Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
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<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

安德鲁·李斯是菲娜生物解决方案的创始人和所有者。他拥有多项与CDAP化学相关的专利，并受益于化学和CDAP结合知识的许可。

CDAP 是一种方便的试剂，可衍生和结合多糖。本文描述了使用CDAP用水合物（PS-ADH）衍生多糖的一般方法，并结合了最近发表的改进8。首先，该技术强调保持目标pH值以控制激活过程的重要性。我们发现，虽然许多常见的缓冲器干扰CDAP激活反应，DMAP可以成功地用作缓冲管理pH8。此外，DMAP 已经是 CDAP 激活的副产品。最后，在添加 CDAP 之前，用 DMAP 缓冲多糖溶液有助于精确定位和维护反应 pH 值。正如我们描述的那样，调整集中的 DMAP 库存解决方案的 pH 值是有用的，这样当稀释时，它就会达到目标 pH 值。其次，在寒冷中执行过程减慢了反应时间，使激活过程不那么狂热和宽容。较低的温度降低了 CDAP 水解率，pH 9 的最佳激活时间从 +3 分钟增加到 ±15 分钟。此外，与在室温下执行时相比，实现相同激活水平所需的 CDAP 更少。 
ADH衍生的多糖可以与使用碳水化合物（例如EDAC）7的蛋白质结合。例如，几种获得许可 的流感嗜血杆菌 b （Hib） 疫苗使用与 ADH 衍生的多脂乙酰磷酸盐 （PRP） 使用 EDAC 与破伤风毒素结合。CNBr 最初被雇用，但 CDAP 是一种更容易用于此目的的试剂。根据我们的经验，ADH 衍生化的良好目标范围是每 100 kDa 多糖 10-30 水合物或按重量分乘 +1-3% ADH。 
同样的过程可以用来用原胺代替ADH来提取多糖与原胺。建议使用六烷二胺将多糖与胺8一起提取。聚糖（PS-NH2）可以使用为蛋白质结合11开发的试剂进行结合。通常，PS-NH2 是用雄胺（例如，磺胺 4-[N-雄性甲基甲基] 环氧烷-1-碳基酸盐 （SMCC） 或 N-γ-马莱米多-氧西尼酰胺酯 （GMBS） 来衍生的，蛋白质是硫化的（例如， 与苏奇尼米尔 3 - （2 - 皮里迪尔迪西奥） 丙酸酯 （SPDP）。硫磺胺化学是非常有效的。
蛋白质也可以通过莱辛酸上的亚胺直接与CDAP激活的多糖耦合。虽然使用的激活协议通常与此处描述的方案相似，但有必要优化活化水平、多糖和蛋白质浓度，以及蛋白质：多糖比 5、6、8。
Dextran 是最容易用 CDAP 激活的多糖之一，因为它的羟基组密度相对较高，但一些多糖，如维抗原，可能具有挑战性。因此，没有单一的"最佳"协议，CDAP直接结合蛋白质。我们建议首先制定一个协议，以达到适当的激活水平，由水合物衍生化程度决定，然后着手将蛋白质结合直接引向CDAP激活的多糖。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

结合疫苗，如那些由多糖共同与载体蛋白共同组成的疫苗，是疫苗学1，2的显著进展之一。多糖作为T细胞独立的抗原，在婴儿中免疫力差，不会诱导记忆、类切换或抗体的亲和力成熟。这些缺点在多糖结合疫苗4中得到克服。由于大多数多糖没有方便的化学处理来结合，因此必须首先对它们进行反应或"激活"。然后，激活的多糖直接与蛋白质（或改性蛋白质）连接，或在结合4之前功能化，以进行额外的分化。大多数获得许可的多糖结合疫苗使用还原性凝结或氰化来激活多糖羟基。氰化物溴化物（CNBr）是一种试剂，以前曾用于激活色谱树脂，最初用于多糖衍生。然而，CNBr 需要高 pH 值（通常为 + pH 10.5 或更高）来部分脱质多糖羟基，以便它们足够嗜核，能够攻击氰化物组。高pH值可能不利于碱性实验室多糖，CNBr和最初形成的活性氰化物在如此高的pH值下都不够稳定。
CDAP （1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟化物;图1）由李斯等人介绍，用作氰化剂，用于激活多糖5，6。CDAP 是结晶的，易于处理，被发现以低于 CNBr 的 pH 值激活多糖，并且侧反应更少。与 CNBr 不同，CDAP 激活的多糖可以直接与蛋白质结合，简化合成过程。CDAP 激活的多糖可以使用二胺（例如六烷二胺）或二氢酰胺（例如，二氢化二胺、ADH）功能化，以制造氨基或氢化物衍生的多糖。同位素高浓度用于抑制多糖的交联。然后，氨基多糖可以使用用于蛋白质结合的无数技术进行结合。海德拉齐德衍生的多糖通常与使用碳水化合物试剂（例如，1-乙基-3-（3-二甲基丙基）碳水化合物酰胺（EDAC）7的蛋白质耦合。Lees 等人8描述了 CDAP 多糖激活的进一步优化，并已纳入此处描述的协议中。
CDAP 结合概述 CDAP 协议可概念化为两个阶段：（1） 多糖的激活和 （2） 活化多糖与蛋白质或配体的结合（图 2）。第一步的目标是高效激活多糖，而第二步的目标是有效地与激活的多糖结合。激活的多糖将两个步骤连在一起。这种概念化有助于专注于每个步骤的关键要素。 图2 扩展了这一概念化，显示了所需的激活和耦合反应，以及水解反应和侧反应。
在激活阶段，三个主要问题是CDAP稳定性、CDAP与多糖羟基的反应以及活性多糖的稳定性（图3）。CDAP 水解随 pH 值增加，活化多糖的水解和侧反应也随之增加。但是，通过增加 pH 值，可促进多糖的 CDAP 反应。使用 CDAP 高效激活多糖需要在 1） 多糖和 CDAP 的反应和 2） 试剂和激活的多糖的水解和侧反应之间取得平衡。
在 Lees 等人描述的原始 CDAP 激活协议中，多糖的 CDAP 激活是在室温下在未缓冲的 pH 9 溶液中进行的。在这种情况下，激活速度很快，激活将在 3 分钟内完成。反应的同时，CDAP也迅速水解，导致未缓冲反应溶液的快速pH值下降。在如此短的时间内快速提高并保持目标值的反应 pH 值是很具有挑战性的。在描述的协议中，激活是通过将 CDAP 从 100 毫克/mL 库存溶液添加到未缓冲的多糖溶液中来执行的。30年代后，pH值被提升为"等量的0.2M三聚氰胺"。然后在激活反应中加入2.5分钟后结合的蛋白质。值得注意的是，激活步骤的 pH 值没有得到很好的控制，并且很可能最初超过了目标 pH 值。需要快速 pH 调整的快速反应使激活过程难以控制，难以扩大规模。
与原始协议相比，此处描述的修改协议有两个主要改进。首先，在添加 CDAP 之前，多糖溶液的 pH 值经过预先调整，以达到目标激活 pH 值，使用 DMAP 作为缓冲。DMAP 的 pKa 为 9.5，因此在 pH 9 周围具有良好的缓冲功率，与许多其他缓冲器不同，DMAP 没有发现可以促进 CDAP 水解8。此外，DMAP 已经是一个中间过程，因此不会在反应混合物中添加新的组件。在添加 CDAP 之前对 pH 进行预先调整，消除反应开始时的大 pH 摆动，并允许在反应期间更有效地维护目标 pH 值。第二个改进是在 0 °C 下执行激活反应，CDAP 水解率明显低于室温下。试剂半衰期较长，温度为 0 °C，激活时间从 3 分钟增加到 15 分钟，以补偿低温下的激活速度较慢。反应时间越长，维护反应pH值就越容易。使用 0 °C 还可以减缓 pH 敏感多糖的降解，从而有可能制备此类多糖的结合体。协议的改进使激活过程不那么狂热，更容易控制，更易于重复，更易于扩展。
本文介绍了在 0 °C 和指定目标 pH 值下对多糖进行受控 CDAP 激活以及随后使用 ADH 对激活的多糖进行衍生的改进协议。还描述了一种三硝基苯硫酸（TNBS）检测，基于齐等人的方法，用于确定改性多糖上的水合物水平。还描述了基于氧化醇和硫酸10的六氧化硫的改性检测，可用于确定更广泛的多糖。有关CDAP激活和结合的更多信息，读者被李斯等人提及早期出版物5、6、8。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

结合疫苗是疫苗学的显著进步。对于多糖结合疫苗的制备，多糖可以方便地功能化，并使用1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟溴酸酯（CDAP）与疫苗载体蛋白连接，这是一种易于处理的氰化物试剂。CDAP 通过在 pH 7-9 中与碳水化合物羟基组发生反应来激活多糖。CDAP 的稳定性和反应性高度依赖 pH 值。由于CDAP的水解作用，反应的pH值在激活过程中也会降低，这使得良好的pH值控制成为可重复激活的关键。原始 CDAP 激活协议是在室温下以未缓冲的 pH 9 解决方案执行的。
由于在这种情况下（<3分钟）下快速反应，以及伴随快速CDAP水解的快速pH值下降，在短时间内快速调整和维持目标反应pH值是很困难。此处描述的改进协议在 0 °C 下执行，可减慢 CDAP 水解速度，并将激活时间从 3 分钟延长至 ±15 分钟。二甲基亚胺（DMAP）也被用作缓冲，在添加CDAP试剂之前，预先调整多糖溶液到目标激活pH值。反应时间越长，加上 CDAP 水解速度较慢，以及使用 DMAP 缓冲器，使得在整个激活过程的整个持续时间内保持激活 pH 值更加容易。改进的协议使激活过程不那么狂热，更易重复，更易于扩展。

为了说明使用CDAP化学激活和衍生多糖，德克斯特兰被激活在0.25和0.5毫克CDAP/mg德克斯特拉。对于每个反应，在冰上冷却水中的 10 毫克/mL dextran 溶液，并添加 2.5 M DMAP 库存的 1/10 体积（如第 3 节所述）。最终解决方案通过在 10 μL 阿利库特中添加 0.1 M NaOH 而达到 pH 9。CDAP补充说，解决方案被冷却和搅拌，pH值维持在pH 9，在15分钟内添加10微升0.1 M NaOH的alquot。在pH 9时只增加了0.25 mL的0.5 M ADH（低于通常的量），并且允许在4°C下过夜的反应。
然后，标记的 dextran 按顺序对 1 M NaCl、0.15 M NaCl 和第 6 节中描述的水进行透析。然后，使用再氧醇/硫酸检测（第7.2节）对ADH-dextran进行测定。以葡萄糖为糖标准的典型标准曲线见 图4A。水合物含量是使用第7.3节中描述的TNBS测定确定的。图 4B中给出了以ADH为标准的典型水合物标准曲线。
图4A、B显示在两个激活层激活德克斯特兰的代表性计算。数据被呈现为每100 kDa的德克斯特拉聚合物的海合物和作为ADH到德克斯特拉的重量百分比，分别在图4C第7.9.3.4节和7.9.3.5节中描述。随着CDAP比率的加倍，衍生化程度大约翻了一番。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> 图1：CDAP的化学结构。CDAP = 1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟化物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> 图2：CDAP激活和结合的过程。 这个过程在概念上分为两个阶段，激活的多糖是两者共同的。在基本条件下，CDAP 激活多糖羟基，释放 DMAP（反应 1）。CDAP 水解还释放 DMAP（反应 3）。虽然显示青亚诺酯，这可能不是实际的中间体。因此，中间体被称为（CDAP）"激活"多糖。在第一个激活阶段，激活的多糖可以水解（反应4）或发生侧反应（反应5）。在第二个结合阶段（反应2），激活的多糖与胺发生反应，形成稳定的等素键，除了反应4和5。缩写： CDAP = 1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟化物;DMAP = 4-二甲基亚胺：R -NH2 = 胺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> 图3： CDAP激活和结合。 这个过程需要平衡CDAP反应与多糖，CDAP和活性多糖的稳定性，以及活性多糖与胺的反应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> 图4： 德克斯特拉因CDAP激活的代表结果。（A ） 氧化醇/硫酸和（B） TNBS 检测的典型标准曲线。显示用 0.25 和 0.5 毫克 CDAP/mg dextran 激活的德克斯特兰检测结果。葡萄糖被用作再溶胶检测的标准。德克斯特兰，在毫克/mL，被除以100千达给摩尔浓度。水合物浓度是使用ADH作为标准确定的，结果表示为2M Hz.（C）水合物计算：德克斯特兰比率。推导化水平计算为每100千达的德克斯特拉水合物，以促进不同平均分子量的聚合物之间的比较。g ADH/g dextran 的百分比是使用 174 克/摩尔的 MW 计算的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

蛋白质和含胺配体可与氰化试剂、1-氰化物-4-二甲基甲基苯丙胺四氟溴酸酯（CDAP）激活的多糖共价相关，形成共价蛋白（利甘）-多糖结合体。本文描述了在 0 °C 和变 pH 值下执行受控 CDAP 激活以及执行激活多糖后续结合的改进协议。

使用 1-Cyano-4-二甲基亚胺四氟化物 （CDAP） 激活和结合可溶性聚糖

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

多糖免疫力差，除非与蛋白质有关，需要激活以进行衍生或与蛋白质结合。在此方法中，CDAP 用作砂提试剂。CDAP 激活多糖羟基进行衍生，或与用于疫苗或诊断试剂的蛋白质相关联。CDAP已基本取代氰化物溴化物成为多糖砂提装试剂。CDAP 使用更简单、效率更高，并且可在比氰化溴更低的 pH 值下使用。这是一种更好的激活试剂。CDAP 可用于大多数多糖，不像说还原，这需要静脉羟基。这种化学成分可以直接和间接地与蛋白质结合，并可用于制造诊断试剂。正如最初描述的那样，CDAP激活反应非常迅速，难以控制。这里提供的协议使化学更容易执行，更可重复。在开始实验之前，通过在搅拌时以滴答声方式添加 200 微升二甲基苯丙胺库存溶液，将多糖溶液的 pH 值调整为 9。在整个激活过程中，将反应冷藏在冰水浴中。在搅拌时将 100 微升 CDAP 转移到多糖溶液中，继续进行氰化物-二甲基丙胺-四氟化物或 CDAP 活化。启动定时器并在整个激活期间监控 pH 值变化 15 分钟。通过及时添加 0.1 摩尔氢氧化钠的 10 微升增量，保持目标 pH 值的反应。达到最佳激活时间后，立即在激活的多糖中加入两毫升 0.5 摩尔二氢酰胺。检查 pH 值是否在氢氧化水功能化所需的范围内。在连续搅拌反应混合物至少一小时后，将反应混合物转移到摄氏四度。为了降低产品中的ADH浓度，使用透析装置对粗衍生多糖溶液进行透析。从透析中恢复衍生的多糖，确定多糖和水合物的浓度，以计算水合物与多糖的比例。准备每毫升一毫克未修改的多糖溶液作为标准。将加热块预热至 140 摄氏度，至少一小时，以实现稳定的均匀温度。在发生酸泄漏时，使用加热块下面和周围的保护垫。在三叶酸中加入每毫升碳水化合物标准1毫克的不同体积，加入标记的13 x 100玻糖酸盐试管，并将体积与水一起组成100微升，以达到预期的标准浓度。同样，通过在三个样品管中添加含有五微克衍生多糖的体积来设置样本检测。在每根管子中加入100微升新制备的6毫克雷索西诺。使用重复管道，将准备好的 75% 硫酸的 300 微升添加到每个管子中，大力旋涡管，将管子指向外，然后按顺序将所有管子按顺序稳定地放置在加热器块中，并立即设置计时器三分钟。在三分钟内，按相同顺序取出管子，并直接放在冰水浴的架子中。取出冰冷管，使其在室温下平衡五分钟。使用 10 毫米路径长度的 cuvette，在 430 纳米的 UV-Vis 光谱仪上读取所有管子的吸收度。设置检测反应，对管架中标有的标准管进行排序和排列，以提高浓度。使用校准的微管，在每个相应的管子中加入 100 个标准微升。对于零标准，请使用样品缓冲器的 100 微升。同样，准备和安排样品管。然后使用校准的 1000 微升微管，在所有检测管中加入 875 微升的检测缓冲器。要开始检测反应，在预定顺序下，在预定顺序中向每个检测管中加入25微升1%三硝基苯硫酸。高速旋转测定管两秒钟，确保液体从管打开处旋转到半英寸高。记录测定开始时间，并将定时器设置为两小时。然后在室温下将检测管架放在黑暗中两小时。时间结束后，旋涡管，开始数据收集。使用氧化硫酸检测对adHD脱氧核酸进行检测。绘制了一个典型的标准管，使用葡萄糖作为糖标准。使用 TNBS 检测确定衍生多糖或脱氧三氯苯甲酸酯中的水合物含量。推导化水平被计算为每100千达吨脱氧核酸氢化物，以促进不同平均分子量的聚合物之间的比较。此处描述的协议可能需要针对特定的多糖进行调整。CDAP 化学可用于多糖功能化，用于各种结合试剂。例如，它可以用于生物淀粉酸多糖，用于 ELISAs。蛋白质可以直接与CDAP激活的多糖相关联，但这通常需要对特定的多糖进行一些优化。结合率可超过75%使用CDAP化学使低成本结合疫苗，如印度血清研究所制造的疫苗。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

激活的B细胞CD40的小鼠模型

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

科研

免疫与感染

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

在调节Toll样受体激活Neu1唾液酸酶活动的检测

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

一个细胞检测系统估算的GM - CSF抗体的中和能力，采用重组可溶性GM - CSF受体

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

嗜碱粒细胞激活测试IgE介导的药物过敏机制的调查

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

静电粘附实验对整合素激活的T细胞研究

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

分离及小鼠淋巴细胞的激活

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

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Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

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