Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Wir danken unseren Co-Autoren aus den Originalpublikationen für ihre Hilfe und Unterstützung. Wir danken Charlotte Emma Bamberger für die Hilfe bei der Anschaffung der Apotombilder.

Für die Analyse der Embryonalentwicklung und -reifung wurden Rinderscheiben verwendet. Um die Degeneration der IVD zu bewerten, wurden menschliche Proben analysiert.
Menschliches IVD-Gewebe wurde von Patienten gewonnen, die in der Klinik für Orthopädische Chirurgie, universitätsklinikum Tübingen und im BG Traumazentrum Tübingen wegen Bandscheibendegeneration, Bandscheibenvorfall oder Wirbelsäulentrauma operiert wurden. Die volle Zustimmung der Ethikkommission wurde vor Beginn der Studie...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. 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E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation.">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li><li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics.">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li><li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix.">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li><li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration.">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).</li><li>Habermehl, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. 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Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury:+implications+for+regenerative+strategies.">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis.">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li><li>Johnson, W. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+cells+in+intervertebral+disc+development+and+degeneration.">Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration.</a> Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).</li></ol>

Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, die durch Mosaikbildgebung und optische Schnitte ergänzt wurde, untersuchten wir die räumliche Anordnung der Chondrozyten im Anulus der lendentalen IVD während der gesamten Entwicklung, Reifung und Degeneration. Während degeneratives Gewebe von Patienten entnommen werden konnte, die eine Wirbelsäulenoperation wegen Bandscheibendegeneration erhielten, erforderte die Analyse der Embryonalperiode und der Reifephase die Verwendung eines Modellorganismus (Rind). Hohe Zelldichten wurd...

Die Bandscheibe (IVD) ist eine knorpelbasierte Struktur, die biochemisch und in Bezug auf die Zellarchitektur auf den ersten Blick in vielerlei Hinsicht dem Gelenkknorpel1ähnelt. Tatsächlich sind sowohl die IVD-Degeneration als auch die Osteoarthritis (OA) des Gelenkknorpels durch Gelenkraumverengung aufgrund von Knorpelverschleiß, subchondraler Zysten- und Osteophytenbildung und subchondraler Sklerose gekennzeichnet2,3. Trotz dieser scheinbaren Ähnlichkeiten unterscheiden sich Architektur und funktionelle Rolle beider Gewebe. Während die Matrix des Gelenkknorpels hauptsächlich aus einem arkadenbildenden Kollagen-Typ-II-Netzwerk besteht, besteht die IVD aus drei verschiedenen Gewebetypen: Der Kollagen-Typ-II-reiche Nucleus pulposus in der Mitte nimmt axiale Lasten auf und überträgt sie auf einen umfassenden Ring aus dicht gepackten kreisförmigen Kollagen-Typ-I-Fasern, der als Anulus fibrosus bezeichnet wird. Ihre Funktion besteht darin, die übersetzten axialen Drücke zu absorbieren, die der proteoglykanische und wasserreiche Kern mit ihrer Zug-Längsfaserfestigkeit erhält. An der Ober- und Unterseite jedes Kerns und Anulus bildet eine hyaline knorpelige Endplatte die Verbindung zu den benachbartenWirbeln 4 (Abbildung 1).
Im Gelenkknorpel finden sich vier unterschiedliche räumliche Chondrozytenmuster: Paare, Saiten, Doppelsaiten, kleine bzw. große Cluster5,6,7 ( Abbildung2). Veränderungen in diesem Muster sind mit dem Beginn und der Progressionvon OAassoziiert 8,9. Die räumliche Chondrozytenorganisation ist auch ein Indikator für eine direkte funktionelle Eigenschaft des Knorpels, nämlich seine Steifigkeit, was die funktionelle Relevanz dieses bildbasierten Grading-Ansatzesunterstreicht 10,11. Diese Muster können zusätzlich mit bereits vorhandener klinisch verfügbarer Technologie identifiziert werden12. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen der IVD und dem Gelenkknorpel kann die Hypothese aufgestellt werden, dass charakteristische Chondrozytenmuster auch in der IVD vorhanden sind. Clusterbildung ist ein Phänomen, das auch bei der degenerierten IVD beobachtet wird13,14.
Bei dem Versuch, die räumliche Zellorganisation in der IVD zu analysieren, ist es notwendig, mehrere technische Schwierigkeiten zu überwinden, die bei der Untersuchung des Gelenkknorpels nicht vorhanden sind:
Erstens ist die Verarbeitung des Gewebes selbst viel schwieriger als bei dem homogenen hyalinen Knorpel, der größtenteils aus Kollagen Typ II besteht. Die Hauptfaserkomponente des IVD ist Kollagen Typ I, was es viel schwieriger macht, dünne histologische Abschnitte zu erzeugen. Während im hyalinen Gelenkknorpel aufgrund der "glasartigen" Beschaffenheit des Gewebes auch dicke Schnitte leicht analysiert werden können, ist das Kollagen-Typ-I-Netzwerk der IVD optisch hochundurchdringlich. Aus diesem Grund ist ein starkes Hintergrundrauschen ein häufiges Problem in der Histologie der IVD. Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, dieses optisch dichte Gewebe zu durchdringen, ist die Verwendung eines optischen Schnittgeräts, z.B. mittels eines Apotoms. In einem solchen Apotom wird ein Gitter in den Beleuchtungsweg eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops eingefügt. Vor dem Gitter wird eine ebeneparallele Glasplatte platziert. Dieser neigt sich hin und her und projiziert so das Raster im Bild in drei verschiedenen Positionen. Für jede Z-Position werden drei Rohbilder mit dem projizierten Raster erstellt und überlagert. Mittels spezieller Software kann das unscharfe Licht berechnet werden. Das zugrunde liegende Prinzip ist, dass, wenn das Raster sichtbar ist, diese Information im Fokus ist, wenn nicht, sie als unscharf angesehen wird. Mit dieser Technik können gut fokussierte und hochauflösende Bilder in angemessener Zeit aufgenommen werden.
Zweitens ist das Gewebe von menschlichen Spendern schwer zu bekommen. Beim totalen Knieersatz kann die gesamte Oberfläche des Gelenks für die weitere Analyse während der Operation erhalten werden. Obwohl die Arthrose eines Diarthrodialgelenks auch eine Erkrankung des gesamten Gelenks ist, gibt es dennoch starke fokale Unterschiede in der Qualität des Knorpels, wobei in der Regel einige Bereiche des Gelenks noch intakt sind, zum Beispiel aufgrund einer verminderten Belastung in diesem Bereich. Anders verhält es sich bei der IVD, wo eine Operation in der Regel erst dann durchgeführt wird, wenn die Bandscheibe global zerstört ist. Bei der Gewinnung von Gewebe von menschlichen Spendern aus dem Operationssaal ist das Gewebe auch stark fragmentiert und es ist notwendig, das Gewebe vor weiteren Analysen korrekt einem der drei Knorpeltypen der IVD zuzuordnen. Um detailliertere Analysen auch größerer Gewebeschnitte zu ermöglichen und die Embryonalentwicklung der IVD zu untersuchen, ist daher die Wahl eines tierischen Modellorganismus notwendig.
Bei der Auswahl eines solchen Modellorganismus ist es wichtig, ein System zu haben, das hinsichtlich seiner Anatomie und Abmessungen, seiner mechanischen Belastung, der vorliegenden Zellpopulation sowie seiner Gewebezusammensetzung mit der menschlichen Bandscheibe vergleichbar ist. Für die Zwecke der hier vorgestellten Technik empfehlen wir die Verwendung von bovinem lumbalem Bandscheibengewebe: Eine kritische Eigenschaft der menschlichen Bandscheibe, die zu ihrem geringen regenerativen Potenzial führt, ist der Verlust von Notochordalzellen während der Reifung im Zellkern. In zahlreichen Modellorganismen können notochordale Zellen jedoch ihr gesamtes Leben lang nachgewiesen werden. Die meisten der wenigen Tiere, die ihre Notochordalzellen verlieren, wie Schafe, Ziegen oder Chondrodystrophig-Hunde, haben eine IVD, die viel kleiner ist als menschliche Bandscheiben. Nur Lendenwirbelscheiben sind mit einem vergleichbaren Sagittalscheibendurchmesser wie menschliche IVDs vorhanden15.
Ein Schlüsselfaktor, der zu einer frühen Bandscheibendegeneration führt, ist eine übermäßige mechanische Belastung. Der intradiskale Druck einer stehenden Kuh in der Lendenwirbelsäule beträgt etwa 0,8 MPa, wobei die Wirbelsäule horizontal ausgerichtet ist. Überraschenderweise sind diese Drücke vergleichbar mit den lumbalen intradiskalen Drücken, die für die aufrechte menschliche Wirbelsäule (0,5 MPa) berichtetwurden 15,16. Auch die Menge an Wasser und Proteoglykanen in Rinderscheiben ist vergleichbar mit der der IVD von jungen Menschen17. Obwohl sich das tatsächliche Bewegungsmuster der Bewegungssegmente bei vierbeinigen Tieren vom zweibeinigen Menschen unterscheiden kann, ist die Kuh in Bezug auf die Gesamtbelastung und die Bandscheibeneigenschaften der menschlichen Biologie viel näher als andere etablierte Tiermodelle für die IVD wie Schafe und Hunde.
In diesem Protokoll stellen wir eine Technik vor, wie Veränderungen in der IVD aus der Sicht der räumlichen Chondrozytenorganisation von der frühen Embryonalentwicklung bis zur Degeneration im Endstadium analysiert werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

Die Degeneration der Bandscheibe (IVD) ist eine der Hauptursachen für Rückenschmerzen und bringt für die Betroffenen eine hohe Beeinträchtigung mit sich. Um die Bandscheibendegeneration zu entschlüsseln und regenerative Ansätze entwickeln zu können, ist ein gründliches Verständnis der Zellbiologie der IVD unerlässlich. Ein Noch unbeantworteter Aspekt dieser Biologie ist die Frage, wie Zellen in einem physiologischen Zustand und während der Degeneration räumlich angeordnet sind. Die biologischen Eigenschaften der IVD und ihre Verfügbarkeit erschweren die Analyse dieses Gewebes. Die vorliegende Studie untersucht die räumliche Chondrozytenorganisation im Anulus fibrosus von der frühen Embryonalentwicklung bis zur Degeneration im Endstadium. Eine optische Schnittmethode (Apotom) wird angewendet, um hochauflösende Färbeanalysen unter Verwendung von embryonalem Rindergewebe als Tiermodell und menschlichem Bandscheibengewebe von Patienten durchzuführen, die sich einer Wirbelsäulenoperation unterziehen. Von einer sehr hohen Chondrozytendichte in der frühen embryonalen Rinderscheibe nimmt die Anzahl der Zellen während der Schwangerschaft, des Wachstums und der Reifung ab. Bei menschlichen Bandscheiben begleitete eine Zunahme der Zelldichte das Fortschreiten der Gewebedegeneration. Wie bereits im Gelenkknorpel gezeigt wurde, stellt die Clusterbildung ein charakteristisches Merkmal der fortgeschrittenen Bandscheibendegeneration dar.

Anhand von Mosaikbildern ist die Architektur des IVD mit seinem dichten Kollagenfasernetzwerk im Anulus und dem weicheren Kern deutlich zu erkennen (Abbildung 4). Eine kontinuierliche Abnahme der Zelldichte kann während der Embryonalentwicklung beobachtet werden (Abbildung 5). Während in den frühen Stadien der IVD-Entwicklung eine Zelldichte von 11.435 Zellen/mm² im Rinderanuulus fibrosus und 17.426 Zellen/mm² im Rinderkern pulposus zu finden ist, nehmen di...

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Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Wir stellen eine Methode vor, um die räumliche Chondrozytenorganisation im Anulus fibrosus der Bandscheibe mit einer optischen Schnittmethode zu untersuchen.

Optische Schnittung und Visualisierung der Bandscheibe von der Embryonalentwicklung bis zur Degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

Bandscheibendegeneration führt zu einem hohen Grad an Beeinträchtigungen und Schmerzen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Bandscheibenentwicklung und ihre Veränderungen in der Degeneration morphologisch zu untersuchen. Das dichte Kollagen-Typ-Eins-Netzwerk macht es normalerweise schwierig, die Bandscheibe durch Mikroskopie zu analysieren.Mit dem optischen Schnitt können wir die 3D-Anordnung der Chondrozyten innerhalb der verschiedenen Gewebe untersuchen. Beginnen Sie mit der Platzierung intraoperativ erhaltener Bandscheiben- oder IVD-Proben in DMEM, ergänzt mit 2 Volumenprozent Penicillin-Streptomycin und 1,2 Volumenprozent Volumen Amphotericin B, unmittelbar nach der Entnahme, lagern IVD-Proben bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verarbeitung. Bei gefrorenem Auftauen der menschlichen IVD-Proben bei Raumtemperatur und Identifizierung des Ursprungs des menschlichen IVD-Gewebes anhand mikroskopischer Eigenschaften wie College-Dichte und -Orientierung.Um das Bandscheibengewebe zu sammeln, nehmen Sie das Bewegungssegment, das aus der IVD mit ihren beiden benachbarten Wirbeln besteht, und sezieren Sie mit einer chirurgischen Klinge Nummer 15 die gesamte Rinderscheibe vom subchondralen Knochen, drehen Sie die Bandscheibe um, um die zentrierten Bereiche zu erreichen. Nachdem Sie die verschiedenen Bereiche des Knorpels identifiziert haben, verwenden Sie eine chirurgische Klinge Nummer 20 oder 22, um den interessierenden Bereich aus der gesamten Bandscheibe auszuschneiden. Die IVDs von Rinderembryonen mit einer Kronen-Rumpf-Länge von weniger als 20 Zentimetern sollten ohne Dissektion verarbeitet werden.Durchgeführte Entkalkung des Gewebes wie im Manuskript beschrieben. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Entkalkung, wenn eine 20-Gauge-Nadel das Bandscheibengewebe oder gegebenenfalls die Wirbel ohne nennenswerten Widerstand durchdringt. Exaktieren Sie die Gewebeproben im zehnfachen Volumen von 4% iger Formaldehydlösung in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius.Legen Sie das Gewebe am nächsten Tag in ein wasserlösliches Einbettungsmedium auf den Kryotomenknopf, so dass normalerweise entweder eine axiale Ebene oder eine Ebene erzeugt wird, die senkrecht den Kollagentyp eins schneidet. Verwenden Sie das Standard-Kryotom, um das eingebettete Gewebe mit einer Dicke von 70 Mikrometern in menschlichen Proben und 40 Mikrometern in Rinderproben zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte auf einem Glasobjektträger, bevor Sie die Abschnitte dreimal mit PBS spülen, fügen Sie einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff hinzu, gefolgt vom Montagemedium, und bedecken Sie die Abschnitte mit einem Abdeckschein.Legen Sie einen Objektträger mit einem Fleckengewebeschnitt auf den Probenhalter des Blütenstandsmikroskops, indem Sie das Strukturbeleuchtungsgerät starten, um eine Einzelfeldbildbildgebung mit Fluoreszenzfiltern und ausreichender Beleuchtung durchzuführen. Verwenden Sie eine Bildoptimierungssoftware, die mit dem Blütenstandsmikroskop kompatibel ist, und verarbeiten Sie die Bilder, indem Sie die Intensität und Helligkeit optimieren. Um den Abschnitt als Ganzes zu visualisieren, verwenden Sie die Mosaikbildgebungstechnik, indem Sie die 60-Erfassungseinstellungen im Symbolleistenfenster öffnen und die Mosaikeinstellungen im Mosaikregister anpassen.Definieren Sie dazu die Anzahl der Spalten und Zeilen von Sichtfeldbildern, die später zu einem Übersichtsbild zusammengeführt werden sollen, drücken Sie setup und passen Sie die Fokuskorrektur einzelner Kacheln an. Nachbearbeitung der Bilder durch Optimierung der Intensität und Helligkeit. Um die räumliche Chondrozytenorganisation zu analysieren, verwenden Sie die in der Software integrierte 3D-Funktion, indem Sie die Z-Stack-Einstellungen mit der Start/Stopp-Taste anpassen, die Scanparameter wie die Start- und Stopppositionen in der Z-Achse und den Slice-Abstand definieren.Identifizieren Sie einzelne zelluläre Muster und verwenden Sie ein Zellzähl-Plugin für die quantitative Analyse der zellulären Muster, berechnen Sie die Zelldichte, indem Sie die gezählten Zellen durch die Größe der ausgewählten Region von Interesse teilen. Die Architektur des IVD mit seinem dichten Kollagenfasernetzwerk im Ring und dem weicheren Kern ist in den Mosaikbildern der axialen und sagittalen Ebene zu erkennen. In vergrößerten Bereichen aus den Mosaikbildern wurden unterschiedliche räumliche Organisationsmuster von Chondrozyten wie Einzelzellen, Paare und Strings bemerkt.Die Untersuchung verschiedener Entwicklungs- und Reifestadien der Rinderringfibrose zeigte eine kontinuierliche Abnahme der Zelldichte während der Embryonalscheibenentwicklung. Auf der anderen Seite wurden eine zunehmende Zelldichte und Clusterbildung in der erwachsenen menschlichen Bandscheibe während der Degeneration beobachtet. Die Zelldichte in den frühen Stadien der IVD-Entwicklung in der Rinderringfibrose und im Rinderkern pulposus nahm bis zur Geburt rapide ab.Durch die Kanalbildgebung des IVD mit dem Epitom ermöglichte die Visualisierung der 3D-Architektur der räumlichen Muster wie Zytoplasma und Zellkern, in der intakten IVD wurden sowohl Einzel- als auch Chondrozytenpaare gesichtet. Während im degenerierten Anulus Zellhaufen gefunden wurden. Der schwierigste Teil besteht darin, das Gewebe seinem Ursprung zuzuordnen und das Eingebettete für den Schnitt zu korrigieren.Dies ist unerlässlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Nachdem wir IVD-Gewebe aus verschiedenen Stadien und Ursprüngen korrekt seziert und ausgewählt haben, können wir die Analyse durch weitere biochemische und biomechanische Analysen wie ELISA oder Rasterkraftmikroskopie vertiefen.

Research

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

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