمة على الصورة10،11. ويمكن بالإضافة إلى ذلك تحديد هذه الأنماط مع التكنولوجيا المتاحة سريريا بالفعل12. نظرا لأوجه التشابه بين IVD والغضاريف المفصلية ، يمكن افتراض أن أنماط chondrocyte المميزة موجودة أيضا في IVD. تشكيل الكتلة هي ظاهرة لوحظت أيضا في IVD المنحطة13،14.
عند محاولة تحليل تنظيم الخلوية المكانية في IVD، فمن الضروري للتغلب على العديد من الصعوبات التقنية التي ليست موجودة عند التحقيق غضروف المفصلي:
أولا، معالجة الأنسجة نفسها هي أكثر تحديا بكثير مما كانت عليه مع الغضروف الهيالين متجانسة التي تتكون إلى حد كبير من نوع الكولاجين الثاني. مكون الألياف الرئيسي في IVD هو الكولاجين من النوع الأول ، مما يجعل من الصعب توليد أقسام نسيجية رقيقة. بينما في الغضروف المفصلي الهيالين حتى أقسام سميكة يمكن تحليلها بسهولة بسبب طبيعة "الزجاج مثل" من الأنسجة، والكولاجين نوع الأول شبكة IVD لا يمكن اختراقها بصريا للغاية. لهذا السبب ، فإن الضوضاء الخلفية القوية هي مشكلة شائعة في علم الأنسجة في IVD. طريقة سريعة ورخيصة لاختراق هذا النسيج الكثيف بصريا هو استخدام جهاز تقسيم بصري على سبيل المثال ، عن طريق Apotome. في مثل هذا Apotome ، يتم إدخال شبكة في مسار الإضاءة لمجهر مضان تقليدي. أمام الشبكة يتم وضع لوحة زجاجية موازية للطائرة. هذا يميل ذهابا وإيابا وبالتالي إسقاط الشبكة في الصورة في ثلاثة مواقف مختلفة. لكل موقع z، يتم إنشاء ثلاث صور أولية مع الشبكة المتوقعة وفرضها. عن طريق برامج خاصة ، يمكن حساب الضوء خارج التركيز. والمبدأ الأساسي هو أنه إذا كانت الشبكة مرئية، فإن تلك المعلومات هي في بؤرة التركيز، إن لم يكن تعتبر بعيدة عن التركيز. مع هذه التقنية ، يمكن الحصول على صور مركزة بشكل جيد وعالية الدقة في فترة زمنية معقولة.
ثانيا، من الصعب اتى النسيج من المتبرعين البشريين. عند القيام باستبدال الركبة بالكامل، يمكن الحصول على كامل سطح المفصل لإجراء مزيد من التحليل أثناء الجراحة. على الرغم من هشاشة العظام من المفصل ثنائي المفاصل هو أيضا مرض في المفصل كله, ومع ذلك هناك اختلافات قوية في التنسيق نوعية الغضروف مع عادة بعض المناطق من المفصل لا تزال سليمة, على سبيل المثال بسبب انخفاض التحميل في تلك المنطقة. يختلف هذا الوضع في IVD ، حيث يتم إجراء الجراحة عادة فقط عندما يتم تدمير القرص عالميا. عند الحصول على الأنسجة من المتبرعين البشريين من غرفة العمليات ، يكون النسيج مجزأ للغاية أيضا ، ومن الضروري تخصيص الأنسجة بشكل صحيح لأحد أنواع الغضاريف الثلاثة لل IVD قبل إجراء المزيد من التحليلات. ولذلك، فإن السماح بإجراء تحليلات أكثر تفصيلا لأقسام الأنسجة الأكبر حجما والنظر في التطور الجنيني لل IVD هو أمر ضروري.
عند اختيار مثل هذا الكائن النموذجي من المهم أن يكون هناك نظام قابل للمقارنة مع القرص البشري فيما يتعلق بتشريحه وأبعاده ، وتحميله الميكانيكي ، وعدد الخلايا الحالية وكذلك تكوين الأنسجة. لغرض التقنية المعروضة هنا نقترح استخدام الأنسجة القطنية البقرية: خاصية حاسمة من القرص البشري مما أدى إلى إمكاناته التجديدية المنخفضة هو فقدان الخلايا نوتوشوردال أثناء النضج في النواة. ومع ذلك، في العديد من الكائنات الحية نموذج notochordal الخلايا يمكن الكشف عن حياتهم كلها لفترة طويلة. معظم الحيوانات القليلة التي تفقد خلاياها نوتوشوردال مثل الأغنام والماعز أو الأسماك chondrodystrophig لديها IVD التي هي أصغر بكثير من الأقراص البشرية. فقط أقراص البقر القطنية موجودة بقطر قرص برجي مماثل أقطار IVDsالبشرية 15.
أحد العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى انحطاط القرص المبكر هو التحميل الميكانيكي المفرط. الضغوط داخل الفصالة من بقرة واقفة في العمود الفقري القطني حوالي 0.8 MPa مع العمود الفقري محاذاة أفقيا. من المستغرب أن هذه الضغوط مماثلة للضغوط القطنية داخل الشعب المبلغ عنها للعمود الفقري البشري المنتصب (0.5 MPa)15،16. أيضا كمية المياه والبروتيوغليكان في أقراص البقر مماثلة لتلك التي من IVD من البشر الشباب17. لذلك ، على الرغم من أن نمط الحركة الفعلي لشرائح الحركة قد يختلف في الحيوانات الرباعية عن الإنسان ثنائي الساقين ، فيما يتعلق بخصائص التحميل والقرص الكلي ، فإن البقرة أقرب بكثير إلى البيولوجيا البشرية من النماذج الحيوانية الراسخة الأخرى لل IVD مثل الأغنام وال.
في هذا البروتوكول نقدم تقنية كيفية تحليل التغيرات في IVD من وجهة نظر تنظيم chondrocyte المكانية من التطور الجنيني المبكر لإنهاء انحطاط المرحلة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

انحطاط القرص الفقري (IVD) هو السبب الرئيسي لآلام أسفل الظهر ويستلزم درجة عالية من الضعف للأفراد المتضررين. لفك انحطاط القرص وتكون قادرة على تطوير نهج التجديد فهم شامل للبيولوجيا الخلوية لل IVD أمر ضروري. أحد جوانب هذه البيولوجيا التي لا تزال دون إجابة هو مسألة كيفية ترتيب الخلايا مكانيا في حالة فسيولوجية وأثناء الانحطاط. الخصائص البيولوجية لل IVD وتوافرها تجعل من الصعب تحليل هذا النسيج. تبحث هذه الدراسة في تنظيم الخلايا الشوندريوسية المكانية في الورم الليفي الكولوس من التطور الجنيني المبكر إلى انحطاط المرحلة النهائية. يتم تطبيق طريقة الأقسام البصرية (Apotome) لإجراء تحليلات تلطيخ عالية الدقة باستخدام الأنسجة الجنينية البقرية كنموذج حيواني وأنسجة القرص البشري التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري. من كثافة chondrocyte عالية جدا في القرص البقري الجنيني في وقت مبكر، وعدد من الخلايا يقلل خلال الحمل والنمو، والنضج. في الأقراص البشرية ، رافقت زيادة الكثافة الخلوية تطور انحطاط الأنسجة. كما سبق أن ثبت في الغضروف المفصلي، تشكيل الكتلة يمثل سمة مميزة من انحطاط القرص المتقدمة.

باستخدام صور الفسيفساء ، يمكن التعرف بوضوح على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في anulus والنواة الأكثر ليونة(الشكل 4). ويمكن ملاحظة انخفاض مستمر في الكثافة الخلوية أثناء النمو الجنيني (الشكل 5). بينما في المراحل المبكرة من تطوير IVD يمكن العثور على كثافة ...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

نقدم طريقة للتحقيق في تنظيم الخلايا الشوندروسيتية المكانية في الورم الليفي أنولوس للقرص الفقري باستخدام طريقة تقسيم بصري.

المقطع البصري والتصور للقرص الفقري من التطور الجنيني إلى الانحطاط

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

انحطاط القرص الفقري يؤدي إلى درجة عالية من الضعف والألم. بروتوكولنا يسمح لنا بالتحقيق في تطوير القرص المورفولوجي وتغيراته في الانحطاط. تجعل شبكة الكولاجين الكثيفة من النوع الأول من الصعب عادة تحليل القرص الفقري عن طريق المجهر.مع المقطع البصري، يمكننا التحقيق في الترتيب ثلاثي الأبعاد للخلايا الشوندروسيتية داخل الأنسجة المختلفة. تبدأ عن طريق وضع داخل المنطوق الحصول عليها, القرص الفقري أو عينات IVD في DMEM تكملها مع حجم 2٪ من حجم البنسلين-Streptomycin, و 1.2٪ حجم حجم Amphotericin B, بعد جمع فورا, تخزين عينات IVD في أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. إذا تم تجميد إذابة عينات IVD البشرية في درجة حرارة الغرفة وتحديد أصل أنسجة IVD البشرية على أساس الخصائص المجهرية مثل؛ الكثافة الكلية والتوجه.لجمع الأنسجة القرص البقري، واتخاذ الجزء الحركة تتكون من IVD مع فقرتين المجاورة لها واستخدام شفرة الجراحية رقم 15، تشريح القرص البقري كله من العظام تحت الوخز، والوجه القرص للوصول إلى المناطق التي تركزت. بعد تحديد مناطق مختلفة من الغضروف، استخدم شفرة جراحية رقم 20 أو 22 لقطع منطقة الاهتمام من القرص بأكمله. وينبغي معالجة ال IVDs من الأجنة البقرية مع طول التاج الردف أصغر من 20 سنتيمترا دون تشريح.إجراء تشارات النسيج كما هو موضح في المخطوطة. تأكيد الشارات الناجحة، إذا اخترقت إبرة قياس 20 نسيج القرص، أو إذا كان ذلك ممكنا فقرات دون مقاومة ملحوظة. بالضبط عينات الأنسجة في حجم عشرة أضعاف من محلول الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، ضع الأنسجة في وسط تضمين قابل للذوبان في الماء على مقبض Cryotome، بحيث يتم توليد إما طائرة محورية أو طائرة تقطع عموديا نوع الكولاجين الذي يتم إنشاؤه عادة. استخدم الكريوتومي القياسي لقسم الأنسجة المضمنة بسماكة 70 ميكرومتر في عينات بشرية و40 ميكرومتر في عينات الأبقار. جمع المقاطع على شريحة زجاجية قبل الشطف المقاطع ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، إضافة صبغة الفلورسنت مناسبة تليها المتوسطة المتصاعدة وتغطية المقاطع مع زلة غطاء.ضع شريحة مع قسم أنسجة وصمة عار على حامل العينة من المجهر فلوريسكنس عن طريق بدء جهاز الإضاءة هيكل أداء مجال واحد من التصوير عرض مع مرشحات الفلورسنت والإضاءة الكافية. باستخدام برنامج تحسين الصورة المتوافق مع المجهر فلوريسينس، معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع. لتصور المقطع ككل استخدم تقنية تصوير الفسيفساء عن طريق فتح إعدادات الاستحواذ 60 من لوحة شريط الأدوات وضبط إعدادات الفسيفساء في سجل الفسيفساء.للقيام بذلك تحديد عدد الأعمدة والصفوف من حقل صور العرض التي يجب دمجها في وقت لاحق في صورة نظرة عامة واحدة، اضغط الإعداد وضبط تصحيح التركيز من البلاط الفردية. بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع. لتحليل المنظمة chondrocyte المكانية استخدام وظيفة 3D أدرجت في البرنامج عن طريق ضبط إعدادات Z-المكدس مع زر البدء / التوقف، وتحديد المعلمات المسح الضوئي مثل البداية ووقف المواقف في محور Z والمسافة شريحة.تحديد أنماط الخلوية الفردية واستخدام البرنامج المساعد عدد الخلايا للتحليل الكمي للأنماط الخلوية، وحساب كثافة الخلية عن طريق تقسيم الخلايا العد حسب حجم المنطقة المختارة من الفائدة. يمكن التعرف على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في أنولوس والنواة الأكثر ليونة في صور الفسيفساء التي التقطت في الطائرة المحورية والمترهلة. في المناطق المكبرة من صور الفسيفساء ، لوحظت أنماط تنظيمية مكانية مختلفة من الخلايا الشوندروية مثل ؛ خلايا واحدة وأزواج وسلاسل.أظهرت دراسة مراحل النمو والنضج المختلفة للتليف الأبقار أنولوس انخفاضا مستمرا في الكثافة الخلوية أثناء تطور القرص الجنيني. من ناحية أخرى لوحظت كثافة خلوية متزايدة وتشكيل الكتلة في القرص البشري البالغ أثناء الانحطاط. انخفضت كثافة الخلية في المراحل المبكرة من تطور IVD في تليف أنولوس البقري ونواة البقر اللب بسرعة حتى الولادة.من خلال تصوير القناة من IVD مع Epitome سمح التصور للهندسة المعمارية 3D من الأنماط المكانية مثل السيتوبلازم والنواة، في IVD واحد سليمة، فضلا عن أزواج من chondrocytes رصدت. في حين تم العثور على مجموعات خلايا أنولوس المنحطة. الجزء الأكثر تحديا هو تخصيص الأنسجة لأصلها وتصحيح جزءا لا يتجزأ من أجل تقسيم.وهذا أمر ضروري للحصول على نتائج موثوقة. بعد تشريح واختيار أنسجة IVD بشكل صحيح من مراحل وأصول مختلفة يسمح لنا بتعميق التحليل من خلال مزيد من التحليل الكيميائي الحيوي والميكانيائي الحيوي ، مثل ELISA أو المجهر القوة الذرية.

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...