Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto. Ringraziamo Charlotte Emma Bamberger per aver contribuito ad acquisire le immagini dell'apotoma.

Per l'analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell'IVD, sono stati analizzati campioni umani.
Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell'Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organization+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Tschaikowsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof-of-concept+for+the+detection+of+early+osteoarthritis+pathology+by+clinically+applicable+endomicroscopy+and+quantitative+AI-supported+optical+biopsy.">Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).</li><li>Ciapetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+observation+of+human+intervertebral+disc+tissue+and+cells+isolated+from+degenerated+intervertebral+discs.">Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).</li><li>Johnson, W. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. 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Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. 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E., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumours+of+my+death+may+have+been+greatly+exaggerated':+a+brief+review+of+cell+death+in+human+intervertebral+disc+disease+and+implications+for+cell+transplantation+therapy.">Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy.</a> Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).</li><li>Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+morphology+in+health+and+disease.">Disc morphology in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).</li><li>Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+clusters+in+intervertebral+disc+degeneration+and+its+relevance+behind+repair.">The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair.</a> Spine Research. 03, 15 (2017).</li><li>Sharp, C. 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Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall'imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell'anoulus dell'IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l'analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l'uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari...

Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all'architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilaginearticolare 1. Infatti, sia la degenerazione IVD che l'osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell'usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l'architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Mentre la matrice della cartilagine articolare è formata principalmente da una rete di collagene di tipo II che forma arcade, l'IVD è costituito da tre diversi tipi di tessuto: il nucleo polposo ricco di collagene di tipo II al centro assorbe carichi assiali e li trasmette a un anello comprensivo di fibre circolari di collagene di tipo I densamente imballate che è chiamato anulus fibrosus. La loro funzione è quella di assorbire le pressioni assiali tradotte ricevute dal nucleo ricco di proteoglicani e acqua con la loro resistenza longitudinale a trazione delle fibre. Nella parte superiore e inferiore di ciascun nucleo e anulus una piastra terminale cartilaginea ialina forma la giunzione alle vertebre adiacenti4 (Figura 1).
Nella cartilagine articolare si possono trovare quattro distinti modelli spaziali di condrociti: coppie, stringhe, doppie corde, piccoli gruppi rispettivamente grandi5,6,7 (Figura 2). I cambiamenti in questo modello sono associati all'insorgenza e alla progressione dell'OA8,9. L'organizzazione spaziale dei condrociti è anche indicativa di una proprietà funzionale diretta della cartilagine, vale a dire la sua rigidità, sottolineando la rilevanza funzionale di questo approccio di classificazione basato su immagini10,11. Questi modelli possono inoltre essere identificati con la tecnologia clinicamente disponibile già esistente12. A causa delle somiglianze tra l'IVD e la cartilagine articolare, si può ipotizzare che nell'IVD siano presenti anche modelli caratteristici di condrociti. La formazione di cluster è un fenomeno osservato anche nella IVDdegenerata 13,14.
Quando si tenta di analizzare l'organizzazione cellulare spaziale nell'IVD, è necessario superare diverse difficoltà tecniche che non sono presenti quando si studia la cartilagine articolare:
In primo luogo, l'elaborazione del tessuto stesso è molto più impegnativa rispetto alla cartilagine ialina omogenea che è in gran parte composta da collagene di tipo II. Il principale componente della fibra dell'IVD è il collagene di tipo I, il che rende molto più difficile generare sezioni istologiche sottili. Mentre nella cartilagine articolare ialina anche le sezioni spesse possono essere facilmente analizzate a causa della natura "vetrosa" del tessuto, la rete di collagene di tipo I dell'IVD è otticamente altamente impenetrabile. Per questo motivo, un forte rumore di fondo è un problema comune nell'istologia dell'IVD. Un modo rapido ed economico per penetrare questo tessuto otticamente denso è l'uso di un dispositivo di sezionamento ottico, ad esempio per mezzo di un apotome. In un tale Apotome, una griglia viene inserita nel percorso di illuminazione di un microscopio a fluorescenza convenzionale. Di fronte alla griglia è posizionata una lastra di vetro parallela al piano. Questo si inclina avanti e indietro proiettando così la griglia nell'immagine in tre diverse posizioni. Per ogni posizione z, vengono create e sovrapposte tre immagini raw con la griglia proiettata. Tramite un software speciale, è possibile calcolare la luce fuori fuoco. Il principio di base è che, se la griglia è visibile, quell'informazione è a fuoco, se non è considerata sfocata. Con questa tecnica, immagini ben focalizzate e ad alta risoluzione possono essere acquisite in un ragionevole lasso di tempo.
In secondo luogo, il tessuto è difficile da reperire da donatori umani. Quando si esegue la sostituzione totale del ginocchio, è possibile ottenere l'intera superficie dell'articolazione per ulteriori analisi durante l'intervento chirurgico. Sebbene l'artrosi di un'articolazione diartrodiale sia anche una malattia dell'intera articolazione, ci sono tuttavia forti differenze focali nella qualità della cartilagine con di solito alcune aree dell'articolazione ancora intatte, ad esempio a causa del carico ridotto in quell'area. Questa situazione è diversa nell'IVD, dove la chirurgia viene solitamente eseguita solo quando il disco viene distrutto globalmente. Quando si ottiene tessuto da donatori umani dalla sala operatoria, il tessuto è anche altamente frammentato ed è necessario allocare correttamente il tessuto a uno dei tre tipi di cartilagine dell'IVD prima di effettuare ulteriori analisi. Per consentire analisi più dettagliate anche di sezioni tissutali più grandi e per esaminare lo sviluppo embrionale dell'IVD è quindi necessaria la scelta di un organismo modello animale.
Quando si sceglie un tale organismo modello è importante avere un sistema che sia paragonabile al disco umano per quanto riguarda la sua anatomia e le sue dimensioni, il suo carico meccanico, l'attuale popolazione cellulare e la sua composizione tissutale. Ai fini della tecnica qui presentata suggeriamo l'uso del tessuto del disco lombare bovino: Una proprietà critica del disco umano con conseguente suo basso potenziale rigenerativo è la perdita di cellule notocordali durante la maturazione nel nucleo. Tuttavia, in numerosi organismi modello le cellule notocordali possono essere rilevate per tutta la loro vita. La maggior parte dei pochi animali che perdono le loro cellule notocordali come pecore, capre o cani condrodistrofi hanno un IVD che è molto più piccolo dei dischi umani. Solo i dischi bovini lombari presentano un diametro del disco sagittale paragonabile a quelli degli IVD umani15.
Un fattore chiave che porta alla degenerazione precoce del disco è l'eccessivo carico meccanico. Le pressioni intradiscali di una mucca in piedi nella colonna lombare sono di circa 0,8 MPa con la colonna vertebrale allineata orizzontalmente. Sorprendentemente queste pressioni sono paragonabili alle pressioni intradiscali lombari riportate per la colonna vertebrale umana eretta (0,5 MPa)15,16. Anche la quantità di acqua e proteoglicani nei dischi bovini è paragonabile a quella dell'IVD dei giovaniumani 17. Pertanto, sebbene il modello di movimento effettivo dei segmenti di movimento possa differire negli animali quadrupedi dall'uomo bipede, per quanto riguarda il carico totale e le caratteristiche del disco, la mucca è molto più vicina alla biologia umana rispetto ad altri modelli animali stabiliti per l'IVD come pecore e cani.
In questo protocollo presentiamo una tecnica come analizzare i cambiamenti nell'IVD dal punto di vista dell'organizzazione spaziale dei condrociti dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione dello stadio terminale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell'IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell'IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Utilizzando immagini a mosaico, l'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell'anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nu...

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Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

La degenerazione del disco intervertebrale porta ad un alto grado di compromissione e dolore. Il nostro protocollo ci permette di indagare morfologicamente lo sviluppo del disco e i suoi cambiamenti nella degenerazione. La densa rete di collagene di tipo uno rende solitamente difficile analizzare il disco intervertebrale al microscopio.Con il sezionamento ottico, possiamo studiare la disposizione 3D dei condrociti all'interno dei diversi tessuti. Iniziare posizionando campioni di disco intervertebrale o IVD ottenuti per via intraoperatoria in DMEM integrati con 2% volume per volume Penicillina-Streptomicina e 1,2% volume per volume Amfotericina B, immediatamente dopo la raccolta, conservare campioni IVD a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Se congelato, scongelare i campioni IVD umani a temperatura ambiente e identificare l'origine del tessuto IVD umano in base a proprietà microscopiche come la densità e l'orientamento del college.Per raccogliere il tessuto del disco bovino, prendere il segmento di movimento costituito dall'IVD con le sue due vertebre adiacenti e utilizzando una lama chirurgica numero 15, sezionare l'intero disco bovino dall'osso subcondrale, capovolgere il disco per raggiungere le aree centrate. Dopo aver identificato le diverse aree della cartilagine, utilizzare una lama chirurgica numero 20 o 22 per ritagliare l'area di interesse dall'intero disco. Gli IVD di embrioni bovini con una lunghezza della groppa della corona inferiore a 20 centimetri devono essere elaborati senza dissezione.Decalcificazione eseguita del tessuto come descritto nel manoscritto. Confermare la decalcificazione riuscita, se un ago calibro 20 penetra nel tessuto del disco o, se applicabile, le vertebre senza una notevole resistenza. Esattezza i campioni di tessuto nel volume dieci volte della soluzione di formaldeide al 4% in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, posizionare il tessuto in un mezzo incorporante solubile in acqua sulla manopola cryotome, in modo tale che venga generato normalmente un piano assiale o un piano che taglia perpendicolarmente il collagene di tipo uno. Utilizzare il criotomo standard per sezionare il tessuto incorporato ad uno spessore di 70 micrometri nei campioni umani e 40 micrometri nei campioni bovini. Raccogliere le sezioni su un vetrino prima di risciacquare le sezioni tre volte con PBS, aggiungere un colorante fluorescente adatto seguito dal mezzo di montaggio e coprire le sezioni con uno slip di copertura.Posizionare un vetrino con una sezione di tessuto macchiato sul portacampioni del microscopio a florescenza avviando il dispositivo di illuminazione della struttura per eseguire l'imaging a campo visivo singolo con filtri fluorescenti e illuminazione adeguata. Utilizzando un software di ottimizzazione delle immagini compatibile con il microscopio a florescenza, elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità. Per visualizzare la sezione nel suo complesso, utilizzare la tecnica di imaging a mosaico aprendo le 60 impostazioni di acquisizione dal pannello della barra degli strumenti e regolando le impostazioni del mosaico nel registro dei mosaici.Per fare ciò, definire il numero di colonne e righe di immagini del campo visivo che devono essere successivamente unite in un'unica immagine di panoramica, premere imposta e regolare la correzione dello stato attivo delle singole tessere. Post-elaborare le immagini ottimizzando l'intensità e la luminosità. Per analizzare l'organizzazione spaziale dei condrociti utilizzare la funzione 3d incorporata nel software regolando le impostazioni Z-stack con il pulsante start/stop, definire i parametri di scansione come le posizioni di avvio e arresto nell'asse Z e la distanza slice.Identificare i singoli modelli cellulari e utilizzare un plug-in di conteggio delle cellule per l'analisi quantitativa dei modelli cellulari, calcolare la densità cellulare dividendo le cellule contate per la dimensione della regione di interesse scelta. L'architettura dell'IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell'anulus e il nucleo più morbido può essere riconosciuta nelle immagini a mosaico scattate nel piano assiale e sagittale. Nelle aree ingrandite delle immagini del mosaico, sono stati notati diversi modelli organizzativi spaziali di condrociti come singole cellule, coppie e stringhe.Lo studio delle diverse fasi di sviluppo e maturazione della fibrosi dell'anulus bovino ha mostrato una continua diminuzione della densità cellulare durante lo sviluppo del disco embrionale. D'altra parte è stato osservato un aumento della densità cellulare e della formazione di cluster nel disco umano adulto durante la degenerazione. La densità cellulare nelle prime fasi dello sviluppo dell'IVD nella fibrosi dell'anulus bovino e nel nucleo polposo bovino è diminuita rapidamente fino alla nascita.Per canale l'imaging dell'IVD con l'Epitome ha permesso la visualizzazione dell'architettura 3D dei modelli spaziali come il citoplasma e il nucleo, nel singolo IVD intatto e sono state individuate coppie di condrociti. Mentre nell'anulus degenerato sono stati trovati cluster di cellule. La parte più impegnativa è allocare il tessuto alla sua origine e correggere l'incorporato per il sezionamento.Questo è essenziale per ottenere risultati affidabili. Aver correttamente sezionato e selezionato tessuto IVD da diversi stadi e origini ci permette di approfondire l'analisi mediante ulteriori analisi biochimiche e biomeccaniche, come l'ELISA o la microscopia a forza atomica.

Research

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