Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

تم تمويل العمل الموصوف هنا من قبل شركة فينا Biosolutions ذ.م.م.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

أندرو ليس هو مؤسس ومالك فينا Biosolutions. وهو يحمل العديد من براءات الاختراع المتعلقة بكيمياء CDAP ويستفيد من ترخيص الكيمياء والدراية اقتران CDAP.

CDAP هو كاشف مريحة ل derivatize وترافق السكريات. توضح هذه المقالة الأسلوب العام لاستخدام CDAP اشتقاق السكريات مع الهيدرازيدات (PS-ADH) ويتضمن التحسينات المنشورة مؤخرا8. أولا، تؤكد التقنية على أهمية الحفاظ على الرقم PH الهدف للتحكم في عملية التنشيط. وجدنا أنه في حين أن العديد من المخازن المؤقتة المشتركة تتداخل مع رد فعل تنشيط CDAP ، يمكن استخدام DMAP بنجاح كعازل لإدارة درجة الحموضة8. وعلاوة على ذلك، DMAP هو بالفعل نتيجة ثانوية رد فعل لتفعيل CDAP. وأخيرا، التخزين المؤقت حل السكريات مع DMAP قبل إضافة CDAP يسهل الاستهداف الدقيق والحفاظ على درجة الحموضة رد الفعل. كما نقوم بوصف ذلك، من المفيد ضبط درجة الحموضة في محلول مخزون DMAP المركز بحيث عندما يتم تخفيفه، يصل إلى درجة الحموضة المستهدفة. ثانيا، أدى أداء العملية في البرد إلى إبطاء وقت التفاعل، مما جعل عملية التنشيط أقل جنونا وأكثر تسامحا. انخفاض درجة الحرارة انخفض معدل التحلل المائي CDAP، ووقت التنشيط الأمثل في درجة الحموضة 9 يزيد من ~ 3 دقيقة إلى ~ 15 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب CDAP أقل لتحقيق نفس المستوى من التنشيط مما كانت عليه عند تنفيذها في درجة حرارة الغرفة. 
يمكن اقتران السكريات المشتقة من ADH بالبروتينات باستخدام الكاربيديميدات (على سبيل المثال، EDAC)7. على سبيل المثال، تستخدم العديد من لقاحات الأنفلونزا الهيموفلوس B (Hib) المرخصة فوسفات البولي ريبوسيلريبيتولات (PRP) المشتق من ADH للترافق مع توكسويد الكزاز باستخدام EDAC. تم استخدام CNBr في البداية ، ولكن CDAP هو كاشف أسهل بكثير لاستخدامه لهذا الغرض. في تجربتنا، مجموعة أهداف جيدة ل ADH اشتقاق هو 10-30 هيدرازيد لكل 100 كيلودا البوليساكريد أو ~ 1-3٪ ADH حسب الوزن. 
ويمكن استخدام نفس العملية لاستخلاص السكريات مع الأمينات الأولية عن طريق استبدال ADH لديامين. فمن المستحسن استخدام الهيكسان ديامين ل derivatize السكريات مع الأمينات8. يمكن اقتران البوليساكريد الأميني (PS-NH2)باستخدام الكواشف المطورة لالترابط البروتيني11. عادة، يتم اشتقاق PS-NH2 مع maleimide (على سبيل المثال، succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (SMCC) أو N-γ-ماليميدوبوترييل-أوكسيسوتشينيميد استر (GMBS))، ويتم ثيولاتيد البروتين (على سبيل المثال، مع succinimidyl 3-(2-بيريديلديثيو)بروبيونات (SPDP)). كيمياء ثيول ماليميد فعالة جدا.
ويمكن أيضا أن يقترن مباشرة البروتينات إلى السكريات البوليساكريد CDAP تنشيط عن طريق ɛ أمين على اليسينات. في حين أن بروتوكول التنشيط المستخدم يشبه بشكل عام البروتوكول الموضح هنا ، فمن الضروري تحسين مستوى التنشيط والبوليساكاريد وتركيز البروتين ، وكذلكنسبةالبروتين: البوليساكريد 5و6و8.
Dextran هي واحدة من أسهل السكريات لتنشيط مع CDAP نظرا لكثافة عالية نسبيا من مجموعات الهيدروكسيل، ولكن بعض السكريات، مثل مستضد Vi، يمكن أن يكون تحديا. وبالتالي، لا يوجد بروتوكول "أفضل" واحد لإقران CDAP مباشرة بالبروتينات. نقترح أولا تطوير بروتوكول لتحقيق مستويات مناسبة من التنشيط ، كما يحددها مدى اشتقاق الهيدرازيد ، ثم الشروع في توجيه اقتران البروتين إلى البوليساكريد المنشط CDAP.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

اللقاحات المصاحبة، مثل تلك التي تتكون من السكريات المتعددة المرتبطة بشكل مشترك إلى بروتين الناقل، هي من بين التقدم الملحوظ في علم اللقاحات1،2. السكريات، كما مستضدات تي الخلية المستقلة، هي المناعة سيئة في الرضع ولا تحفز الذاكرة، والتحول الطبقي، أو نضوج تقارب الأجسام المضادة3. يتم التغلب على أوجه القصور هذه في اللقاحات متعددة الشاريد المصاحبة4. وبما أن معظم السكريات ليس لديها مقبض كيميائي مناسب للإترافق ، فيجب أولا أن تكون تفاعلية أو "نشطة". ثم يتم ربط البوليساكريد المنشط إما مباشرة مع البروتين (أو البروتين المعدل) أو يتم تفعيله للحصول على اشتقاق إضافي قبل اقتران4. تستخدم معظم اللقاحات المرخصة متعددة الشاريد المصاحبة إما الأمينية الاختزالية أو السيانيل لتنشيط هيدروكسيلات البوليساكريد. بروميد السيانوجين (CNBr)، وهو كاشف كان يستخدم في السابق لتنشيط راتنجات الكروماتوغرافيا، كان يستخدم في البداية لاستخلاص الشاريد المتعدد. ومع ذلك، يتطلب CNBr درجة الحموضة عالية، عادة ~ درجة الحموضة 10.5 أو أكثر، لإلغاء بروتونات جزئيا هيدروكسيلات البولي ساكريد بحيث تكون نوكليوفليك بما فيه الكفاية لمهاجمة مجموعة سيانو. ارتفاع درجة الحموضة يمكن أن تكون ضارة ل polysaccharides قاعدة labile، ولا CNBr ولا السيانو-إستر النشطة التي تشكلت في البداية مستقرة بما فيه الكفاية في مثل هذا درجة الحموضة العالية.
CDAP (1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات; الشكل 1) وقدم من قبل Lees وآخرون لاستخدامها كعامل cyanylating لتفعيل السكريات5،6. تم العثور على CDAP ، وهو بلوري وسهل التعامل معه ، لتنشيط السكريات عند درجة الحموضة أقل من CNBr ومع ردود فعل جانبية أقل. على عكس CNBr ، يمكن ربط السكريات المتعددة المنشطة CDAP مباشرة بالبروتينات ، مما يسهل عملية التوليف. يمكن تشغيل السكريات المتعددة المنشطة CDAP مع ديامين (على سبيل المثال، الهيكسان ديامين) أو ديهيدرازيد (على سبيل المثال، ديهيدرازيد الديديبيك، ADH) لصنع السكريات الأمينية أو المشتقة من الهيدرازيد. يتم استخدام تركيز عال من الكاشف المثلي لقمع الربط المتبادل بين السكريات. يمكن بعد ذلك اقتران السكريات الأمينية باستخدام أي من التقنيات التي لا تعد ولا تحصى المستخدمة في اقتران البروتين. وغالبا ما تقترن السكريات المشتقة من هيدرازايد إلى البروتينات باستخدام كاشف كاربوديميد (على سبيل المثال، 1-إيثيل-3-(3-dimethylaminopropyl)كاربوديميد (EDAC))7. وقد وصف المزيد من التحسين لتفعيل CDAP polysaccharide من قبل Lees et al.8 ويتم دمجها في البروتوكول الموصوف هنا.
نظرة عامة على اقتران CDAP يمكن تصور بروتوكول CDAP على أنه مرحلتين: (1) تنشيط البوليساكريد و (2) اقتران البوليساكريد المنشط ببروتين أو ليغند(الشكل 2). الهدف من الخطوة الأولى هو تنشيط السكريات بكفاءة ، في حين أن الهدف من الثانية هو اقترانها بكفاءة مع البوليساكريد المنشط. يربط تعدد الشاريد المنشط بين الخطوتين معا. ويساعد هذا التصور على التركيز على العناصر الحاسمة لكل خطوة. الشكل 2 يتوسع في هذا التصور ، مما يدل على التنشيط المطلوب وتفاعلات اقتران ، جنبا إلى جنب مع ردود الفعل التحلل المائي وردود الفعل الجانبية.
خلال مرحلة التنشيط ، والشواغل الرئيسية الثلاثة هي استقرار CDAP ، رد فعل CDAP مع هيدروكسيلات البوليساكريد ، واستقرار البوليساكريد المنشط(الشكل 3). يزداد التحلل المائي CDAP مع درجة الحموضة ، كما يفعل التحلل المائي للبوليساكريد المنشط وردود الفعل الجانبية. ومع ذلك، يتم تسهيل رد فعل CDAP مع البوليساكريد بزيادة درجة الحموضة. يتطلب تنشيط السكريات بكفاءة مع CDAP توازنا بين 1) تفاعل البوليساكريد وCDAP و 2) التحلل المائي وردود الفعل الجانبية لكل من الكاشف وبوليساكريد المنشط.
في بروتوكول تفعيل CDAP الأصلي الذي وصفه Lees et al.5، تم تنشيط CDAP من السكريات في درجة حرارة الغرفة في محلول درجة الحموضة 9 غير المكتبر. تم العثور على معدل التنشيط ليكون سريعا في ظل هذا الشرط، وسوف يكون التنشيط كاملة في غضون 3 دقائق. ورافق رد الفعل أيضا التحلل المائي السريع للCDAP، مما تسبب في انخفاض درجة الحموضة السريع من محلول رد الفعل غير المكتبر. وكان من الصعب رفع درجة الحموضة بسرعة والحفاظ عليها عند القيمة المستهدفة في مثل هذا الإطار الزمني القصير. في البروتوكول الموصوف، تم تنفيذ التنشيط عن طريق إضافة CDAP من محلول مخزون 100 ملغم/مل إلى محلول السكرييد غير المحشو. تم رفع رقم الحموضة 30 ق في وقت لاحق مع "حجم متساو من 0.2 M تريثيلامين". ثم أضيف البروتين الذي سيتم اقترانه بعد 2.5 دقيقة إلى رد فعل التنشيط. وتجدر الإشارة إلى أن الرقم الحموضة لخطوة التنشيط لم يكن مسيطرا عليه بشكل جيد، ومن المرجح أن يكون قد تجاوز الرقم PH المستهدف في البداية. رد الفعل السريع الذي يتطلب تعديل درجة الحموضة الفوري جعل عملية التنشيط صعبة للسيطرة وصعبة لتوسيع نطاق.
وعلى النقيض من البروتوكول الأصلي، فإن البروتوكول المعدل الموصوف هنا له تحسينان رئيسيان. أولا، يتم ضبط الرقم الحموضة لحل السكريات قبل لاستهداف الرقم الحموضة التنشيط، وذلك باستخدام DMAP كمخزن مؤقت، قبل إضافة CDAP. DMAP لديه pKa من 9.5 وبالتالي لديه قوة التخزين المؤقت جيدة حول pH 9، وخلافا للعديد من المخازن المؤقتة الأخرى، لم يتم العثور على DMAP لتعزيز التحلل المائي CDAP8. وعلاوة على ذلك، DMAP هو بالفعل عملية وسيطة، وبالتالي لا يضيف عنصرا جديدا إلى خليط رد الفعل. قبل ضبط درجة الحموضة قبل إضافة CDAP يزيل أرجوحة درجة الحموضة الكبيرة في بداية رد الفعل ويسمح لصيانة أكثر كفاءة من الرقم الحموضة المستهدفة أثناء رد الفعل. التحسين الثاني هو إجراء رد فعل التنشيط عند 0 درجة مئوية ، حيث يكون معدل التحلل المائي CDAP أبطأ بشكل ملحوظ من ذلك في درجة حرارة الغرفة. مع فترة نصف عمر الكاشف الأطول عند 0 درجة مئوية ، يتم زيادة وقت التنشيط من 3 دقائق إلى 15 دقيقة للتعويض عن معدل التنشيط الأبطأ في درجة الحرارة المنخفضة. وقت رد الفعل الأطول، بدوره، يجعل من الأسهل للحفاظ على درجة الحموضة رد الفعل. كما يؤدي استخدام 0 درجة مئوية إلى إبطاء تدهور السكريات الحساسة ل درجة الحموضة، مما يجعل من الممكن إعداد اقترانات لهذا النوع من السكريات. التحسينات في البروتوكول تجعل عملية التنشيط أقل المحمومة، وأسهل للسيطرة، وأكثر استنساخها، وأكثر قابلية لتوسيع نطاق.
توضح هذه المقالة البروتوكول المحسن لتنفيذ تنشيط CDAP للبوليساكريد في 0 درجة مئوية وعلى درجة الحموضة الهدف المحدد وتنفيذ اشتقاق اللاحقة من السكريات المنشطة مع ADH. كما هو وصفها هو حمض كبرتونيك trinitrobenzene (TNBS) المقايسة، استنادا إلى طريقة تشيوآخرون. كما يوصف أيضا المقايسة المعدلة للهيكسوس على أساس ريسورسينول وحمض الكبريتيك10، والتي يمكن استخدامها لتحديد مجموعة أوسع من السكريات. لمزيد من المعلومات حول تفعيل CDAP و اقترانها، القارئ يشار إلى المنشورات السابقة5،6،8 من قبل Lees وآخرون.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

اللقاحات المصاحبة هي تقدم ملحوظ في علم اللقاحات. لإعداد اللقاحات المترافقة مع السكريات المتعددة، يمكن تشغيل السكريات بشكل ملائم وربطها بالبروتينات الناقلة لللقاحات باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين رباعي فلوريدين (CDAP)، وهو كاشف سيانيلاتينغ سهل المعالجة. CDAP ينشط السكريات عن طريق التفاعل مع مجموعات هيدروكسيل الكربوهيدرات في PH 7-9. الاستقرار والتفاعل من CDAP تعتمد بدرجة عالية على درجة الحموضة. انخفاض درجة الحموضة من رد الفعل أيضا أثناء التنشيط بسبب التحلل المائي للCDAP، مما يجعل درجة الحموضة جيدة السيطرة على مفتاح لتنشيط استنساخها. تم تنفيذ بروتوكول تنشيط CDAP الأصلي في درجة حرارة الغرفة في حلول درجة الحموضة 9 غير المكتومة.
بسبب رد الفعل السريع في ظل هذه الحالة (<3 دقيقة) وانخفاض الرقم الحموضة السريع المصاحب من التحلل المائي السريع CDAP ، كان من الصعب ضبط درجة الحموضة المستهدفة والحفاظ عليها بسرعة في الإطار الزمني القصير. يتم تنفيذ البروتوكول المحسن الموصوف هنا عند 0 درجة مئوية ، مما يبطئ التحلل المائي CDAP ويمدد وقت التنشيط من 3 دقائق إلى ~ 15 دقيقة. كما تم استخدام Dimethylaminopyridine (DMAP) كمخزن مؤقت لضبط حل السكريات مسبقا إلى الرقم الحموضة لتنشيط الهدف قبل إضافة كاشف CDAP. وقت رد الفعل أطول، إلى جانب تحلل هيدروليسيس CDAP أبطأ واستخدام المخزن المؤقت DMAP، يجعل من الأسهل للحفاظ على درجة الحموضة التنشيط لكامل مدة عملية التنشيط. البروتوكول المحسن يجعل عملية التنشيط أقل المحمومة، وأكثر استنساخا، وأكثر قابلية للتوسع.

لتوضيح تفعيل واشتقاق البوليساكريد باستخدام كيمياء CDAP ، تم تنشيط dextran في 0.25 و 0.5 ملغ CDAP / ملغ dextran. لكل رد فعل، تم تبريد محلول ديكتران 10 ملغم/مل في الماء على الجليد، وأضيف المجلد1/10 من مخزون DMAP 2.5 M (الذي تم إعداده كما هو موضح في القسم 3). تم جلب الحل النهائي إلى درجة الحموضة 9 بإضافة 0.1 M NaOH في 10 ميكرولتر aliquots. وأضاف CDAP أن الحل كان مبردا ومثارا، وحافظت درجة الحموضة على درجة الحموضة 9 بإضافة 10 ميكرولتر aliquots من 0.1 M NaOH لمدة 15 دقيقة.
ثم تم الاتصال ب dextran المسمى بشكل تسلسلي مقابل 1 M NaCl و 0.15 M NaCl والمياه كما هو موضح في القسم 6. ثم تم فحص ADH-dextran لdxtran باستخدام المقايسة حمض ريسورسينول / الكبريتيك (القسم 7.2). يظهر منحنى قياسي نموذجي باستخدام الجلوكوز كمعيار السكر في الشكل 4A. تم تحديد محتوى الهيدرازيد باستخدام المقايسة TNBS الموضحة في القسم 7.3. منحنى معياري نموذجي للهيدرازيد باستخدام ADH كما هو معطى المعيار في الشكل 4B.
تظهر الحسابات التمثيلية من تنشيط dextran على مستويي التنشيط في الشكل 4A، B. يتم تقديم البيانات على أنها هيدرازيدس لكل 100 كيلودا من البوليمر ديكتران وكوزن في المئة من ADH إلى dextran، كما هو موضح في القسمين 7.9.3.4 و 7.9.3.5، على التوالي، في الشكل 4C. وتضاعفت درجة الاشتقاق تقريبا مع تضاعف نسبة CDAP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> الشكل 1: التركيب الكيميائي للCDAP. CDAP = 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> الشكل 2: عملية تفعيل CDAP و اقترانها. وتنقسم العملية من الناحية المفاهيمية إلى مرحلتين، مع البوليساكريد المنشط المشترك بين كليهما. في ظل الظروف الأساسية، CDAP ينشط هيدروكسيلات السكريد، والإفراج عن DMAP (رد فعل 1). كما يصدر التحلل المائي CDAP DMAP (رد الفعل 3). على الرغم من أن يظهر سيانو-استر، وهذا قد لا يكون الوسيط الفعلي. المتوسط هو، لذلك، يشار إلى (CDAP) "تنشيط" البوليساكريد. خلال مرحلة التنشيط الأولى ، يمكن للبوليساكريد المنشط التحلل المائي (رد الفعل 4) أو الخضوع لتفاعلات جانبية (رد الفعل 5). في مرحلة اقتران الثاني (رد فعل 2), يتفاعل البوليساكريد المنشط مع أمين لتشكيل رابطة ايسوريا مستقرة بالإضافة إلى ردود الفعل 4 و 5. المختصرات: CDAP = 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين رباعي فلوريدورات; DMAP = 4-ديميثيلامينوبيريدين; R-NH2 = أمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> الشكل 3:تفعيل CDAP و اقترانها. تتطلب العملية موازنة التفاعل CDAP مع البوليساكريد واستقرار CDAP وبوليساكريد المنشط ، وكذلك التفاعل بين البوليساكريد المنشط وبوليساكريد المنشط مع أمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> الشكل 4: النتائج التمثيلية لتفعيل CDAP من dextran. منحنيات قياسية نموذجية ل (A) ريسورسينول / حامض الكبريتيك و (B) TNBS المقايسات. تظهر نتائج الفحص لdxtran تفعيلها مع 0.25 و 0.5 ملغ CDAP / ملغ dextran. تم استخدام الجلوكوز كمعيار لالقايس ريسورسينول. Dextran, في ملغ / مل, وينقسم إلى 100 كيلودا لإعطاء تركيز الضرس. يتم تحديد تركيز الهيدرازيد باستخدام ADH كمعيار والنتائج المعبر عنها على أنها μM Hz. (C) حساب الهيدرازيد: نسب الدكستران. تم حساب مستوى الاشتقاق على أنه هيدرازيدات لكل 100 كيلودا من ديكتران لتسهيل المقارنة بين البوليمرات من الأوزان الجزيئية المتوسطة المختلفة. تم حساب نسبة الوزن ل g ADH/g dextran باستخدام ميغاواط من 174 جم/مول ل ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

يمكن ربط البروتينات والليجانات المحتوية على الأمين بشكل مشترك بالبوليساتتشاريدات التي ينشطها كاشف السيانيل، 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات (CDAP)، لتشكيل البروتين التساهمي (ليغاند) -polysaccharide المصاحبة. توضح هذه المقالة بروتوكول محسن لتنفيذ تنشيط CDAP الخاضعة للرقابة عند 0 درجة مئوية و درجة الحموضة متفاوتة وإجراء اقتران اللاحقة من السكريات المنشطة.

تفعيل وارتقاط السكريات المتعددة القابلة للذوبان باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين تترافلوروبورات (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

السكريات ضعيفة المناعة ما لم ترتبط البروتين وتحتاج إلى تفعيلها لاستخلاص أو اقتران البروتينات. في هذه الطريقة، يستخدم CDAP كموشف شحن الرمل. يقوم CDAP بتنشيط هيدروكسيلات السكريات المتعددة من أجل اشتقاقها أو ربطها بالبروتينات لاستخدامها في اللقاحات أو الكواشف التشخيصية.وقد حلت CDAP إلى حد كبير محل بروميد السيانوجين ككواشف شحن رملية متعددة الشاريد. CDAP هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها في درجة الحموضة أقل من بروميد السيانوجين. إنه كاشف تنشيط أفضل بكثير.يمكن استخدام CDAP مع معظم السكريات ، على عكس الأمينات الاختزالية ، والتي تتطلب هيدروكسيلات محيطية. يمكن استخدام الكيمياء للترافق بشكل مباشر وغير مباشر مع البروتينات ، ويمكن استخدامها لصنع الكواشف التشخيصية. وكان رد فعل تنشيط CDAP، كما هو موضح في الأصل، سريعا جدا ويصعب التحكم فيه.البروتوكول المقدم هنا يجعل الكيمياء أسهل بكثير لأداء وأكثر من ذلك بكثير استنساخها. قبل البدء في التجربة، ضبط درجة الحموضة من محلول السكريات إلى 9 بإضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون dimethylaminopyridine بطريقة دروبية أثناء التحريك. الحفاظ على رد الفعل المبردة في حمام الماء المثلج لكامل عملية التنشيط.المضي قدما مع سيانو-dimethylaminopyridine-tetrafluoroborate أو CDAP التنشيط عن طريق نقل 100 ميكرولتر من CDAP إلى محلول البوليساكريد أثناء التحريك. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت ومراقبة تغيير رقم الحموضة أثناء التنشيط بأكمله لمدة 15 دقيقة. الحفاظ على رد الفعل عند درجة الحموضة المستهدفة عن طريق إضافة 10 زيادات ميكرولتر على الفور من هيدروكسيد الصوديوم المولر 0.1.عند الوصول إلى وقت التنشيط الأمثل، أضف ملليلترين من 0.5 ديهيدرازيد الديهيدراك المولاري في آن واحد إلى البوليساكريد المنشط. تحقق من أن رقم الحموضة في النطاق المطلوب لوظيفية الهيدروكسيد. بعد التحريك المستمر لخليط التفاعل لمدة ساعة واحدة على الأقل ، نقل خليط التفاعل إلى أربع درجات مئوية.لتقليل تركيز ADH من المنتج، قم بطلب محلول السكريات المشتقة من الزيت الخام باستخدام جهاز غسيل الكلى. استعادة السكريات المشتقة من غسيل الكلى وتحديد تركيز السكريات والهيدرازيد لحساب نسبة الهيدرازيد إلى السكريات. إعداد مليغرام واحد لكل ملليلتر محلول السكريات المتعددة غير المعدلة لاستخدامها كمعيار.سخني كتلة التدفئة إلى 140 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لتحقيق درجة حرارة موحدة مستقرة. استخدم وسادة واقية تحت كتلة التدفئة المحيطة بها في حالة انسكاب الحمض. إضافة كميات متفاوتة من مليغرام واحد لكل ملليلتر معيار الكربوهيدرات إلى المسمى 13 في 100 أنابيب اختبار borosilicate في ثلاثية الليكات، وتختص حجم إلى 100 ميكرولتر مع الماء لتحقيق التركيزات القياسية المطلوبة.وبالمثل، قم بإعداد عينات من المقايسات بإضافة وحدة تخزين تحتوي على خمسة ميكروجرامات من السكرييد المشتق إلى ثلاثة أنابيب عينة. إضافة 100 ميكرولتر من ستة ملليغرام أعدت حديثا لكل resorcinol ملليلتر إلى كل أنبوب. باستخدام ماصة تكرار، إضافة 300 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 75٪ المعدة إلى كل أنبوب، دوامة الأنابيب بقوة، مشيرا إلى أنبوب بعيدا، ثم وضع جميع الأنابيب في كتلة سخان بوتيرة ثابتة في ترتيب تسلسلي وتعيين على الفور الموقت لمدة ثلاث دقائق.في ثلاث دقائق، قم بإزالة الأنابيب بنفس الترتيب ووضعها مباشرة في رف في حمام ماء جليدي. إزالة أنابيب الجليد الباردة للسماح لهم بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قراءة امتصاص جميع الأنابيب على مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس في 430 نانومتر باستخدام cuvette طول المسار 10 ملليمتر.لإعداد تفاعلات المقايسة، قم بفرز وترتيب الأنابيب القياسية المسماة في رف الأنبوب من أجل زيادة التركيز. باستخدام micropipette معايرة، إضافة 100 ميكرولتر من المعايير إلى كل أنبوب المقابلة. بالنسبة لمعيار الصفر، استخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.وبالمثل، إعداد وترتيب أنابيب العينة. ثم باستخدام معايرة 1، 000 ميكرولتر micropipette، إضافة 875 ميكرولتر من العازلة المقايسة لجميع أنابيب المقايسة. لبدء رد فعل المقايسة، أضف 25 ميكرولتر من حمض الكبريتون trinitrobenzene 1٪ إلى كل أنبوب مقايسة بالترتيب المحدد مسبقا في غضون خمس دقائق.دوامة أنابيب المقايسة لمدة ثانيتين بسرعة عالية، والتأكد من أن دوامات السائل إلى ارتفاع نصف بوصة من فتح أنبوب. تسجيل وقت بدء المقايسة وتعيين جهاز ضبط الوقت إلى ساعتين. ثم ضع رف أنبوب المقايسة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.عندما ينتهي الوقت، دوامة الأنابيب والمضي قدما في جمع البيانات. تم فحص ديكتران ADH لdxtran باستخدام المقايسة حمض الكبريتيك ريسورسينول. تم رسم أنبوب قياسي نموذجي يستخدم الجلوكوز كمعيار السكر.تم تحديد محتوى الهيدرازيد في السكريات المشتقة أو ديكستران باستخدام المقايسة TNBS. تم حساب مستوى الاشتقاق على أنه هيدريد لكل 100 كيلودالتون من الدكستران لتسهيل المقارنة بين البوليمرات من الأوزان الجزيئية المتوسطة المختلفة. قد يحتاج البروتوكول الموضح هنا إلى تكييفه لبوليساكريد محدد.يمكن استخدام كيمياء CDAP لإضفاء الطابع الوظيفي على السكريات المتعددة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الكواشف المقترنة. ويمكن استخدامه، على سبيل المثال، لتعدد السكريات البيوتينيلات للاستخدام في ELISAs. يمكن ربط البروتينات مباشرة بالبوليساكتشاريدات المنشطة من CDAP ، ولكن هذا يتطلب عادة بعض التحسين لبوليساكريد محدد.يمكن أن يكون العائد اقتران أكثر من 75٪ وقد مكن استخدام الكيمياء CDAP اللقاحات ذات التكلفة المنخفضة اقتران، مثل تلك التي أدلى بها، على سبيل المثال، من قبل معهد المصل في الهند.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

الكشف عن نشاط تنظيم سياليداز Neu1 في اتصال مثل تنشيط مستقبلات

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

نظام خلية الفحص مجاني تقدير تحييد القدرات من GM - CSF جسم باستخدام المؤتلف ذوبان GM - CSF مستقبلات

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

قعدة اختبار لتنشيط التحقيق في إيج بوساطة آليات في فرط الحساسية للمخدرات

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...