Name: optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration
Uploaded: 2021-07-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration at JoVE.com

Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo. Agradecemos a Charlotte Emma Bamberger por ayudar a adquirir las imágenes del apotoma.

Para el análisis del desarrollo embrionario y la maduración se utilizaron discos bovinos. Para evaluar la degeneración de la IVD, se analizaron muestras humanas.
El tejido IVD humano se obtuvo de pacientes sometidos a cirugía por degeneración del disco lumbar, prolapso de disco o trauma espinal en el Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tübingen y el Centro de Trauma BG Tübingen. La aprobación completa del comité ético se obtuvo antes del inicio del estu...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+horizontal+patterns+in+the+spatial+organization+of+superficial+zone+chondrocytes+of+human+joints.">Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints.</a> Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).</li><li>Felka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+spatial+organization+and+destruction+of+the+pericellular+matrix+in+early+osteoarthritis+in+vivo+and+in+a+novel+in+vitro+methodology.">Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).</li><li>Rolauffs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+preclinical+osteoarthritis:+the+angular+spatial+organization+permits+early+diagnosis.">Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).</li><li>Aicher, W. K., Rolauffs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+organization+of+joint+surface+chondrocytes:+review+of+its+potential+roles+in+tissue+functioning,+disease+and+early,+preclinical+diagnosis+of+osteoarthritis.">The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).</li><li>Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+death+after+mechanically+overloading+degenerated+human+intervertebral+disk+explants+is+associated+with+a+structurally+impaired+pericellular+matrix.">Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).</li><li>Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+classification+of+lumbar+intervertebral+disc+degeneration.">Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration.</a> Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).</li><li>Habermehl, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intervertebral+disc+from+embryonic+development+to+disc+degeneration:+insights+into+spatial+cellular+organization.">The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization.</a> The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).</li><li>Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. 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Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr.</a> Zeitschrift f&#252;r Tierz&#252;chtung und Z&#252;chtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).</li><li>Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleus+of+the+Intervertebral+Disc+from+Development+to+Degeneration1.">The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1.</a> American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+pathobiology+of+the+degenerate+intervertebral+disc+and+discogenic+back+pain.">The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain.</a> Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).</li><li>M&#252;llers, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+F-actin+alterations+in+adherent+human+mesenchymal+stem+cells:+Influence+of+slow-freezing+and+vitrification-based+cryopreservation.">Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation.</a> PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).</li><li>McCann, M. R., S&#233;guin, C. 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Utilizando microscopía de fluorescencia aumentada por imágenes de mosaico y seccionamiento óptico, evaluamos la disposición espacial de los condrocitos en el anillo de la IVD lumbar durante todo el desarrollo, la maduración y la degeneración. Si bien se podía extraer tejido degenerativo de pacientes que recibían cirugía de columna vertebral para la degeneración del disco, el análisis del período embrionario y la fase de maduración requería el uso de un organismo modelo (bovino). Se observaron altas densidad...

El disco intervertebral (IVD) es una estructura basada en cartílago que bioquímicamente y con respecto a la arquitectura celular, a primera vista, se asemeja en muchos aspectos al cartílago articular1. De hecho, tanto la degeneración ivD como la osteoartritis (OA) del cartílago articular se caracterizan por el estrechamiento del espacio articular debido al desgaste del cartílago, el quiste subcondral y la formación de osteofitos, y la esclerosis subcondral2,3. A pesar de estas aparentes similitudes, la arquitectura y el papel funcional de ambos tejidos difieren. Mientras que la matriz del cartílago articular está formada principalmente por una red de colágeno tipo II formadora de arcadas, la IVD consiste en tres tipos diferentes de tejido: el núcleo pulposo rico en colágeno tipo II en el centro toma cargas axiales y las transmite a un anillo abarcador de fibras circulares de colágeno tipo I densamente empaquetadas que se llama anulus fibrosus. Su función es absorber las presiones axiales traducidas recibidas por el núcleo rico en proteoglicanos y agua con su resistencia a la tracción de la fibra longitudinal. En la parte superior e inferior de cada núcleo y anillo, una placa terminal cartilaginosa hialina forma la unión con las vértebras adyacentes4 (Figura 1).
En el cartílago articular, se pueden encontrar cuatro patrones de condrocitos espaciales distintos: pares, cuerdas, cuerdas dobles, pequeños grupos grandes respectivamente5,6,7 (Figura 2). Los cambios en este patrón se asocian con el inicio y la progresión de la OA8,9. La organización espacial de los condrocitos también es indicativa de una propiedad funcional directa del cartílago, a saber, su rigidez, lo que subraya la relevancia funcional de este enfoque de clasificación basado en imágenes10,11. Estos patrones también se pueden identificar con la tecnología ya existente disponible clínicamente12. Debido a las similitudes entre el IVD y el cartílago articular, se puede plantear la hipótesis de que los patrones característicos de condrocitos también están presentes en el IVD. La formación de cúmulos es un fenómeno también observado en la IVD degenerada13,14.
Al tratar de analizar la organización celular espacial en la IVD, es necesario superar varias dificultades técnicas que no están presentes al investigar el cartílago articular:
En primer lugar, el procesamiento del tejido en sí es mucho más difícil que con el cartílago hialino homogéneo que se compone en gran parte de colágeno tipo II. El principal componente de fibra del IVD es el colágeno tipo I, lo que hace que sea mucho más difícil generar secciones histológicas delgadas. Mientras que en el cartílago articular hialino incluso las secciones gruesas se pueden analizar fácilmente debido a la naturaleza "similar al vidrio" del tejido, la red de colágeno tipo I de la IVD es ópticamente altamente impenetrable. Por esta razón, un fuerte ruido de fondo es un problema común en la histología de la IVD. Una forma rápida y barata de penetrar en este tejido ópticamente denso es el uso de un dispositivo de seccionamiento óptico, por ejemplo, por medio de un apotoma. En un apotoma de este tipo, se inserta una rejilla en la vía de iluminación de un microscopio de fluorescencia convencional. Frente a la rejilla se coloca una placa de vidrio plano-paralela. Esto se inclina hacia adelante y hacia atrás, proyectando así la cuadrícula en la imagen en tres posiciones diferentes. Para cada posición z, se crean y superponen tres imágenes sin procesar con la cuadrícula proyectada. Por medio de un software especial, se puede calcular la luz desenfocada. El principio subyacente es que, si la cuadrícula es visible, esa información está enfocada, si no se considera que está fuera de foco. Con esta técnica, se pueden adquirir imágenes bien enfocadas y de alta resolución en un tiempo razonable.
En segundo lugar, el tejido es difícil de obtener de donantes humanos. Al realizar un reemplazo total de rodilla, se puede obtener toda la superficie de la articulación para un análisis adicional durante la cirugía. Aunque la osteoartritis de una articulación diartrodial también es una enfermedad de toda la articulación, sin embargo, existen fuertes diferencias focales en la calidad del cartílago, con generalmente algunas áreas de la articulación aún intactas, por ejemplo, debido a la reducción de la carga en esa área. Esta situación es diferente en la IVD, donde la cirugía generalmente solo se realiza cuando el disco se destruye globalmente. Al obtener tejido de donantes humanos de la sala de operaciones, el tejido también está altamente fragmentado y es necesario asignar correctamente el tejido a uno de los tres tipos de cartílago de la IVD antes de realizar más análisis. Por lo tanto, para permitir análisis más detallados de secciones de tejido también más grandes y para analizar el desarrollo embrionario del IVD, es necesaria la elección de un organismo modelo animal.
Al elegir un organismo modelo de este tipo, es importante tener un sistema que sea comparable con el disco humano con respecto a su anatomía y dimensiones, su carga mecánica, la población celular actual y su composición tisular. Para el propósito de la técnica presentada aquí sugerimos el uso de tejido de disco lumbar bovino: Una propiedad crítica del disco humano que resulta en su bajo potencial regenerativo es la pérdida de células notacordales durante la maduración en el núcleo. Sin embargo, en numerosos organismos modelo se pueden detectar células notocordales durante toda su vida. La mayoría de los pocos animales que pierden sus células notacordales, como ovejas, cabras o perros condrodistrofijos, tienen un IVD que es mucho más pequeño que los discos humanos. Sólo los discos bovinos lumbares presentan un diámetro de disco sagital comparable a los de los IVD humanos15.
Un factor clave que conduce a la degeneración temprana del disco es la carga mecánica excesiva. Las presiones intradiscales de una vaca de pie en la columna lumbar son de alrededor de 0,8 MPa con la columna vertebral alineada horizontalmente. Sorprendentemente estas presiones son comparables a las presiones intradiscales lumbares reportadas para la columna vertebral humana erecta (0.5 MPa)15,16. También la cantidad de agua y proteoglicanos en los discos bovinos es comparable a la del IVD de humanos jóvenes17. Por lo tanto, aunque el patrón de movimiento real de los segmentos de movimiento puede diferir en los animales cuadrúpedos del humano bípedo, con respecto a la carga total y las características del disco, la vaca está mucho más cerca de la biología humana que otros modelos animales establecidos para la IVD, como ovejas y perros.
En este protocolo presentamos una técnica de cómo analizar los cambios en la IVD desde el punto de vista de la organización espacial de los condrocitos desde el desarrollo embrionario temprano hasta la degeneración terminal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>462000115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Actin Tracking Stain</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A57249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, US</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Germany</td>
			<td>41966052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>60004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>3834000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck KGaA,&#160; Germany</td>
			<td>104002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53a, with Cell counter plugin</td>
			<td>National Insittute of Health (NIH), US</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, US</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic Cover Glasses</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>01-1818/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Liquid Blocker</td>
			<td>Science Sevices&#160; GmbH, Germany</td>
			<td>N71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich,US</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>pf medical AG, Germany</td>
			<td>2023-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Netherlands</td>
			<td>SA6255012</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical sectioning and visualization of the intervertebral disc from embryonic development to degeneration

La degeneración del disco intervertebral (IVD) es una de las principales causas de dolor lumbar y conlleva un alto grado de deterioro para los individuos afectados. Para decodificar la degeneración del disco y poder desarrollar enfoques regenerativos es esencial una comprensión profunda de la biología celular de la IVD. Un aspecto de esta biología que aún permanece sin respuesta es la cuestión de cómo las células están organizadas espacialmente en un estado fisiológico y durante la degeneración. Las propiedades biológicas del IVD y su disponibilidad hacen que este tejido sea difícil de analizar. El presente estudio investiga la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso desde el desarrollo embrionario temprano hasta la degeneración en etapa terminal. Se aplica un método de seccionamiento óptico (Apotoma) para realizar análisis de tinción de alta resolución utilizando tejido embrionario bovino como modelo animal y tejido de disco humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía de columna. A partir de una densidad de condrocitos muy alta en el disco bovino embrionario temprano, el número de células disminuye durante la gestación, el crecimiento y la maduración. En los discos humanos, un aumento en la densidad celular acompañó la progresión de la degeneración tisular. Como ya se había demostrado en el cartílago articular, la formación de grupos representa un rasgo característico de la degeneración avanzada del disco.

Usando imágenes de mosaico, la arquitectura del IVD con su densa red de fibra de colágeno en el anillo y el núcleo más blando se puede reconocer claramente (Figura 4). Se puede observar una disminución continua de la densidad celular durante el desarrollo embrionario (Figura 5). Mientras que en las primeras etapas del desarrollo de la IVD se puede encontrar una densidad celular de 11.435 células/mm² en el anulus fibroso bovino y 17.426 células/mm² en el...

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Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Presentamos un método para investigar la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso del disco intervertebral utilizando un método de seccionamiento óptico.

Seccionamiento óptico y visualización del disco intervertebral desde el desarrollo embrionario hasta la degeneración

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

La degeneración del disco intervertebral conduce a un alto grado de deterioro y dolor. Nuestro protocolo nos permite investigar morfológicamente el desarrollo del disco y sus cambios en la degeneración. La red de colágeno denso tipo uno hace que generalmente sea difícil analizar el disco intervertebral por microscopía.Con la seccionamiento óptico, podemos investigar la disposición 3D de los condrocitos dentro de los diferentes tejidos. Comience colocando muestras de disco intervertebral o IVD obtenidas intraoperatoriamente en DMEM suplementadas con 2% volumen por volumen Penicilina-Estreptomicina y 1.2% volumen por volumen Anfotericina B, inmediatamente después de la recolección, almacene muestras de IVD a cuatro grados Celsius hasta su procesamiento posterior. Si se congela, descongele las muestras de IVD humanas a temperatura ambiente e identifique el origen del tejido de IVD humano en función de las propiedades microscópicas tales como; densidad y orientación universitarias.Para recolectar el tejido del disco bovino, tome el segmento de movimiento que consiste en el IVD con sus dos vértebras adyacentes y, utilizando una cuchilla quirúrgica número 15, diseccione todo el disco bovino del hueso subcondral, voltee el disco para llegar a las áreas centradas. Después de identificar las diferentes áreas del cartílago, use una cuchilla quirúrgica número 20 o 22 para cortar el área de interés de todo el disco. Los IVD de embriones bovinos con una longitud de corona-grupa inferior a 20 centímetros deben procesarse sin disección.Se realizó la descalcificación del tejido como se describe en el manuscrito. Confirme la descalcificación exitosa, si una aguja de calibre 20 penetra en el tejido del disco, o si corresponde en las vértebras sin resistencia notable. Exacta las muestras de tejido en el volumen diez veces mayor de solución de formaldehído al 4% en PBS durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, coloque el tejido en un medio de incrustación soluble en agua en la perilla del criotomo, de modo que normalmente se genere un plano axial o un plano que corte perpendicularmente el colágeno tipo uno. Utilice el criotomo estándar para seccionar el tejido incrustado a un grosor de 70 micrómetros en muestras humanas y 40 micrómetros en muestras bovinas. Recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio antes de enjuagar las secciones tres veces con PBS, agregue un tinte fluorescente adecuado seguido del medio de montaje y cubra las secciones con un resbalón de cubierta.Coloque una diapositiva con una sección de tejido de tinción en el soporte de muestra del microscopio de florescencia iniciando el dispositivo de iluminación de la estructura para realizar imágenes de un solo campo de visión con filtros fluorescentes e iluminación adecuada. Utilizando un software de optimización de imágenes compatible con el microscopio de florescencia, procese las imágenes optimizando la intensidad y el brillo. Para visualizar la sección en su conjunto, utilice la técnica de imagen de mosaico abriendo la configuración de adquisición de 60 desde el panel de la barra de herramientas y ajustando la configuración de mosaico en el registro de mosaicos.Para ello, defina el número de columnas y filas de imágenes de campo de visión que luego se fusionarán en una imagen general, presione configuración y ajuste la corrección de enfoque de mosaicos individuales. Post-procesar las imágenes optimizando la intensidad y el brillo. Para analizar la organización espacial de los condrocitos, utilice la función 3D incorporada en el software ajustando la configuración de la pila Z con el botón de inicio / parada, defina los parámetros de escaneo como las posiciones de inicio y parada en el eje Z y la distancia de corte.Identifique patrones celulares individuales y use un complemento de recuento de células para el análisis cuantitativo de los patrones celulares, calcule la densidad celular dividiendo las células contadas por el tamaño de la región de interés elegida. La arquitectura del IVD con su densa red de fibras de colágeno en el anillo y el núcleo más blando se puede reconocer en las imágenes de mosaico tomadas en el plano axial y sagital. En áreas ampliadas de las imágenes de mosaico, se observaron diferentes patrones organizativos espaciales de condrocitos como; células individuales, pares y cuerdas.El estudio de las diferentes etapas de desarrollo y maduración de la fibrosis anular bovina mostró una disminución continua de la densidad celular durante el desarrollo del disco embrionario. Por otro lado, se observó un aumento de la densidad celular y la formación de grupos en el disco humano adulto durante la degeneración. La densidad celular en las primeras etapas del desarrollo de ivD en la fibrosis del anillo bovino y el núcleo pulposo bovino disminuyó rápidamente hasta el nacimiento.Mediante imágenes de canal del IVD con el Epítome permitió visualizar la arquitectura 3D de los patrones espaciales como el citoplasma y el núcleo, en el IVD intacto único así como se detectaron pares de condrocitos. Mientras que en el anillo degenerado se encontraron grupos de células. La parte más desafiante es asignar el tejido a su origen y corregir el incrustado para la sección.Esto es esencial para obtener resultados confiables. Tener correctamente diseccionado y seleccionado el tejido IVD de diferentes etapas y orígenes nos permite profundizar en el análisis mediante análisis bioquímicos y biomecánicos adicionales, como el ELISA o la microscopía de fuerza atómica.

Research

JoVE Journal

Biology

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Limpieza y cuidado apropiado del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Investigación

Biología

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatizado de análisis óptico latido de los corazones pequeños

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

Una novela RFP reportero para ayudar en la visualización del disco imaginal del ojo en Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...