Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Vi takker våre medforfattere fra de opprinnelige publikasjonene for deres hjelp og støtte. Vi takker Charlotte Emma Bamberger for å ha bidratt til å skaffe apotome-bildene.

For analyse av embryonal utvikling og modning ble det brukt storfeskiver. For å evaluere degenerasjon av IVD ble menneskelige prøver analysert.
Humant IVD-vev ble hentet fra pasienter som ble operert for lumbal skivedegenerasjon, skiveprolaps eller ryggtraumer ved Institutt for ortopedisk kirurgi, Universitetssykehuset i Tübingen og BG Trauma Centre Tübingen. Full etisk komitégodkjenning ble innhentet før studiestart (prosjektnummer 244/2013BO2). Skriftlig informert samtykke ble mottatt ...

<ol>
	<li>Urban, J. P. G., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertebral+disc.">Degeneration of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).</li><li>Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+evaluation+of+osteoarthritis.">Radiographic evaluation of osteoarthritis.</a> Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).</li><li>Pye, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+disc+degeneration:+association+between+osteophytes,+end-plate+sclerosis+and+disc+space+narrowing.">Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).</li><li>Humzah, M. D., Soames, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intervertebral+disc:+structure+and+function.">Human intervertebral disc: structure and function.</a> The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).</li><li>Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontally+oriented+clusters+of+multiple+chondrons+in+the+superficial+zone+of+ankle,+but+not+knee+articular+cartilage.">Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage.</a> The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).</li><li>Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+biomechanical+properties+of+the+extracellular+and+pericellular+matrix+and+their+interconnection+throughout+the+course+of+osteoarthritis.">Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis.</a> Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).</li><li>Danalache, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+stiffness+and+biochemical+composition+of+the+pericellular+matrix+as+a+function+of+spatial+chondrocyte+organization+in+osteoarthritic+cartilage.">Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).</li><li>Tschaikowsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof-of-concept+for+the+detection+of+early+osteoarthritis+pathology+by+clinically+applicable+endomicroscopy+and+quantitative+AI-supported+optical+biopsy.">Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).</li><li>Ciapetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+observation+of+human+intervertebral+disc+tissue+and+cells+isolated+from+degenerated+intervertebral+discs.">Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).</li><li>Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cluster+formation+in+degenerate+lumbar+intervertebral+discs+is+associated+with+increased+disc+cell+proliferation.">Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation.</a> Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).</li><li>Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+runt+cow+lumbar+intradiscal+pressures+and+motion+segment+biomechanics.">Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).</li><li>Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+vivo+measurements+of+pressures+in+the+intervertebral+disc+in+daily+life.">New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life.</a> Spine. 24 (8), 755-762 (1999).</li><li>Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+and+limitations+of+using+the+bovine+tail+as+a+model+for+the+human+lumbar+spine.">Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine.</a> Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).</li><li>Hofmann, U. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix.">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li><li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration.">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).</li><li>Habermehl, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).</li><li>Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+changes+of+the+pericellular+matrix+and+spatial+chondrocyte+organization-Two+highly+interconnected+hallmarks+of+osteoarthritis.">Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).</li><li>Bonnaire, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+among+gestation+length+and+health,+production,+and+reproduction+in+Holstein+cows+and+implications+for+their+offspring.">Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring.</a> Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).</li><li>Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Entwicklung+des+schwarzbunten+Niederungsrindes+von+der+Geburt+bis+zum+5.+Lebensjahr+mit+variationsstatistischen+Untersuchungen+einer+Population+solcher+Rinder+von+der+Geburt+bis+zum+3.+Lebensjahr.">Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+intervertebral+disc+injury+leads+to+organ+level+changes+in+structure,+cellularity,+and+biosynthesis.">Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis.</a> Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).</li><li>Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annulus+fibrosus+cell+phenotypes+in+homeostasis+and+injury:+implications+for+regenerative+strategies.">Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+remodeling+of+the+spatial+organization+of+human+superficial+chondrocytes+distant+from+focal+early+osteoarthritis.">Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).</li><li>Johnson, W. E., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumours+of+my+death+may+have+been+greatly+exaggerated':+a+brief+review+of+cell+death+in+human+intervertebral+disc+disease+and+implications+for+cell+transplantation+therapy.">Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy.</a> Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).</li><li>Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+morphology+in+health+and+disease.">Disc morphology in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).</li><li>Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+clusters+in+intervertebral+disc+degeneration+and+its+relevance+behind+repair.">The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair.</a> Spine Research. 03, 15 (2017).</li><li>Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+cell+clusters+in+pathological+human+intervertebral+discs+are+associated+with+increased+stress+protein+immunostaining.">Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining.</a> European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).</li><li>Freemont, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+cells+in+intervertebral+disc+development+and+degeneration.">Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration.</a> Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).</li></ol>

Ved hjelp av fluorescensmikroskopi forsterket av mosaikkavbildning og optisk seksjonering, evaluerte vi det romlige arrangementet av kondrocytter i anulus av lumbale IVD gjennom utvikling, modning og degenerasjon. Mens degenerativt vev kunne høstes fra pasienter som fikk ryggradskirurgi for skivedegenerering, krevde analyse av embryonal periode og modningsfase bruk av en modellorganisme (storfe). Høye cellulære tettheter ble notert i anulus under tidlig embryonal utvikling. I det videre utviklingsforløpet kunne man o...

Mellomvirvelskiven (IVD) er en bruskbasert struktur som biokjemisk og med hensyn til cellulær arkitektur ved første øyekast ligner på mange måter leddbrusk1. Faktisk er både IVD-degenerasjon og slitasjegikt (OA) av leddbrusk preget av felles plass innsnevring på grunn av brusk slitasje, subkondral cyste og osteofyttdannelse, og subkondral sklerose2,3. Til tross for disse tilsynelatende likhetene er arkitektur og funksjonell rolle i begge vevene forskjellige. Mens matrisen av leddbrusk hovedsakelig er dannet av et arkadedannende kollagen type II-nettverk, består IVD av tre forskjellige typer vev: kollagentypen II-rik kjerne pulposus i midten tar opp aksiale belastninger og overfører dem til en omfattende ring av tettpakkede sirkulære kollagen type I-fibre som kalles anulus fibrosus. Deres funksjon er å absorbere de oversatte aksiale trykkene mottatt av den proteoglykan- og vannrike kjernen med deres strekkfaste langsgående fiberstyrke. Øverst og nederst i hver kjerne og anulus danner en hyalin brusk endeplate krysset til de tilstøtende ryggvirvlene4 (figur 1).
I leddbrusk finnes fire distinkte romlige kondrocyttmønstre: par, strenger, doble strenger, små, henholdsvis store klynger5,6,7 ( Figur2). Endringer i dette mønsteret er knyttet til OA-utbruddet og progresjonen8,9. Romlig kondrocyttorganisasjon er også veiledende for en direkte funksjonell egenskap av brusk, nemlig stivheten, som understreker den funksjonelle relevansen av denne bildebaserte graderingsmetoden10,11. Disse mønstrene kan i tillegg identifiseres med allerede eksisterende klinisk tilgjengelig teknologi12. På grunn av likhetene mellom IVD og leddbrusk, kan det hypoteses at karakteristiske kondrocyttmønstre også er til stede i IVD. Klyngedannelse er et fenomen som også observeres i degenerert IVD13,14.
Når du prøver å analysere romlig cellulær organisasjon i IVD, er det nødvendig å overvinne flere tekniske vanskeligheter som ikke er til stede når du undersøker leddbrusk:
For det første er behandling av vevet selv mye mer utfordrende enn med den homogene hyaline brusk som i stor grad består av kollagen type II. IVDs hovedfiberkomponent er kollagen type I, noe som gjør det mye vanskeligere å generere tynne histologiske seksjoner. Mens i hyalinartikulær brusk selv tykke seksjoner lett kan analyseres på grunn av vevets "glasslignende" natur, er kollagen type I-nettverket til IVD optisk svært ugjennomtrengelig. Av denne grunn er en sterk bakgrunnsstøy et vanlig problem i histologien til IVD. En rask og billig måte å trenge inn i dette optisk tette vevet er bruken av en optisk seksjoneringsenhet, for eksempel ved hjelp av en Apotome. I et slikt Apotome settes et rutenett inn i belysningsveien til et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Foran rutenettet plasseres en plan-parallell glassplate. Dette vipper frem og tilbake og projiserer dermed rutenettet i bildet i tre forskjellige posisjoner. For hver z-posisjon opprettes tre RAW-bilder med det projiserte rutenettet og legges over. Ved hjelp av spesiell programvare kan lyset utenfor fokus beregnes ut. Det underliggende prinsippet er at hvis rutenettet er synlig, er denne informasjonen i fokus, hvis ikke anses den å være ute av fokus. Med denne teknikken kan godt fokuserte og høyoppløselige bilder skaffes på rimelig tid.
For det andre er vevet vanskelig å komme forbi fra menneskelige givere. Ved total kneutskifting kan hele overflaten av leddet oppnås for videre analyse under operasjonen. Selv om slitasjegikt i et diartropialt ledd også er en sykdom i hele leddet, er det likevel sterke fokusforskjeller i kvaliteten på brusk med vanligvis noen områder av leddet som fortsatt er intakte, for eksempel på grunn av redusert belastning i det området. Denne situasjonen er forskjellig i IVD, hvor kirurgi vanligvis bare utføres når platen er globalt ødelagt. Ved henting av vev fra menneskelige donorer fra operasjonsrommet er vevet også svært fragmentert, og det er nødvendig å tildele vevet riktig til en av de tre brusktypene til IVD før du gjør ytterligere analyser. For å tillate mer detaljerte analyser av også større vevsseksjoner og se på den embryonale utviklingen av IVD, er valget av en dyremodellorganisme derfor nødvendig.
Når du velger en slik modellorganisme, er det viktig å ha et system som er sammenlignbart med den menneskelige platen med hensyn til anatomi og dimensjoner, dens mekaniske belastning, dagens cellepopulasjon samt vevssammensetningen. For den presenterte teknikken her foreslår vi bruk av bovint lumbalskivevev: En kritisk egenskap ved den menneskelige platen som resulterer i sitt lave regenerative potensial er tap av notochordale celler under modning i kjernen. Men i mange modellorganismer kan notochordale celler oppdages hele livet. De fleste av de få dyrene som mister sine notokordale celler som sauer, geiter eller kondrodystrophig hunder har en IVD som er mye mindre enn menneskelige plater. Bare lumbale bovinskiver er tilstede med en sammenlignbar sagittal platediameter med de av menneskelige IVDer15.
En nøkkelfaktor som fører til tidlig platedegenerering er overdreven mekanisk lasting. Det intradiskale trykket til en stående ku i lumbal ryggraden er rundt 0,8 MPa med ryggraden justert horisontalt. Overraskende disse trykkene er sammenlignbare med lumbale intradiskale trykk rapportert for oppreist menneskelig ryggrad (0,5 MPa)15,16. Også mengden vann og proteoglykaner i storfeskiver er sammenlignbar med IVD fra unge mennesker17. Derfor, selv om bevegelsessegmentenes faktiske bevegelsesmønster kan variere i firedoble dyr fra bipedalmennesket, med hensyn til total lasting og skiveegenskaper, er kua mye nærmere menneskelig biologi enn andre etablerte dyremodeller for IVD som sauer og hunder.
I denne protokollen presenterer vi en teknikk for å analysere endringer i IVD fra romlig kondrocyttorganisasjon fra tidlig embryonal utvikling til sluttfase degenerasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

Intervertebral plate (IVD) degenerasjon er en ledende årsak til ryggsmerter, og det medfører en høy grad av svekkelse for de berørte individene. Å dekode plate degenerasjon og å kunne utvikle regenerative tilnærminger en grundig forståelse av cellulær biologi av IVD er viktig. Et aspekt av denne biologien som fortsatt er ubesvart, er spørsmålet om hvordan celler er romlig ordnet i en fysiologisk tilstand og under degenerasjon. De biologiske egenskapene til IVD og dens tilgjengelighet gjør dette vevet vanskelig å analysere. Den nåværende studien undersøker romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus fra tidlig embryonal utvikling til degenerasjon i sluttfasen. En optisk seksjoneringsmetode (Apotome) brukes til å utføre høyoppløselige fargingsanalyser ved hjelp av storfe embryonalt vev som dyremodell og humant skivevev hentet fra pasienter som gjennomgår ryggradskirurgi. Fra en svært høy kondrocytttetthet i den tidlige embryonale storfeskiven, reduseres antall celler under svangerskap, vekst og modning. I menneskelige plater fulgte en økning i cellulær tetthet utviklingen av vevsdegenerering. Som det allerede var demonstrert i leddbrusk, representerer klyngedannelse et karakteristisk trekk ved avansert platedegenerering.

Ved hjelp av mosaikkbilder kan arkitekturen til IVD med sitt tette kollagenfibernettverk i anulus og den mykere kjernen tydelig gjenkjennes (Figur 4). En kontinuerlig reduksjon i cellulær tetthet kan observeres under embryonal utvikling (Figur 5). Mens i de tidlige stadiene av IVD utvikling en celle tetthet på 11,435 celler / mm² i bovin anulus fibrosus og 17,426 celler / mm² i bovine kjernen pulposus kan bli funnet, Disse tallene reduseres raskt til 1011 ce...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Vi presenterer en metode for å undersøke romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus av mellomvirvelskiven ved hjelp av en optisk seksjoneringsmetode.

Optisk seksjonering og visualisering av mellomvirvelskiven fra embryonal utvikling til degenerasjon

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

Intervertebral Disc degenerasjon fører til høy grad av svekkelse og smerte. Vår protokoll lar oss undersøke morfologisk skiveutvikling og dens endringer i degenerasjon. Den tette kollagen type ett nettverk gjør det vanligvis vanskelig å analysere Intervertebral Disc ved mikroskopi.Med optisk seksjonering kan vi undersøke 3D-arrangementet av kondrocytter i de forskjellige vevene. Begynn med å plassere intraoperativt oppnådde, Intervertebral Disc- eller IVD-prøver i DMEM supplert med 2% volum etter volum Penicillin-Streptomycin, og 1,2% volum etter volum Amphotericin B, umiddelbart etter innsamling, lagre IVD-prøver ved fire grader Celsius til videre behandling. Hvis frossen opptining av de menneskelige IVD-prøvene ved romtemperatur og identifisere opprinnelsen til det menneskelige IVD-vevet basert på mikroskopiske egenskaper som; høyskoletetthet og orientering.For å samle bovint skivevev, ta bevegelsessegmentet som består av IVD med sine to tilstøtende ryggvirvler og bruk et kirurgisk blad nummer 15, disseker hele bovinskiven fra subkondralbenet, snu platen for å nå de sentrerte områdene. Etter å ha identifisert de forskjellige områdene av brusk, bruk et kirurgisk blad nummer 20 eller 22 for å kutte ut interesseområdet fra hele platen. IVDene fra storfeembryoer med en krone-rump lengde mindre enn 20 centimeter bør behandles uten disseksjon.Utførte avkalking av vevet som beskrevet i manuskriptet. Bekreft vellykket avkalking, hvis en 20 gauge nål trenger inn i skivevevet, eller hvis det er aktuelt, ryggvirvlene uten bemerkelsesverdig motstand. Nøyaktig vevsprøvene i det tifoldige volumet av 4% formaldehydoppløsning i PBS over natten ved fire grader Celsius.Neste dag plasserer du vevet i et vannløselig innbyggingsmedium på Cryotome-knappen, slik at enten et aksialplan eller et plan som vinkelrett kutter kollagentypen man normalt genereres. Bruk standard Cryotome til å seksjonere det innebygde vevet med en tykkelse på 70 mikrometer i menneskelige prøver og 40 mikrometer i storfeprøver. Samle seksjonene på en glasssklie før du skyller seksjonene tre ganger med PBS, tilsett et passende fluorescerende fargestoff etterfulgt av monteringsmediet og dekk seksjonene med en dekselglidning.Plasser et lysbilde med en flekkvevsseksjon på prøveholderen på florescensmikroskopet ved å starte strukturbelysningsenheten utfører enkelt synsfeltavbildning med fluorescerende filtre og tilstrekkelig belysning. Bruk en bildeoptimaliseringsprogramvare som er kompatibel med florescensmikroskopet, behandle bildene ved å optimalisere intensiteten og lysstyrken. For å visualisere delen som helhet, bruk mosaikkavbildningsteknikken ved å åpne de 60 oppkjøpsinnstillingene fra verktøylinjepanelet og justere mosaikkinnstillingene i mosaikkregisteret.For å gjøre dette definere antall kolonner og rader med synsfeltbilder som senere skal slås sammen til ett oversiktsbilde, trykker du på oppsett og justerer fokuskorrigeringen av individuelle fliser. Etterbehandle bildene ved å optimalisere intensiteten og lysstyrken. For å analysere den romlige kondrocyttorganisasjonen, bruk 3d-funksjonen som er innlemmet i programvaren ved å justere Z-stack-innstillingene med start / stopp-knappen, definer skanneparametrene som start- og stoppposisjoner i Z-aksen og stykkeavstanden.Identifiser individuelle cellulære mønstre og bruk en plugin-modul for celleantall for den kvantitative analysen av cellemønstrene, beregn celletettheten ved å dele de talte cellene med størrelsen på den valgte interesseområdet. Arkitekturen til IVD med sitt tette kollagenfibernettverk i annulus og den mykere kjernen kan gjenkjennes i mosaikkbildene tatt i det aksiale og sagittale planet. I forstørrede områder fra mosaikkbildene ble forskjellige romlige organisatoriske mønstre av kondrocytter som;enkeltceller, par og strenger lagt merke til.Studien av ulike utviklings- og modningsstadier av bovin annulus fibrose viste en kontinuerlig reduksjon i cellulær tetthet under embryonal diskutvikling. På den annen side ble det observert en økende cellulær tetthet og klyngedannelse i den voksne menneskelige platen under degenerasjon. Celletettheten i de tidlige stadiene av IVD-utviklingen i bovin annulus fibrose og bovin nucleus pulposus reduserte raskt til fødselen.Ved kanalavbildning av IVD med Epitome tillot visualisering av 3D-arkitekturen til de romlige mønstrene som cytoplasma og kjernen, i den intakte IVD-singelen samt par kondrocytter ble oppdaget. Mens i de degenererte anuluscelleklyngene ble funnet. Den mest utfordrende delen er å tildele vevet til opprinnelsen og å korrigere innebygd for seksjonering.Dette er viktig for å oppnå pålitelige resultater. Etter å ha riktig dissekert og valgt IVD-vev fra forskjellige stadier og opprinnelse, kan vi utdype analysen ved ytterligere biokjemisk og biomekanisk analyse, for eksempel ELISA eller atomkraftmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrking av Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere explants å teste for Cell Fate Commitment under embryonal utvikling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mus embryoutvikling i en Serum-fri Whole Embryo Kultur System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...