Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Det arbejde, der er beskrevet her, blev finansieret af Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees er grundlægger og ejer af Fina Biosolutions. Han har flere patenter vedrørende CDAP kemi og nyder godt af licensering af kemi og CDAP bøjning know-how.

CDAP er en bekvem reagens til at derivatize og konjugere polysaccharider. I denne artikel beskrives den generelle metode til at bruge CDAP til at derivatisere polysaccharider med hydrazider (PS-ADH) og indeholder nyligt offentliggjorte forbedringer8. For det første understreger teknikken vigtigheden af at opretholde mål-pH'en for at styre aktiveringsprocessen. Vi fandt ud af, at mens mange almindelige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaktionen, kunne DMAP med succes bruges som buffer til at administrere pH8. Desuden er DMAP allerede et reaktionsbiprodukt af CDAP-aktivering. Endelig letter buffering af polysaccharidopløsningen med DMAP, før CDAP tilføjes, præcis målretning og vedligeholdelse af reaktions-pH'en. Som vi beskriver, er det nyttigt at justere pH af den koncentrerede DMAP lageropløsning, så når den fortyndes, når den den målrettede pH. For det andet bremsede udførelsen af processen i kulden reaktionstiden, hvilket gjorde aktiveringsprocessen mindre hektisk og mere tilgivende. Lavere temperatur faldt hastigheden af CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstid ved pH 9 stiger fra ~ 3 min til ~ 15 min. Derudover kræves der mindre CDAP for at opnå det samme aktiveringsniveau, end når det udføres ved stuetemperatur. 
ADH-derivatiserede polysaccharider kan konjugeres til proteiner ved hjælp af carbodiimider (f.eks. For eksempel bruger flere godkendte Hæmophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolphosphat (PRP), derivatized med ADH til at konjugatere til stivkrampe toksoid ved hjælp af EDAC. CNBR blev oprindeligt ansat, men CDAP er et meget lettere reagens at bruge til dette formål. Det er vores erfaring, at et godt målområde for ADH-derivatisering er 10-30 hydrazider pr. 100 kDa polysaccharid eller ~ 1-3% ADH efter vægt.
Den samme proces kan bruges til at derivatisere polysaccharider med primære aminer ved at erstatte ADH for en diamin. Det anbefales at bruge hexandiamin til at derivatisere polysaccharider med aminer8. Den aminerede polysaccharid (PS-NH2) kan konjugeres ved hjælp af reagenser udviklet til proteinbøjning11. Typisk er PS-NH2 derivatiseret med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimid ester (GMBS)), og proteinet thioleres (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimide kemi er meget effektiv.
Proteiner kan også være direkte koblet til CDAP-aktiverede polysaccharider via ɛ-amine på lysiner. Mens den anvendte aktiveringsprotokol generelt ligner den, der er beskrevet her, er det nødvendigt at optimere aktiveringsniveauet, polysaccharid og proteinkoncentration samt protein:polysaccharidforholdet5,6,8. 
Dextran er en af de nemmeste polysaccharider at aktivere med CDAP på grund af sin relativt høje tæthed af hydroxylgrupper, men nogle polysaccharider, såsom Vi antigen, kan være udfordrende. Derfor er der ingen enkelt "bedste" protokol for CDAP bøjning direkte til proteiner. Vi foreslår først at udvikle en protokol for at opnå passende niveauer af aktivering, som bestemt af omfanget af hydrazid derivatization, og derefter fortsætter med at direkte protein bøjning til CDAP-aktiveret polysaccharid.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Konjugatvacciner, såsom dem, der består af polysaccharider, der er kovalent forbundet med et bæreprotein, er blandt de bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi1,2. Polysaccharider, som T-celle-uafhængige antigener, er dårligt immunogene hos spædbørn og fremkalder ikke hukommelse, klasseskift eller affinitetsmodning af antistoffer3. Disse mangler overvindes i polysaccharid konjugatvacciner4. Da de fleste polysaccharider ikke har et praktisk kemisk håndtag til bøjning, skal de først gøres reaktive eller "aktiveres". Den aktiverede polysaccharid forbindes derefter enten direkte med proteinet (eller modificeret protein) eller funktionaliseres til yderligere derivatisering førbøjning 4. De fleste licenserede polysaccharid konjugatvacciner bruger enten reduktiv amination eller cyanylation til at aktivere polysaccharid hydroxyls. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens, der tidligere var blevet brugt til at aktivere kromatografiharpikser, blev oprindeligt brugt til polysaccharidderivatisering. CNBr kræver dog høj pH, typisk ~ pH 10,5 eller derover, for delvist at deprotonere polysaccharid hydroxyls, så de er tilstrækkeligt nukleophilic til at angribe cyanogruppen. Den høje pH-fejl kan være skadelig for basis-labile polysaccharider, og hverken CNBr eller den aktive cyano-ester, der oprindeligt blev dannet, er tilstrækkelig stabil ved så høj pH.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat; Figur 1) blev indført af Lees et al. til brug som cyanylerende middel til aktivering af polysaccharider5,6. CDAP, som er krystallinsk og let at håndtere, viste sig at aktivere polysaccharider ved en lavere pH end CNBr og med færre bivirkninger. I modsætning til CNBr kan CDAP-aktiverede polysaccharider konjugeres direkte til proteiner, hvilket forenkler synteseprocessen. CDAP-aktiverede polysaccharider kan funktionaliseres med en diamin (f.eks. hexanediamin) eller et dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for at fremstille amino- eller hydrazidderivatiserede polysaccharider. En høj koncentration af det homobifunktionelle reagens bruges til at undertrykke krydskædning af polysaccharider. Amino polysaccharider kan derefter konjugers ved hjælp af nogen af de utallige teknikker, der anvendes til protein bøjning. Hydrazid-derivatiserede polysaccharider er ofte koblet til proteiner ved hjælp af et carbodiimid reagens (f.eks. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC))7. Yderligere optimering af CDAP polysaccharid aktivering er blevet beskrevet af Lees et al.8 og er indarbejdet i protokollen beskrevet her.
OVERSIGT OVER CDAP-bøjning CDAP-protokollen kan konceptualiseres som to faser: (1) aktivering af polysaccharid og (2) bøjning af det aktiverede polysaccharid med et protein eller ligand (figur 2). Målet med det første skridt er effektivt at aktivere polysaccharid, mens målet med det andet er effektivt at konjugere til den aktiverede polysaccharid. Den aktiverede polysaccharid binder de to trin sammen. Denne konceptualisering hjælper med at fokusere på de kritiske elementer i hvert trin. Figur 2 udvider denne konceptualisering, der viser de ønskede aktiverings- og koblingsreaktioner sammen med hydrolysereaktionerne og bivirkningerne.
I aktiveringsfasen er de tre største bekymringer CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysaccharidhydrxyl og stabiliteten af det aktiverede polysaccharid (figur 3). CDAP hydrolyse stiger med pH, ligesom hydrolyse af den aktiverede polysaccharid og sidereaktionerne. CDAP-reaktionen med polysaccharid lettes dog ved at øge pH-markedet. Effektiv aktivering af polysaccharider med CDAP kræver en balance mellem 1) polysaccharidens og CDAP's reaktivitet og 2) hydrolyse og sidereaktioner fra både reagenset og det aktiverede polysaccharid.
I den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol, der er beskrevet af Lees et al.5, blev CDAP-aktivering af polysaccharider udført ved stuetemperatur i ukøbt pH 9-opløsning. Aktiveringshastigheden viste sig at være hurtig under denne betingelse, og aktiveringen ville være komplet inden for 3 min. Reaktionen blev også ledsaget af hurtig hydrolyse af CDAP, hvilket forårsagede et hurtigt pH-fald i den ikke-byggede reaktionsløsning. Det var udfordrende hurtigt at hæve og opretholde reaktionen pH på målværdien i så kort tid. I den beskrevne protokol blev aktiveringen udført ved at tilføje CDAP fra en 100 mg / mL lageropløsning til den ikke-byggede polysaccharidopløsning. pH blev hævet 30 s senere med "et lige volumen på 0,2 M triethylamin". Protein, der skal konjugers blev derefter tilsat efter 2,5 min til aktiveringsreaktionen. Navnlig var pH-adressen på aktiveringstrinnet ikke velkontrolleret og overskred sandsynligvis oprindeligt mål-pH'en. Den hurtige reaktion, der kræver hurtig pH-justering, gjorde aktiveringsprocessen vanskelig at kontrollere og udfordrende at skalere op.
I modsætning til den oprindelige protokol har den ændrede protokol, der er beskrevet her, to store forbedringer. For det første er polysaccharidopløsningens pH-pH-side justeret til målaktivering af pH ved hjælp af DMAP som buffer før tilsætning af CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har således god buffereffekt omkring pH 9, og i modsætning til mange andre buffere blev DMAP ikke fundet at fremme CDAP hydrolyse8. Desuden er DMAP allerede en proces mellemliggende og tilføjer derfor ikke en ny komponent til reaktionsblandingen. Forjustering af pH-vedligeholdelsen, før cdap tilføjes, eliminerer det store pH-sving i begyndelsen af reaktionen og giver mulighed for en mere effektiv vedligeholdelse af mål-pH'en under reaktionen. Den anden forbedring er at udføre aktiveringsreaktionen ved 0 °C, hvor CDAP-hydrolysehastigheden er markant langsommere end ved stuetemperatur. Med den længere halveringstid i reagens ved 0 °C øges aktiveringstiden fra 3 min til 15 min for at kompensere for den langsommere aktiveringshastighed ved den lavere temperatur. Den længere reaktionstid gør det igen lettere at opretholde reaktions-pH-virksomheden. Anvendelsen af 0 °C forsinker også nedbrydningen af pH-følsomme polysaccharider, hvilket gør det muligt at forberede konjuger af denne type polysaccharid. Forbedringerne i protokollen gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, lettere at kontrollere, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.
I denne artikel beskrives den forbedrede protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering af polysaccharid ved 0 °C og ved en bestemt mål-pH-værdi og efterfølgende derivatisering af de aktiverede polysaccharider med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfatsyre (TNBS) assay, baseret på metoden qi et al.9, til bestemmelse af hydrazid niveau på den modificerede polysaccharid. En modificeret analyse for hexoser baseret på resorcinol og svovlsyre10 er også beskrevet, som kan bruges til bestemmelse af en bredere vifte af polysaccharider. For mere information om CDAP aktivering og bøjning, læseren henvises til tidligere publikationer5,6,8 af Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Konjugatvacciner er bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi. Til fremstilling af polysaccharidkonjugatvacciner kan polysaccharider bekvemt funktionaliseres og forbindes med vaccinebærerproteiner ved hjælp af 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), et cyanylende reagens, der er let at håndtere. CDAP aktiverer polysaccharider ved at reagere med kulhydrathydrathydrxylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten af CDAP er meget pH-afhængige. Reaktionens pH-fejl falder også under aktiveringen på grund af hydrolysen af CDAP, hvilket gør god pH-styring af nøglen til reproducerbar aktivering. Den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol blev udført ved stuetemperatur i ikke-byggede pH 9-løsninger.
På grund af den hurtige reaktion under denne tilstand (<3 min) og det medfølgende hurtige pH-fald fra den hurtige CDAP-hydrolyse var det udfordrende hurtigt at justere og vedligeholde målreaktions-pH'en inden for den korte tidsramme. Den forbedrede protokol, der er beskrevet her, udføres ved 0 °C, hvilket bremser CDAP-hydrolyse og forlænger aktiveringstiden fra 3 min til ~ 15 min. Dimethylaminopyridin (DMAP) blev også brugt som buffer til at justere polysaccharidopløsningen til målaktiverings-pH'en, før CDAP-reagenset blev tilføjet. Den længere reaktionstid kombineret med den langsommere CDAP-hydrolyse og brugen af DMAP-buffer gør det lettere at opretholde aktiverings-pH'en i hele aktiveringsprocessens varighed. Den forbedrede protokol gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.

For at illustrere aktivering og derivatisering af en polysaccharid ved hjælp af CDAP kemi, dextran blev aktiveret på 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran. For hver reaktion blev en 10 mg/mL dextranopløsning i vand kølet på is, og 1/10th volumen af en 2,5 M DMAP lager (fremstillet som beskrevet i afsnit 3) blev tilføjet. Den endelige løsning blev bragt til pH 9 ved tilsætning af 0,1 M NaOH i 10 μL aliquots. Opløsningen blev kølet og omrørt, CDAP tilsat, og pH opretholdes ved pH 9 ved at tilsætte 10 μL aliquots på 0,1 M NaOH i 15 min. Kun 0,25 mL på 0,5 M ADH ved pH 9 blev tilføjet (mindre end det sædvanlige beløb), og reaktionen fik lov til at fortsætte natten over ved 4 °C.
Den mærket dextran blev derefter sekventielt dialyzed mod 1 M NaCl, 0,15 M NaCl, og vand som beskrevet i afsnit 6. ADH-dextran blev derefter analyseret for dextran ved hjælp af resorcinol/svovlsyreanalysen (punkt 7.2). En typisk standardkurve, der bruger glukose som sukkerstandard, er vist i figur 4A. Hydrazidindholdet blev bestemt ved hjælp af TNBS-analysen, der er beskrevet i afsnit 7.3. En typisk hydrazidstandardkurve, der bruger ADH som standard, er angivet i figur 4B.
Repræsentative beregninger fra aktivering af dextran på de to aktiveringsniveauer er vist i figur 4A, B. Dataene præsenteres som både hydrazider pr. 100 kDa dextran polymer og som en vægtprocent af ADH til dextran, som beskrevet i henholdsvis afsnit 7.9.3.4 og 7.9.3.5 i figur 4C. Graden af derivatisering blev omtrent fordoblet, da CDAP-forholdet blev fordoblet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figur 1: Cdap's kemiske struktur. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figur 2: Proces med CDAP-aktivering og bøjning. Processen er konceptuelt opdelt i to faser, med den aktiverede polysaccharid fælles for begge. Under grundlæggende forhold aktiverer CDAP polysaccharid hydroxyls og frigiver DMAP (reaktion 1). CDAP hydrolyse frigiver også DMAP (reaktion 3). Selvom der vises en cyano-ester, er dette muligvis ikke det faktiske mellemprodukt. Mellemproduktet kaldes derfor (CDAP) "aktiveret" polysaccharid. I den første aktiveringsfase kan det aktiverede polysaccharid hydrolysere (reaktion 4) eller gennemgå bivirkninger (reaktion 5). I den anden bøjningsfase (reaktion 2) reagerer det aktiverede polysaccharid med en amin for at danne en stabil isoureabinding ud over reaktioner 4 og 5. Forkortelser: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; R-NH2 = amin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figur 3: CDAP-aktivering og bøjning. Processen kræver afbalancering af CDAP-reaktivitet med polysaccharid, stabiliteten af CDAP og aktiveret polysaccharid samt reaktiviteten af det aktiverede polysaccharid med aminens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative resultater for CDAP-aktivering af dextran. Typiske standardkurverfor resorcinol/svovlsyre (B) TNBS- analyserne. Analysen resultater for dextran aktiveret med 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran er vist. Glukose blev anvendt som standard for resorcinolanalysen. Dextran, i mg/mL, divideres med 100 kDa for at give en molarkoncentration. Hydrazidkoncentrationen bestemmes ved hjælp af ADH som standard og resultaterne udtrykt som μM Hz. (C) Beregning af hydrazid: dextranforhold. Niveauet af derivatisering blev beregnet som hydrazider pr. 100 kDa dextran for at lette sammenligningen mellem polymerer af forskellige gennemsnitlige molekylvægte. Vægtprocenten for g ADH/g dextran blev beregnet ved hjælp af en MW på 174 g/mole til ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteiner og aminholdige ligander kan være kovalent forbundet med polysaccharider aktiveret af cyanylation reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), til at danne kovalent protein (ligand)-polysaccharid konjugates. I denne artikel beskrives en forbedret protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og efterfølgende bøjning af de aktiverede polysaccharider.

Aktivering og bøjning af opløselige polysaccharider ved hjælp af 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborat (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polysaccharider er dårligt immunogene, medmindre de er knyttet til protein og skal aktiveres til derivatisering eller bøjning af proteiner. I denne metode bruges CDAP som sandbelastende reagens. CDAP aktiverer polysaccharidhydrxyller til derivatisering eller til at være forbundet med proteiner til brug i vacciner eller diagnostiske reagenser.CDAP har stort set erstattet cyanogenbromid som en polysaccharid sand lading reagens. CDAP er enklere at bruge, mere effektiv, og kan bruges på en lavere pH end cyanogenbromid. Det er et meget bedre aktiverende reagens.CDAP kan bruges med de fleste polysaccharider, i modsætning til sige reduktiv amination, som kræver vicinal hydroxyls. Kemien kan bruges til både direkte og indirekte at konjugere til proteiner, og den kan bruges til at lave diagnostiske reagenser. CDAP-aktiveringsreaktionen, som oprindeligt beskrevet, var meget hurtig og vanskelig at kontrollere.Protokollen her gør kemien langt lettere at udføre og meget mere reproducerbar. Før du starter forsøget, skal du justere pH-opløsningen for polysaccharidopløsningen til 9 ved at tilsætte 200 mikroliter af dimethylaminopyridinlageropløsning på en dråbevis under omrøring. Hold reaktionen kølet i et isvandbad under hele aktiveringsprocessen.Fortsæt med cyano-dimethylaminopyridin-tetrafluoroborat eller CDAP-aktivering ved at overføre 100 mikroliter AF CDAP til polysaccharidopløsningen under omrøring. Start timeren, og overvåg pH-ændringen under hele aktiveringen i 15 minutter. Bevar reaktionen ved mål-pH ved straks at tilsætte 10 mikroliterintervaller på 0,1 molar natriumhydroxid.Når den optimale aktiveringstid er nået, tilsættes to milliliter på 0,5 molar adipic dihydrazide på én gang til den aktiverede polysaccharid. Kontroller, at pH er i det ønskede interval for hydroxidefunktionalisering. Efter kontinuerlig omrøring af reaktionsblandingen i mindst en time overføres reaktionsblandingen til fire grader Celsius.For at reducere ADH-koncentrationen fra produktet skal du dialyse den rå derivatiserede polysaccharidopløsning ved hjælp af dialyseenheden. Genvind den derivatiserede polysaccharid fra dialyse og bestemme koncentrationen af polysaccharider og hydrazid til at beregne hydrazid til polysaccharid forholdet. Forbered et milligram pr milliliter uændret polysaccharidopløsning, der skal anvendes som standard.Forvarm varmeblokken til 140 grader Celsius i mindst en time for at opnå en stabil ensartet temperatur. Brug en beskyttende pude under og omkring varmeblokken i tilfælde af syreudslip. Tilføj varierende mængder af et milligram per milliliter kulhydrat standard til mærket 13 af 100 borosilicat reagensglas i triplikter og udgør volumen til 100 mikroliter med vand for at opnå de ønskede standard koncentrationer.Tilsvarende oprette prøve assays ved at tilføje et volumen, der indeholder fem mikrogram af derivatized polysaccharid til tre prøve rør. Tilsæt 100 mikroliter frisklavede seks milligram pr. milliliter resorcinol til hvert rør. Ved hjælp af en gentagen pipetter tilsættes 300 mikroliter af den forberedte 75% svovlsyre til hvert rør, hvirvler rørene kraftigt, peger røret væk, læg derefter alle rørene i en varmelegemeblok i et stabilt tempo i rækkefølge og sæt straks timeren i tre minutter.Efter tre minutter skal du fjerne rørene i samme rækkefølge og placere dem direkte i et rack i et isvandbad. Fjern de iskolde rør, så de kan ekvilibrere til stuetemperatur i fem minutter. Læs absorbansen af alle rørene på et UV-Vis spektrofotometer ved 430 nanometer ved hjælp af en 10 millimeter stilængde cuvette.For at opsætte assay reaktioner, sortere og arrangere mærket standard rør i rør rack i rækkefølge efter stigende koncentration. Ved hjælp af en kalibreret mikropipette tilsættes 100 mikroliter af standarderne til hvert tilsvarende rør. For nulstandarden skal du bruge 100 mikroliter af prøvebufferen.På samme måde forberedes og arrangeres prøverørene. Derefter ved hjælp af en kalibreret 1.000 mikroliter mikropipette, tilføje 875 mikroliter af assay buffer til alle assay rør. For at starte analysen reaktion, tilføje 25 mikroliter af 1% trinitrobenzene sulfatsyre til hver analyse rør i forudbestemt rækkefølge inden for fem minutter.Vortex analysen rør i to sekunder ved høj hastighed, og sørg for, at væsken hvirvler til en højde på en halv tomme fra rør åbning. Optag analysens starttidspunkt, og indstil timeren til to timer. Placer derefter analyserørstativet i mørke ved stuetemperatur i to timer.Når tiden er forbi, hvirvle rørene og gå videre til dataindsamling. ADH dextran blev analyseret for dextran ved hjælp af resorcinol svovlsyre assay. Et typisk standardrør, der brugte glukose som sukkerstandard, blev plottet.Hydrazidindholdet i derivatiseret polysaccharid eller dextran blev bestemt ved hjælp af TNBS-analysen. Niveauet af derivatisering blev beregnet som hydrider pr. 100 kilodalton dextran for at lette sammenligningen mellem polymerer af forskellige gennemsnitlige molekylvægte. Den protokol, der er beskrevet her, skal muligvis tilpasses til et bestemt polysaccharid.CDAP kemi kan bruges til at funktionalisere polysaccharider til brug med en bred vifte af bøjning reagenser. Det kan for eksempel bruges til biotinylat polysaccharider til brug i ELISA'er. Proteiner kan være direkte forbundet med CDAP-aktiverede polysaccharider, men dette kræver normalt en vis optimering for en bestemt polysaccharid.Bøjningsudbyttet kan være over 75% Brugen af CDAP-kemi har muliggjort billige konjugatvacciner, som dem, der f.eks. er lavet af Serum Institute of India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder til kvantitativ påvisning af antistof-induceret komplement aktivering på de røde blodlegemer

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Static adhæsionsassayet for Studiet af Integrin Aktivering i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering og aktivering af murine lymfocytter

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Oprettelsen af en tætte Transposon indsættelse bibliotek ved hjælp af bakteriel konjugation i Enterobacterial stammer som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...