Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien. Nous remercions Charlotte Emma Bamberger d’avoir aidé à acquérir les images d’apotome.

Pour l’analyse du développement et de la maturation embryonnaires, des disques bovins ont été utilisés. Pour évaluer la dégénérescence de l’IDIV, des échantillons humains ont été analysés.
Le tissu DIV humain a été obtenu chez des patients subissant une intervention chirurgicale pour une dégénérescence discale lombaire, un prolapsus discale ou un traumatisme de la colonne vertébrale dans le département de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tübingen...

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K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. 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E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation.">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li><li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics.">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li><li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury:+implications+for+regenerative+strategies.">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis.">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li><li>Johnson, W. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. 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En utilisant la microscopie à fluorescence augmentée par l’imagerie en mosaïque et la section optique, nous avons évalué la disposition spatiale des chondrocytes dans l’anulus du DIV lombaire tout au long du développement, de la maturation et de la dégénérescence. Alors que le tissu dégénératif pouvait être prélevé sur des patients recevant une chirurgie de la colonne vertébrale pour une dégénérescence discale, l’analyse de la période embryonnaire et de la phase de maturation nécessitait l’ut...

Le disque intervertébral (DIV) est une structure à base de cartilage qui, biochimiquement et par rapport à l’architecture cellulaire, à première vue, ressemble à bien des égards au cartilage articulaire1. En effet, la dégénérescence DIV et l’arthrose (OA) du cartilage articulaire sont caractérisées par un rétrécissement de l’espace articulaire dû à l’usure du cartilage, à la formation de kystes sous-chondriques et d’ostéophytes, et à la sclérose sous-chondrale2,3. Malgré ces similitudes apparentes, l’architecture et le rôle fonctionnel des deux tissus diffèrent. Alors que la matrice du cartilage articulaire est principalement formée d’un réseau de collagène de type II formant des arcades, le DIV se compose de trois types de tissus différents: le noyau pulpeux riche en collagène de type II au centre prend des charges axiales et les transmet à un anneau englobant de fibres de collagène circulaires de type I densément emballées appelées anulus fibrosus. Leur fonction est d’absorber les pressions axiales traduites reçues par le noyau riche en protéoglycanes et en eau avec leur résistance à la fibre longitudinale à la traction. En haut et en bas de chaque noyau et anulus, une plaque d’extrémité cartilagineuse hyaline forme la jonction avec les vertèbresadjacentes 4 (Figure 1).
Dans le cartilage articulaire, quatre modèles de chondrocytes spatiaux distincts peuvent être trouvés: paires, cordes, cordes doubles, petits ou grands amas5,6,7 ( Figure2). Les changements dans ce schéma sont associés à l’apparition et à la progression del’arthrose 8,9. L’organisation spatiale des chondrocytes est également révélatrice d’une propriété fonctionnelle directe du cartilage, à savoir sa rigidité, soulignant la pertinence fonctionnelle de cette approche de classement basée sur l’image10,11. Ces modèles peuvent en outre être identifiés avec la technologie cliniquement disponible déjà existante12. En raison des similitudes entre le DIV et le cartilage articulaire, on peut émettre l’hypothèse que des modèles chondrocytes caractéristiques sont également présents dans le DIV. La formation d’amas est un phénomène également observé dans l’IVDdégénérée 13,14.
Lorsque vous essayez d’analyser l’organisation cellulaire spatiale dans le DIV, il est nécessaire de surmonter plusieurs difficultés techniques qui ne sont pas présentes lors de l’étude du cartilage articulaire:
Tout d’abord, le traitement du tissu lui-même est beaucoup plus difficile qu’avec le cartilage hyalin homogène qui est en grande partie composé de collagène de type II. Le principal composant fibreux de l’IVD est le collagène de type I, ce qui rend beaucoup plus difficile la génération de fines sections histologiques. Alors que dans le cartilage articulaire hyalin, même les sections épaisses peuvent facilement être analysées en raison de la nature « vitreuse » du tissu, le réseau de collagène de type I du DIV est optiquement très impénétrable. Pour cette raison, un fort bruit de fond est un problème courant dans l’histologie de l’IVD. Un moyen rapide et peu coûteux de pénétrer dans ce tissu optiquement dense est l’utilisation d’un dispositif de sectionnement optique, par exemple au moyen d’un apotome. Dans un tel Apotome, une grille est insérée dans la voie d’éclairage d’un microscope à fluorescence conventionnel. Devant la grille, une plaque de verre plane-parallèle est placée. Cela s’incline d’avant en arrière, projetant ainsi la grille dans l’image dans trois positions différentes. Pour chaque position z, trois images brutes avec la grille projetée sont créées et superposées. Au moyen d’un logiciel spécial, la lumière floue peut être calculée. Le principe sous-jacent est que, si la grille est visible, cette information est au centre de l’attention, sinon elle est considérée comme floue. Avec cette technique, des images bien focalisées et haute résolution peuvent être acquises dans un délai raisonnable.
Deuxièmement, le tissu est difficile à trouver à partir de donneurs humains. Lors d’une arthroplastie totale du genou, toute la surface de l’articulation peut être obtenue pour une analyse plus approfondie pendant la chirurgie. Bien que l’arthrose d’une articulation diarthroïale soit également une maladie de l’articulation entière, il existe néanmoins de fortes différences focales dans la qualité du cartilage, généralement certaines zones de l’articulation étant encore intactes, par exemple en raison d’une charge réduite dans cette zone. Cette situation est différente dans le DIV, où la chirurgie n’est généralement effectuée que lorsque le disque est globalement détruit. Lors de l’obtention de tissus de donneurs humains dans la salle d’opération, le tissu est également très fragmenté et il est nécessaire d’attribuer correctement le tissu à l’un des trois types de cartilage du DIV avant de procéder à d’autres analyses. Pour permettre des analyses plus détaillées de coupes de tissus également plus grandes et pour examiner le développement embryonnaire de l’IVD, le choix d’un organisme modèle animal est donc nécessaire.
Lors du choix d’un tel organisme modèle, il est important d’avoir un système comparable au disque humain en ce qui concerne son anatomie et ses dimensions, sa charge mécanique, la population cellulaire actuelle ainsi que sa composition tissulaire. Aux fins de la technique présentée ici, nous suggérons l’utilisation de tissu discale lombaire bovin: Une propriété critique du disque humain entraînant son faible potentiel de régénération est la perte de cellules notochordales pendant la maturation dans le noyau. Cependant, dans de nombreux organismes modèles, les cellules notochordales peuvent être détectées toute leur durée de vie. La plupart des rares animaux qui perdent leurs cellules notochordales tels que les moutons, les chèvres ou les chiens chondrodystrophig ont un DIV beaucoup plus petit que les disques humains. Seuls les disques bovins lombaires présents ont un diamètre de disque sagittal comparable à celui des DIV humains15.
Un facteur clé conduisant à la dégénérescence précoce du disque est la charge mécanique excessive. Les pressions intradiscales d’une vache debout dans la colonne lombaire sont d’environ 0,8 MPa avec la colonne vertébrale alignée horizontalement. Étonnamment, ces pressions sont comparables aux pressions intradiscales lombaires rapportées pour la colonne vertébrale humaine en érection (0,5 MPa)15,16. De plus, la quantité d’eau et de protéoglycanes dans les disques bovins est comparable à celle de l’IVD des jeunes humains17. Par conséquent, bien que le schéma de mouvement réel des segments de mouvement puisse différer chez les animaux quadrupèdes de l’humain bipède, en ce qui concerne la charge totale et les caractéristiques du disque, la vache est beaucoup plus proche de la biologie humaine que d’autres modèles animaux établis pour l’IVD tels que les moutons et les chiens.
Dans ce protocole, nous présentons une technique permettant d’analyser les changements dans le DIV du point de vue de l’organisation spatiale des chondrocytes, du développement embryonnaire précoce à la dégénérescence terminale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

La dégénérescence du disque intervertébral (DIV) est l’une des principales causes de lombalgie et entraîne un degré élevé de déficience pour les personnes touchées. Pour décoder la dégénérescence discale et pouvoir développer des approches régénératives, une compréhension approfondie de la biologie cellulaire de l’IVD est essentielle. Un aspect de cette biologie qui reste encore sans réponse est la question de savoir comment les cellules sont disposées spatialement dans un état physiologique et pendant la dégénérescence. Les propriétés biologiques du DIV et sa disponibilité rendent ce tissu difficile à analyser. La présente étude étudie l’organisation spatiale des chondrocytes dans l’anulus fibreux depuis le début du développement embryonnaire jusqu’à la dégénérescence terminale. Une méthode de sectionnement optique (Apotome) est appliquée pour effectuer des analyses de coloration à haute résolution en utilisant du tissu embryonnaire bovin comme modèle animal et du tissu discale humain obtenu à partir de patients subissant une chirurgie de la colonne vertébrale. À partir d’une densité de chondrocytes très élevée dans le disque bovin embryonnaire précoce, le nombre de cellules diminue pendant la gestation, la croissance et la maturation. Dans les disques humains, une augmentation de la densité cellulaire a accompagné la progression de la dégénérescence tissulaire. Comme cela avait déjà été démontré dans le cartilage articulaire, la formation de grappes représente une caractéristique de la dégénérescence discale avancée.

En utilisant des images en mosaïque, l’architecture de l’IVD avec son réseau dense de fibres de collagène dans l’anulus et le noyau plus mou peut être clairement reconnue (Figure 4). Une diminution continue de la densité cellulaire peut être observée au cours du développement embryonnaire (Figure 5). Alors qu’aux premiers stades du développement de l’IDIV, on peut trouver une densité cellulaire de 11 435 cellules/mm² dans l’anulus fibreux ...

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Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Nous présentons une méthode pour étudier l’organisation spatiale des chondrocytes dans l’anulus fibrose du disque intervertébral en utilisant une méthode de sectionnement optique.

Sectionnement optique et visualisation du disque intervertébral du développement embryonnaire à la dégénérescence

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

La dégénérescence du disque intervertébral entraîne un degré élevé de déficience et de douleur. Notre protocole nous permet d’étudier morphologiquement le développement du disque et ses changements dans la dégénérescence. Le réseau dense de collagène de type un rend généralement difficile l’analyse du disque intervertébral par microscopie.Avec la section optique, nous pouvons étudier l’arrangement 3D des chondrocytes dans les différents tissus. Commencez par placer des échantillons de disque intervertébral ou de DIV obtenus par voie peropératoire dans du DMEM complété par 2% volume par volume de pénicilline-streptomycine et 1,2% volume par volume d’amphotéricine B, immédiatement après le prélèvement, stockez les échantillons de DIV à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur. En cas de congélation, décongelez les échantillons de DIV humains à température ambiante et identifiez l’origine du tissu DIV humain en fonction de propriétés microscopiques telles que la densité et l’orientation du collège.Pour recueillir le tissu du disque bovin, prenez le segment de mouvement constitué du DIV avec ses deux vertèbres adjacentes et à l’aide d’une lame chirurgicale numéro 15, disséquez tout le disque bovin de l’os sous-chondral, retournez le disque pour atteindre les zones centrées. Après avoir identifié les différentes zones du cartilage, utilisez une lame chirurgicale numéro 20 ou 22 pour découper la zone d’intérêt de l’ensemble du disque. Les DIV d’embryons de bovins d’une longueur couronne-croupe inférieure à 20 centimètres doivent être traités sans dissection.Réalisation de la décalcification du tissu comme décrit dans le manuscrit. Confirmez la réussite de la décalcification, si une aiguille de calibre 20 pénètre dans le tissu discale ou, le cas échéant, dans les vertèbres sans résistance notable. Exactement les échantillons de tissus dans le volume décuplé de solution de formaldéhyde à 4% dans le PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, placez le tissu dans un milieu d’incorporation soluble dans l’eau sur le bouton Cryotome, de sorte qu’un plan axial ou un plan perpendiculaire coupe le collagène de type un normalement est généré. Utilisez le cryotome standard pour découper le tissu incorporé à une épaisseur de 70 micromètres dans des échantillons humains et de 40 micromètres dans des échantillons bovins. Recueillir les sections sur une lame de verre avant de rincer les sections trois fois avec du PBS, ajouter un colorant fluorescent approprié suivi du support de montage et recouvrir les sections avec un couvercle.Placez une lame avec une section de tissu de coloration sur le porte-échantillon du microscope à floraison en démarrant le dispositif d’éclairage de la structure pour effectuer une imagerie à champ de vision unique avec des filtres fluorescents et un éclairage adéquat. À l’aide d’un logiciel d’optimisation d’image compatible avec le microscope à floraison, traitez les images en optimisant l’intensité et la luminosité. Pour visualiser la section dans son ensemble, utilisez la technique d’imagerie mosaïque en ouvrant les 60 paramètres d’acquisition à partir du panneau de la barre d’outils et en ajustant les paramètres de mosaïque dans le registre des mosaïques.Pour ce faire, définissez le nombre de colonnes et de lignes d’images de champ de vision qui seront ensuite fusionnées en une seule image de vue d’ensemble, appuyez sur configuration et ajustez la correction de mise au point de chaque vignette. Post-traiter les images en optimisant l’intensité et la luminosité. Pour analyser l’organisation spatiale des chondrocytes, utilisez la fonction 3D intégrée dans le logiciel en ajustant les paramètres de la pile Z avec le bouton start/stop, définissez les paramètres de balayage tels que les positions de départ et d’arrêt dans l’axe Z et la distance de la tranche.Identifiez les modèles cellulaires individuels et utilisez un plugin de comptage cellulaire pour l’analyse quantitative des modèles cellulaires, calculez la densité cellulaire en divisant les cellules comptées par la taille de la région d’intérêt choisie. L’architecture de l’IVD avec son réseau dense de fibres de collagène dans l’anneau et le noyau plus mou peut être reconnue dans les images en mosaïque prises dans le plan axial et sagittal. Dans les zones agrandies des images en mosaïque, différents modèles d’organisation spatiale des chondrocytes tels que des cellules individuelles, des paires et des chaînes ont été remarqués.L’étude des différents stades de développement et de maturation de la fibrose annulaire bovine a montré une diminution continue de la densité cellulaire au cours du développement du disque embryonnaire. D’autre part, une augmentation de la densité cellulaire et la formation d’amas ont été observées dans le disque humain adulte au cours de la dégénérescence. La densité cellulaire dans les premiers stades du développement du DIV dans la fibrose annulaire bovine et le noyau pulpeux bovin a diminué rapidement jusqu’à la naissance.Par l’imagerie par canal de l’IVD avec l’Epitome a permis de visualiser l’architecture 3D des modèles spatiaux tels que le cytoplasme et le noyau, dans le DIV intact unique ainsi que des paires de chondrocytes ont été repérés. Alors que dans les amas de cellules anulus dégénérées ont été trouvés. La partie la plus difficile consiste à attribuer le tissu à son origine et à corriger l’incorporé pour le sectionnement.Ceci est essentiel pour obtenir des résultats fiables. Le fait d’avoir correctement disséqué et sélectionné des tissus DIV de différents stades et origines nous permet d’approfondir l’analyse par d’autres analyses biochimiques et biomécaniques, telles que l’ELISA ou la microscopie à force atomique.

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