Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Vi takker vores medforfattere fra de oprindelige publikationer for deres hjælp og støtte. Vi takker Charlotte Emma Bamberger for at hjælpe med at erhverve apotom billeder.

Til analyse af embryonal udvikling og modning blev der anvendt kvægskiver. For at evaluere degeneration af IVD blev humane prøver analyseret.
Human IVD væv blev fremstillet af patienter, der gennemgår kirurgi for lændeskive degeneration, disk prolaps, eller spinal traumer i Institut for Ortopædkirurgi, Universitetshospitalet i Tübingen og BG Trauma Center Tübingen. Der blev opnået fuld etisk udvalgsgodkendelse inden undersøgelsens påbegyndelse (projektnummer 244/2013BO2). Skriftligt...

<ol>
	<li>Urban, J. P. G., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertebral+disc.">Degeneration of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).</li><li>Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+evaluation+of+osteoarthritis.">Radiographic evaluation of osteoarthritis.</a> Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).</li><li>Pye, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+disc+degeneration:+association+between+osteophytes,+end-plate+sclerosis+and+disc+space+narrowing.">Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).</li><li>Humzah, M. D., Soames, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intervertebral+disc:+structure+and+function.">Human intervertebral disc: structure and function.</a> The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organization+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Tschaikowsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof-of-concept+for+the+detection+of+early+osteoarthritis+pathology+by+clinically+applicable+endomicroscopy+and+quantitative+AI-supported+optical+biopsy.">Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).</li><li>Ciapetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+observation+of+human+intervertebral+disc+tissue+and+cells+isolated+from+degenerated+intervertebral+discs.">Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).</li><li>Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation.">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li><li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics.">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li><li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vivo+measurements+of+pressures+in+the+intervertebral+disc+in+daily+life.">New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life.</a> Spine. 24 (8), 755-762 (1999).</li><li>Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+and+limitations+of+using+the+bovine+tail+as+a+model+for+the+human+lumbar+spine.">Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine.</a> Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).</li><li>Hofmann, U. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix.">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li><li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration.">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).</li><li>Habermehl, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).</li><li>Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+of+the+pericellular+matrix+and+spatial+chondrocyte+organization-Two+highly+interconnected+hallmarks+of+osteoarthritis.">Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).</li><li>Bonnaire, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+among+gestation+length+and+health,+production,+and+reproduction+in+Holstein+cows+and+implications+for+their+offspring.">Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring.</a> Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).</li><li>Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Entwicklung+des+schwarzbunten+Niederungsrindes+von+der+Geburt+bis+zum+5.+Lebensjahr+mit+variationsstatistischen+Untersuchungen+einer+Population+solcher+Rinder+von+der+Geburt+bis+zum+3.+Lebensjahr.">Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+intervertebral+disc+injury+leads+to+organ+level+changes+in+structure,+cellularity,+and+biosynthesis.">Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).</li><li>Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury:+implications+for+regenerative+strategies.">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis.">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li><li>Johnson, W. E., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumours+of+my+death+may+have+been+greatly+exaggerated':+a+brief+review+of+cell+death+in+human+intervertebral+disc+disease+and+implications+for+cell+transplantation+therapy.">Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy.</a> Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).</li><li>Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+morphology+in+health+and+disease.">Disc morphology in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).</li><li>Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+clusters+in+intervertebral+disc+degeneration+and+its+relevance+behind+repair.">The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair.</a> Spine Research. 03, 15 (2017).</li><li>Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+cell+clusters+in+pathological+human+intervertebral+discs+are+associated+with+increased+stress+protein+immunostaining.">Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).</li><li>Freemont, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+cells+in+intervertebral+disc+development+and+degeneration.">Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration.</a> Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).</li></ol>

Ved hjælp af fluorescensmikroskopi forstærket af mosaikbilleddannelse og optisk sektion evaluerede vi det rumlige arrangement af chondrocytter i anulus af lænde IVD gennem udvikling, modning og degeneration. Mens degenerativt væv kunne høstes fra patienter, der fik rygsøjlen kirurgi for diskdegeneration, analyse af den embryonale periode og modning fase krævede brug af en model organisme (kvæg). Høje cellulære tætheder blev noteret i anulus under tidlig embryonal udvikling. I det videre udviklingsforløb kunne...

Den intervertebrale disk (IVD) er en bruskbaseret struktur, der biokemisk og med hensyn til cellulær arkitektur ved første øjekast ligner på mange måder ledbrusk1. Faktisk er både IVD degeneration og slidgigt (OA) af ledbrusk karakteriseret ved ledplads indsnævring på grund af brusk slid, subchondral cyste og slidgigt dannelse, og subchondral sklerose2,3. På trods af disse tilsyneladende ligheder arkitektur og funktionelle rolle begge væv er forskellige. Mens matrixen af ledbrusk hovedsageligt er dannet af et arkadedannende kollagen type II-netværk, består IVD af tre forskellige typer væv: kollagentypen II-rig kerne pulposus i midten optager aksial belastninger og overfører dem til en omfattende ring af tætpakkede cirkulære kollagen type I fibre, der kaldes anulus fibrøse. Deres funktion er at absorbere de oversatte aksiale tryk modtaget af proteoglycan- og vandrige kerne med deres trækstyrke langsgående fiber. Øverst og nederst i hver kerne og anulus danner en hyaline brusk endplate krydset til de tilstødende hvirvler4 (Figur 1).
I ledbrusk kan man finde fire forskellige rumlige chondrocytmønstre: par, strenge, dobbeltstrenge, små henholdsvis store klynger5,6,7 ( Figur2). Ændringer i dette mønster er forbundet med OA debut og progression8,9. Spatial chondrocyt organisation er også vejledende for en direkte funktionel egenskab brusk, nemlig dens stivhed, understreger den funktionelle relevans af denne billedbaserede klassificering tilgang10,11. Disse mønstre kan desuden identificeres med allerede eksisterende klinisk tilgængelig teknologi12. På grund af lighederne mellem IVD og ledbrusk, kan det være en hypotese, at karakteristiske chondrocyt mønstre er også til stede i IVD. Klyngedannelse er et fænomen , der også observeres i den degenererede IVD13,14.
Når man forsøger at analysere rumlige cellulære organisation i IVD, er det nødvendigt at overvinde flere tekniske vanskeligheder, der ikke er til stede, når man undersøger ledbrusk:
For det første er behandlingen af selve vævet langt mere udfordrende end med den homogene hyaline brusk, som i vid udstrækning består af kollagen type II. IVD's vigtigste fiber komponent er kollagen type I, hvilket gør det meget vanskeligere at generere tynde histologiske sektioner. Mens der i hyaline ledbrusk selv tykke sektioner let kan analyseres på grund af den "glas-lignende" karakter af vævet, kollagen type I netværk af IVD er optisk meget uigennemtrængelig. Af denne grund er en stærk baggrundsstøj et almindeligt problem i ivd'ens histologi. En hurtig og billig måde at trænge ind i dette optisk tætte væv er brugen af en optisk sektionsanordning, f.eks. ved hjælp af et Apotom. I et sådant Apotom indsættes et gitter i belysningsvejen af et konventionelt fluorescensmikroskop. Foran gitteret placeres en plan-parallel glasplade. Dette vipper frem og tilbage og projicerer dermed gitteret i billedet i tre forskellige positioner. For hver z-position oprettes og overlejres tre rå billeder med det projicerede gitter. Ved hjælp af speciel software kan det ude af fokus lys beregnes ud. Det grundlæggende princip er, at hvis gitteret er synligt, er disse oplysninger i fokus, hvis ikke de anses for at være ude af fokus. Med denne teknik kan godt fokuserede og højopløselige billeder erhverves på en rimelig tid.
For det andet er vævet svært at komme med fra menneskelige donorer. Når du gør total knæ udskiftning, hele overfladen af leddet kan opnås til yderligere analyse under operationen. Selv om slidgigt af en diarthrodial led er også en sygdom i hele leddet, der er ikke desto mindre stærke fokusforskelle i kvaliteten af brusk med normalt nogle områder af leddet stadig er intakt, for eksempel på grund af reduceret belastning i dette område. Denne situation er anderledes i IVD, hvor kirurgi normalt kun udføres, når disken er globalt ødelagt. Ved opnåelse af væv fra menneskelige donorer fra operationsstuen er vævet også meget fragmenteret, og det er nødvendigt at tildele vævet korrekt til en af de tre brusktyper af IVD, før du foretager yderligere analyser. For at muliggøre mere detaljerede analyser af også større vævssektioner og undersøge ivd'ens embryonale udvikling er valget af en dyremodelorganisme derfor nødvendigt.
Når man vælger en sådan modelorganisme, er det vigtigt at have et system, der kan sammenlignes med den menneskelige disk med hensyn til dens anatomi og dimensioner, dens mekaniske belastning, den nuværende cellepopulation samt dens vævssammensætning. Med henblik på den præsenterede teknik her foreslår vi brugen af kvæg lændeskivevæv: En kritisk egenskab ved den menneskelige disk, der resulterer i dens lave regenerative potentiale, er tabet af ikke-okochordale celler under modning i kernen. Men i mange modelorganismer kan ikke-uvise celler detekteres hele deres levetid. De fleste af de få dyr, der mister deres ikke-okktale celler såsom får, geder eller chondrodystrophig hunde har en IVD, der er meget mindre end menneskelige diske. Kun lændekvægskiver, der er til stede med en sammenlignelig sagittal skivediameter end dem, der er af humane IVD'er15.
En nøglefaktor, der fører til tidlig diskdegeneration, er overdreven mekanisk belastning. De intradiscale tryk af en stående ko i lændehvirvelsøjlen er omkring 0,8 MPa med rygsøjlen justeret vandret. Overraskende disse tryk kan sammenlignes med lænde intradiscalt tryk rapporteret for oprejst menneskelige rygsøjlen (0,5 MPa)15,16. Også mængden af vand og proteoglycaner i kvægskiver kan sammenlignes med mængden af IVD fra unge mennesker17. Selv om bevægelsessegmenternes faktiske bevægelsesmønster kan variere i firdobbelt dyr fra det tobenet menneske med hensyn til den samlede belastnings- og diskegenskaber, er koen derfor meget tættere på menneskelig biologi end andre etablerede dyremodeller for IVD såsom får og hunde.
I denne protokol præsenterer vi en teknik, hvordan man analyserer ændringer i IVD fra synspunktet om rumlig chondrocyt organisation fra tidlig embryonal udvikling til slutstadiet degeneration.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

Intervertebraral disc (IVD) degeneration er en førende årsag til lændesmerter, og det indebærer en høj grad af svækkelse for de berørte personer. At afkode diskdegeneration og være i stand til at udvikle regenerative tilgange en grundig forståelse af den cellulære biologi IVD er afgørende. Et aspekt af denne biologi, der stadig er ubesvaret, er spørgsmålet om, hvordan celler er rumligt arrangeret i en fysiologisk tilstand og under degeneration. De biologiske egenskaber af IVD og dets tilgængelighed gør dette væv vanskeligt at analysere. Den foreliggende undersøgelse undersøger rumlig chondrocyt organisation i anulus fibrøst fra tidlig embryonal udvikling til slutstadiet degeneration. En optisk sektionsmetode (Apotom) anvendes til at udføre farvningsanalyser med høj opløsning ved hjælp af embryonalt væv fra kvæg som dyremodel og humant diskvæv fremstillet af patienter, der gennemgår rygoperation. Fra en meget høj chondrocyttæthed i den tidlige embryonale kvægskive falder antallet af celler under svangerskab, vækst og modning. I menneskelige diske, en stigning i cellulære tæthed ledsaget progression af væv degeneration. Som det allerede var blevet påvist i ledbrusk, udgør klyngedannelse et karakteristisk træk ved avanceret diskdegeneration.

Ved hjælp af mosaikbilleder kan IVD's arkitektur med sit tætte kollagenfibernetværk i anulus og den blødere kerne klart genkendes (Figur 4). Et kontinuerligt fald i celletætheden kan observeres under embryonal udvikling (Figur 5). Mens der i de tidlige stadier af IVD udvikling en celletæthed på 11.435 celler / mm² i kvæg anulus fibrøst og 17.426 celler / mm² i kvægkerne prædikestolen kan findes, disse tal falder hurtigt til 1.011 celler / mm² (kvæ...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Vi præsenterer en metode til at undersøge rumlig chondrocyt organisation i anulus fibrosus af den intervertebrale disk ved hjælp af en optisk sektionsmetode.

Optisk sektion og visualisering af den intervertebrale disk fra embryonisk udvikling til degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

Intervertebraral disc degeneration fører til en høj grad af svækkelse og smerte. Vores protokol giver os mulighed for at undersøge morfologisk diskudvikling og dens ændringer i degeneration. Den tætte kollagen type et netværk gør det normalt vanskeligt at analysere intervertebrale disc ved mikroskopi.Med optisk sektion kan vi undersøge 3D-arrangementet af chondrocytter i de forskellige væv. Begynd med at placere intraoperativt opnåede intervertebral disc eller IVD prøver i DMEM suppleret med 2% volumen i volumen Penicillin-Streptomycin, og 1,2% volumen i volumen Amphotericin B, umiddelbart efter indsamling, gemme IVD prøver på fire grader Celsius indtil videre behandling. Hvis frosne optø de menneskelige IVD prøver ved stuetemperatur og identificere oprindelsen af det menneskelige IVD væv baseret på mikroskopiske egenskaber såsom;college tæthed og orientering.For at indsamle kvægskivens væv skal du tage bevægelsessegmentet bestående af IVD med sine to tilstødende hvirvler og ved hjælp af et kirurgisk klingenummer 15, dissekere hele kvægskiven fra subchondralbenet, vende disken for at nå de centrerede områder. Efter at have identificeret de forskellige områder af brusk, skal du bruge et kirurgisk klinge nummer 20 eller 22 til at skære det interesseområde ud af hele disken. IVD'erne fra kvægfostre med en krone-rumpelængde mindre end 20 centimeter skal behandles uden dissektion.Udført afkalkning af vævet som beskrevet i manuskriptet. Bekræft vellykket afkalkning, hvis en 20 gauge nål trænger ind i skivevævet, eller hvis det er relevant ryghvirvlerne uden bemærkelsesværdig modstand. Nøjagtig vævsprøverne i det tidobbelte volumen af 4% formaldehydopløsning i PBS natten over ved fire grader Celsius.Den næste dag skal vævet placeres i et vandopløseligt indlejringsmedium på cryotomeknappen, således at enten et aksialt plan eller et plan, der vinkelrette skærer kollagentypen, normalt genereres. Brug standard cryotome til at dele det indlejrede væv med en tykkelse på 70 mikrometer i humanprøver og 40 mikrometer i kvægprøver. Saml sektionerne på en glasrutschebane, før sektionerne skylles tre gange med PBS, tilsæt et passende fluorescerende farvestof efterfulgt af monteringsmediet og dæk sektionerne med et dækselstræk.Placer et dias med en pletvæv sektion på prøven indehaveren af blomsterscens mikroskop ved at starte strukturen belysning enhed udføre enkelt synsfelt billeddannelse med fluorescerende filtre og tilstrækkelig belysning. Brug en billedoptimeringssoftware, der er kompatibel med florescensmikroskopet, skal du behandle billederne ved at optimere intensiteten og lysstyrken. For at visualisere afsnittet som helhed skal du bruge mosaikbilledteknikken ved at åbne de 60 anskaffelsesindstillinger fra værktøjslinjepanelet og justere mosaikindstillingerne i mosaikregistret.For at gøre dette definere antallet af kolonner og rækker af synsfeltbilleder, der senere skal flettes ind i ét oversigtsbillede, skal du trykke på opsætningen og justere fokuskorrektionen af de enkelte felter. Efter-proces billederne ved at optimere intensiteten og lysstyrken. Hvis du vil analysere den rumlige chondrocyt-organisation, skal du bruge den 3d-funktion, der er indbygget i softwaren, ved at justere Z-stack-indstillingerne med start-/stop-knappen ved at definere scanningsparametrene som start- og stoppositionerne i Z-aksen og udsnitsafstanden.Identificer individuelle cellemønstre og brug et celletællings-plugin til kvantitativ analyse af cellemønstrene, beregn celletætheden ved at dividere de optalte celler med størrelsen af det valgte interesseområde. Arkitekturen af IVD med sin tætte kollagen fiber netværk i annulus og blødere kerne kan genkendes i mosaik billeder taget i den aksiale og sagittal plan. I forstørrede områder fra mosaikbillederne blev der bemærket forskellige rumlige organisatoriske mønstre af chondrocytter som;enkelte celler, par og strenge.Undersøgelsen af forskellige udviklings- og modningsfaser af kvæg annulus fibrose viste et kontinuerligt fald i celletætheden under embryonal diskudvikling. På den anden side blev der observeret en stigende cellulær tæthed og klyngedannelse i den voksne menneskelige disk under degeneration. Celletætheden i de tidlige stadier af IVD-udviklingen i kvæg annulusfibrose og kvægkernemassen faldt hurtigt indtil fødslen.Ved kanalbilleddannelse af IVD med indbegrebet tilladt visualisering af 3D-arkitekturen af de rumlige mønstre som cytoplasma og kernen, i den intakte IVD enkelt samt par chondrocytter blev spottet. Der blev fundet anuluscelleklynger i degenererede anulusceller. Den mest udfordrende del er at allokere vævet til dets oprindelse og at korrigere indlejret til indsnitning.Dette er afgørende for at opnå pålidelige resultater. Efter korrekt dissekeret og udvalgt IVD-væv fra forskellige stadier og oprindelse giver os mulighed for at uddybe analysen ved yderligere biokemisk og biomekanisk analyse, såsom ELISA eller atomprøvesprængningsmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system til<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrkning af embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantater at teste for Cell Fate Commitment under fosterudviklingen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mus embryonale udvikling i et serum-frit Hele Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...