Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Het hier beschreven werk werd gefinancierd door Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees is oprichter en eigenaar van Fina Biosolutions. Hij bezit verschillende patenten met betrekking tot CDAP-chemie en profiteert van licenties voor de chemie en CDAP-conjugatie-knowhow.

CDAP is een handig reagens om polysacchariden te derivatiseren en te conjugeren. Dit artikel beschrijft de algemene methode om CDAP te gebruiken om polysacchariden te derivatiseren met hydraziden (PS-ADH) en bevat recent gepubliceerdeverbeteringen 8. Ten eerste benadrukt de techniek het belang van het handhaven van de doel-pH om het activeringsproces te beheersen. We ontdekten dat hoewel veel voorkomende buffers de CDAP-activeringsreactie verstoren, DMAP met succes kan worden gebruikt als buffer om de pH8te beheren. Bovendien is DMAP al een reactiebijproduct van CDAP-activering. Ten slotte vergemakkelijkt het bufferen van de polysaccharide-oplossing met DMAP voordat de CDAP wordt toegevoegd, nauwkeurige targeting en onderhoud van de pH van de reactie. Zoals we beschrijven, is het nuttig om de pH van de geconcentreerde DMAP-stamoplossing zodanig aan te passen dat deze bij verdunnen de beoogde pH bereikt. Ten tweede vertraagde het uitvoeren van het proces in de kou de reactietijd, waardoor het activeringsproces minder hectisch en vergevingsgezinder werd. Lagere temperatuur verlaagde de snelheid van CDAP-hydrolyse en de optimale activeringstijd bij pH 9 neemt toe van ~ 3 min tot ~ 15 min. Bovendien is er minder CDAP nodig om hetzelfde activeringsniveau te bereiken dan bij kamertemperatuur. 
ADH-gederivatiseerde polysacchariden kunnen worden geconjugeerd aan eiwitten met behulp van carbodiimiden (bijv. EDAC)7. Verschillende gelicentieerde Haemophilus influenzae b (Hib) -vaccins gebruiken bijvoorbeeld het polyribosylribitolfosfaat (PRP) gederivatiseerd met ADH om te conjugeren naar tetanustoxoïde met behulp van EDAC. CNBr werd aanvankelijk gebruikt, maar CDAP is een veel gemakkelijker reagens om voor dit doel te gebruiken. In onze ervaring is een goed doelbereik voor ADH-derivatisatie 10-30 hydraziden per 100 kDa polysaccharide of ~ 1-3% ADH per gewicht. 
Hetzelfde proces kan worden gebruikt om polysacchariden te derivatiseren met primaire amines door de ADH te vervangen door een diamine. Het wordt aanbevolen om hexaandiamine te gebruiken om polysacchariden met amines te derivatiseren8. De verontreinigde polysacharide (PS-NH2) kan worden geconjugeerd met behulp van reagentia die zijn ontwikkeld voor eiwitconjugatie11. Meestal wordt de PS-NH2 gederivatiseerd met een maleimide (bijv. Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) of N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), en het eiwit wordt ge thioleerd (bijv. Met succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionaat (SPDP)). Thiol-maleimide chemie is zeer efficiënt.
Eiwitten kunnen ook direct worden gekoppeld aan CDAP-geactiveerde polysacchariden via het ɛ-amine op lysines. Hoewel het gebruikte activeringsprotocol over het algemeen vergelijkbaar is met het hier beschreven protocol, is het noodzakelijk om het niveau van activering, polysaccharide en eiwitconcentratie te optimaliseren, evenals de eiwit: polysaccharide-verhouding5,6,8.
Dextran is een van de gemakkelijkste polysacchariden om te activeren met CDAP vanwege de relatief hoge dichtheid van hydroxylgroepen, maar sommige polysacchariden, zoals Vi-antigeen, kunnen een uitdaging zijn. Bijgevolg is er geen enkel "beste" protocol voor CDAP-conjugatie rechtstreeks naar eiwitten. We stellen voor om eerst een protocol te ontwikkelen om geschikte niveaus van activering te bereiken, zoals bepaald door de mate van hydrazide-derivatisatie, en vervolgens over te gaan tot directe eiwitconjugatie naar CDAP-geactiveerd polysaccharide.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Geconjugeerde vaccins, zoals die bestaande uit polysacchariden covalent gekoppeld aan een dragereiwit, behoren tot de opmerkelijke vooruitgang in de vaccinologie1,2. Polysacchariden, als T-celonafhankelijke antigenen, zijn slecht immunogeen bij zuigelingen en induceren geen geheugen, klasseschakeling of affiniteitsrijping van antilichamen3. Deze tekortkomingen worden overwonnen in polysaccharide geconjugeerde vaccins4. Omdat de meeste polysacchariden geen handig chemisch handvat hebben voor conjugatie, moeten ze eerst reactief of "geactiveerd" worden gemaakt. De geactiveerde polysacharide wordt vervolgens direct gekoppeld aan het eiwit (of gemodificeerd eiwit) of wordt gefunctionaliseerd voor extra derivatisatie vóór conjugatie4. De meeste gelicentieerde polysaccharide conjugaatvaccins gebruiken reductieve aminatie of cyanylation om polysaccharidehydroxylen te activeren. Cyanogeenbromide (CNBr), een reagens dat eerder werd gebruikt om chromatografieharsen te activeren, werd aanvankelijk gebruikt voor polysaccharide-derivatisatie. CNBr vereist echter een hoge pH, meestal ~ pH 10,5 of hoger, om polysaccharidehydroxylen gedeeltelijk te deprotoneren, zodat ze voldoende nucleofiel zijn om de cyanogroep aan te vallen. De hoge pH kan schadelijk zijn voor base-labiele polysacchariden, en noch CNBr, noch de actieve cyano-ester die aanvankelijk is gevormd, is voldoende stabiel bij zo'n hoge pH.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat; Figuur 1) werd geïntroduceerd door Lees et al. voor gebruik als cyanylating agent voor de activering van polysacchariden5,6. CDAP, dat kristallijn en gemakkelijk te hanteren is, bleek polysacchariden te activeren bij een lagere pH dan CNBr en met minder bijwerkingen. In tegenstelling tot CNBr kunnen CDAP-geactiveerde polysacchariden direct worden geconjugeerd aan eiwitten, waardoor het syntheseproces wordt vereenvoudigd. CDAP-geactiveerde polysacchariden kunnen worden gefunctionaliseerd met een diamine (bijv. Hexaandiamine) of een dihydrazide (bijv. Adipische dihydrazide, ADH) om amino- of hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden te maken. Een hoge concentratie van het homobifunctionele reagens wordt gebruikt om crosslinking van polysacchariden te onderdrukken. Aminopolysacchariden kunnen vervolgens worden geconjugeerd met behulp van een van de talloze technieken die worden gebruikt voor eiwitconjugatie. Hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden worden vaak gekoppeld aan eiwitten met behulp van een carbodiimide-reagens (bijv. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC))7. Verdere optimalisatie van CDAP polysaccharide activering is beschreven door Lees et al.8 en is opgenomen in het protocol dat hier wordt beschreven.
CDAP-vervoegingsoverzicht Het CDAP-protocol kan worden geconceptualiseerd als twee fasen: (1) de activering van de polysacharide en (2) conjugatie van de geactiveerde polysaccharide met een eiwit of ligand(figuur 2). Het doel van de eerste stap is om de polysaccharide efficiënt te activeren, terwijl het doel van de tweede is om efficiënt te conjugeren naar de geactiveerde polysaccharide. De geactiveerde polysaccharide verbindt de twee stappen met elkaar. Deze conceptualisering helpt zich te concentreren op de kritieke elementen van elke stap. Figuur 2 breidt deze conceptualisering uit en toont de gewenste activerings- en koppelingsreacties, samen met de hydrolysereacties en nevenreacties.
Tijdens de activeringsfase zijn de drie belangrijkste zorgen de CDAP-stabiliteit, de CDAP-reactie met de polysaccharidehydroxylen en de stabiliteit van de geactiveerde polysacharide(figuur 3). CDAP-hydrolyse neemt toe met de pH, net als de hydrolyse van de geactiveerde polysaccharide en de nevenreacties. De CDAP-reactie met de polysaccharide wordt echter vergemakkelijkt door de pH te verhogen. Het efficiënt activeren van polysachariden met CDAP vereist een balans tussen 1) de reactiviteit van de polysacharide en CDAP en 2) de hydrolyse en nevenreacties van zowel het reagens als het geactiveerde polysacharide.
In het oorspronkelijke CDAP-activeringsprotocol beschreven door Lees et al.5, werd CDAP-activering van polysacchariden uitgevoerd bij kamertemperatuur in niet-gebufferde pH 9-oplossing. De activeringssnelheid bleek onder deze voorwaarde snel te zijn en de activering zou binnen 3 minuten voltooid zijn. De reactie ging ook gepaard met snelle hydrolyse van CDAP, waardoor een snelle pH-daling van de niet-gebufferde reactieoplossing ontstond. Het was een uitdaging om de reactie-pH in zo'n kort tijdsbestek snel te verhogen en op de streefwaarde te houden. In het beschreven protocol werd activering uitgevoerd door CDAP van een 100 mg/ml stockoplossing toe te voegen aan de niet-gebufferde polysaccharide-oplossing. De pH werd 30 s later verhoogd met "een gelijk volume van 0,2 M triethylamine". Het te conjugeren eiwit werd vervolgens na 2,5 minuut aan de activeringsreactie toegevoegd. Met name de pH van de activeringsstap was niet goed gecontroleerd en overschreed hoogstwaarschijnlijk aanvankelijk de beoogde pH. De snelle reactie die een snelle aanpassing van de pH vereiste, maakte het activeringsproces moeilijk te controleren en een uitdaging om op te schalen.
In tegenstelling tot het oorspronkelijke protocol heeft het hier beschreven aangepaste protocol twee belangrijke verbeteringen. Eerst wordt de pH van de polysaccharide-oplossing vooraf aangepast aan de pH van de doelactivering, met DMAP als buffer, vóór de toevoeging van CDAP. DMAP heeft een pKa van 9,5 en heeft dus een goed buffervermogen rond pH 9, en in tegenstelling tot veel andere buffers bleek DMAP geen CDAP-hydrolyse te bevorderen8. Bovendien is DMAP al een procestussenproduct en voegt daarom geen nieuwe component toe aan het reactiemengsel. Het vooraf aanpassen van de pH voordat CDAP wordt toegevoegd, elimineert de grote pH-schommeling aan het begin van de reactie en zorgt voor een efficiënter onderhoud van de doel-pH tijdens de reactie. De tweede verbetering is het uitvoeren van de activeringsreactie bij 0 °C, waarbij de snelheid van CDAP-hydrolyse aanzienlijk langzamer is dan die bij kamertemperatuur. Met de langere halfwaardetijd van het reagens bij 0 °C wordt de activeringstijd verhoogd van 3 min naar 15 min om de langzamere activeringssnelheid bij de lagere temperatuur te compenseren. De langere reactietijd maakt het op zijn beurt gemakkelijker om de pH van de reactie te handhaven. Het gebruik van 0 °C vertraagt ook de afbraak van pH-gevoelige polysacchariden, waardoor het mogelijk is om conjugaten van dit type polysacharide te bereiden. De verbeteringen in het protocol maken het activeringsproces minder hectisch, gemakkelijker te controleren, meer reproduceerbaar en vatbaarder voor opschaling.
Dit artikel beschrijft het verbeterde protocol voor het uitvoeren van gecontroleerde CDAP-activering van polysaccharide bij 0 °C en bij een gespecificeerde streef-pH en het uitvoeren van daaropvolgende derivatisatie van de geactiveerde polysacchariden met ADH. Ook beschreven is een trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) assay, gebaseerd op de methode van Qi et al.9, voor de bepaling van hydrazide niveau op de gemodificeerde polysaccharide. Een gemodificeerde test voor hexoses op basis van resorcinol en zwavelzuur10 wordt ook beschreven, die kan worden gebruikt voor het bepalen van een breder scala aan polysacchariden. Voor meer informatie over CDAP-activering en -vervoeging wordt de lezer verwezen naar eerdere publicaties5,6,8 van Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Geconjugeerde vaccins zijn opmerkelijke vooruitgangen in de vaccinologie. Voor de bereiding van polysaccharideconjugaatvaccins kunnen de polysacchariden gemakkelijk worden gefunctionaliseerd en gekoppeld aan vaccindragereiwitten met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluoroboraat (CDAP), een gemakkelijk te hanteren cyanylating-reagens. CDAP activeert polysacchariden door te reageren met koolhydraathydroxylgroepen bij pH 7-9. De stabiliteit en reactiviteit van CDAP zijn sterk pH-afhankelijk. De pH van de reactie neemt ook af tijdens activering als gevolg van de hydrolyse van CDAP, waardoor een goede pH-regeling de sleutel is tot reproduceerbare activering. Het oorspronkelijke CDAP-activeringsprotocol werd uitgevoerd bij kamertemperatuur in niet-gebufferde pH 9-oplossingen.
Vanwege de snelle reactie onder deze omstandigheden (<3 min) en de bijbehorende snelle pH-daling van de snelle CDAP-hydrolyse, was het een uitdaging om de pH van de doelreactie in het korte tijdsbestek snel aan te passen en te handhaven. Het verbeterde protocol dat hier wordt beschreven, wordt uitgevoerd bij 0 °C, wat de CDAP-hydrolyse vertraagt en de activeringstijd verlengt van 3 minuten tot ~ 15 minuten. Dimethylaminopyridine (DMAP) werd ook gebruikt als buffer om de polysaccharide-oplossing vooraf aan te passen aan de pH van de doelactivering voordat het CDAP-reagens werd toegevoegd. De langere reactietijd, in combinatie met de langzamere CDAP-hydrolyse en het gebruik van DMAP-buffer, maakt het gemakkelijker om de activerings-pH gedurende de gehele duur van het activeringsproces te handhaven. Het verbeterde protocol maakt het activeringsproces minder hectisch, reproduceerbaarder en vatbaarder voor opschaling.

Om de activering en derivatisatie van een polysaccharide met behulp van CDAP-chemie te illustreren, werd dextran geactiveerd bij 0,25 en 0,5 mg CDAP / mg dextran. Voor elke reactie werd een dextranoplossing van 10 mg/ml in water gekoeld op ijs en werd 1/10e volume van een DMAP-voorraad van 2,5 M (bereid zoals beschreven in rubriek 3) toegevoegd. De uiteindelijke oplossing werd op pH 9 gebracht door de toevoeging van 0,1 M NaOH in 10 μL aliquots. De oplossing werd gekoeld en geroerd, CDAP toegevoegd en de pH op pH 9 gehouden door toevoeging van 10 μL aliquots van 0,1 M NaOH gedurende 15 min. Slechts 0,25 ml van 0,5 M ADH bij pH 9 werd toegevoegd (minder dan de gebruikelijke hoeveelheid) en de reactie kon 's nachts bij 4 °C doorgaan.
De gelabelde dextran werd vervolgens sequentieel gedialyseerd tegen 1 M NaCl, 0,15 M NaCl en water zoals beschreven in rubriek 6. De ADH-dextran werd vervolgens getest op dextran met behulp van de resorcinol/zwavelzuurtest (rubriek 7.2). Een typische standaardcurve met glucose als suikerstandaard wordt weergegeven in figuur 4A. Het hydrazidegehalte werd bepaald met behulp van de TNBS-test beschreven in rubriek 7.3. Een typische hydrazide standaardcurve met ADH als standaard wordt gegeven in figuur 4B.
Representatieve berekeningen van de activering van dextran op de twee activeringsniveaus zijn weergegeven in figuur 4A(B). De gegevens worden gepresenteerd als zowel hydraziden per 100 kDa dextranpolymeer als als gewichtspercentage van ADH tot dextran, zoals beschreven in respectievelijk rubrieken 7.9.3.4 en 7.9.3.5 in figuur 4C. De mate van derivatisatie verdubbelde ongeveer naarmate de CDAP-ratio werd verdubbeld.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figuur 1: Chemische structuur van CDAP. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figuur 2: Proces van CDAP-activering en -conjugatie. Het proces is conceptueel verdeeld in twee fasen, waarbij de geactiveerde polysaccharide voor beide geldt. Onder basisomstandigheden activeert CDAP polysaccharidehydroxylen, waardoor DMAP (reactie 1) vrijkomt. CDAP-hydrolyse geeft ook DMAP (reactie 3) vrij. Hoewel een cyano-ester wordt getoond, is dit mogelijk niet het eigenlijke tussenproduct. Het tussenproduct wordt daarom aangeduid als (CDAP) "geactiveerde" polysaccharide. Tijdens de eerste activeringsfase kan de geactiveerde polysacharide hydrolyseren (reactie 4) of nevenreacties ondergaan (reactie 5). In de tweede conjugatiefase (reactie 2) reageert de geactiveerde polysacharide met een amine om naast reacties 4 en 5 ook een stabiele isoureabinding te vormen. Afkortingen: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; R-NH2 = amine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figuur 3: CDAP activering en conjugatie. Het proces vereist het balanceren van CDAP-reactiviteit met de polysaccharide, de stabiliteit van de CDAP en geactiveerde polysaccharide, evenals de reactiviteit van de geactiveerde polysaccharide met die van de amine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve resultaten voor CDAP-activering van dextran. Typische standaardcurven voor de (A) resorcinol/zwavelzuur en (B) TNBS assays. De testresultaten voor dextran geactiveerd met 0,25 en 0,5 mg CDAP/mg dextran worden getoond. Glucose werd gebruikt als de standaard voor de resorcinol-test. Dextran, in mg/ml, wordt gedeeld door 100 kDa om een molaire concentratie te geven. De hydrazideconcentratie wordt bepaald met behulp van ADH als standaard en de resultaten uitgedrukt als μM Hz. (C) Berekening van hydrazide: dextran-verhoudingen. Het niveau van derivatisatie werd berekend als hydraziden per 100 kDa dextran om de vergelijking tussen polymeren van verschillende gemiddelde molecuulgewichten te vergemakkelijken. De % gewichtsverhouding van g ADH/g dextran werd berekend met behulp van een MW van 174 g/mol voor ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Eiwitten en aminebevattende liganden kunnen covalent worden gekoppeld aan polysacchariden die worden geactiveerd door het cyanylation-reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluoroboraat (CDAP), om covalent eiwit (ligand)-polysaccharideconjugaten te vormen. Dit artikel beschrijft een verbeterd protocol voor het uitvoeren van gecontroleerde CDAP-activering bij 0 °C en variërende pH en het uitvoeren van daaropvolgende conjugatie van de geactiveerde polysacchariden.

Activering en conjugatie van oplosbare polysacchariden met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polysacchariden zijn slecht immunogeen, tenzij gekoppeld aan eiwit en moeten worden geactiveerd voor derivatisatie of conjugatie aan eiwitten. Bij deze methode wordt CDAP gebruikt als zandslangingsreagens. De CDAP activeert polysaccharidehydroxylen voor derivatisatie of om te worden gekoppeld aan eiwitten voor gebruik in vaccins of diagnostische reagentia.CDAP heeft cyanogeenbromide grotendeels vervangen als een polysaccharide zand lading reagens. CDAP is eenvoudiger te gebruiken, efficiënter en kan worden gebruikt bij een lagere pH dan cyanogeenbromide. Het is een veel beter activerend reagens.CDAP kan worden gebruikt met de meeste polysacchariden, in tegenstelling tot bijvoorbeeld reductieve aminatie, waarvoor vicinale hydroxylen nodig zijn. De chemie kan worden gebruikt om zowel direct als indirect te conjugeren aan eiwitten, en het kan worden gebruikt om diagnostische reagentia te maken. De CDAP-activeringsreactie, zoals oorspronkelijk beschreven, was zeer snel en moeilijk te controleren.Het protocol dat hier wordt gegeven, maakt de chemie veel gemakkelijker uit te voeren en veel reproduceerbaarder. Voordat u met het experiment begint, moet u de pH van de polysaccharide-oplossing aanpassen aan 9 door tijdens het roeren 200 microliter dimethylaminopyridine-stamoplossing druppelsgewijs toe te voegen. Houd de reactie gekoeld in een ijswaterbad gedurende het hele activeringsproces.Ga verder met cyano-dimethylaminopyridine-tetrafluoroboraat of CDAP-activering door 100 microliter CDAP onder het roeren over te brengen naar de polysaccharide-oplossing. Start de timer en controleer de pH-verandering gedurende de gehele activering gedurende 15 minuten. Handhaaf de reactie op de beoogde pH door onmiddellijk stappen van 10 microliter van 0,1 molair natriumhydroxide toe te voegen.Wanneer de optimale activeringstijd is bereikt, voegt u twee milliliter 0,5 molaire adipic dihydrazide in één keer toe aan de geactiveerde polysaccharide. Controleer of de pH binnen het vereiste bereik ligt voor hydroxidefunctionalisatie. Breng na continu roeren van het reactiemengsel gedurende ten minste één uur het reactiemengsel over in vier graden Celsius.Om de ADH-concentratie van het product te verminderen, dialyseer de ruwe gederivatiseerde polysaccharide-oplossing met behulp van het dialyseapparaat. Herstel de gederivatiseerde polysaccharide uit dialyse en bepaal de concentratie van de polysacchariden en hydrazide om de hydrazide-polysaccharideverhouding te berekenen. Bereid een milligram per milliliter ongewijzigde polysaccharide-oplossing voor gebruik als standaard.Verwarm het verwarmingsblok minimaal een uur voor op 140 graden Celsius om een stabiele uniforme temperatuur te bereiken. Gebruik een beschermende pad onder en rond het verwarmingsblok in geval van zuur morsen. Voeg verschillende volumes van één milligram per milliliter koolhydraatstandaard toe aan de gelabelde 13 bij 100 borosilicaat reageerbuizen in drievoud en vul het volume aan tot 100 microliter met water om de gewenste standaardconcentraties te bereiken.Stel op dezelfde manier monstertests in door een volume met vijf microgram van de gederivatiseerde polysaccharide toe te voegen aan drie monsterbuizen. Voeg 100 microliter vers bereide zes milligram per milliliter resorcinol toe aan elke buis. Voeg met behulp van een herhaalde pipetter 300 microliter van het bereide 75% zwavelzuur toe aan elke buis, draai de buizen krachtig, wijs de buis weg, plaats vervolgens alle buizen in een kachelblok in een gestaag tempo in opeenvolgende volgorde en stel de timer onmiddellijk in op drie minuten.Verwijder na drie minuten de buizen in dezelfde volgorde en plaats ze direct in een rek in een ijswaterbad. Verwijder de ijskoude buisjes om ze vijf minuten op kamertemperatuur te laten balanceren. Lees de absorptie van alle buizen op een UV-Vis spectrofotometer op 430 nanometer met behulp van een 10 millimeter padlengte cuvette.Om testreacties op te zetten, sorteert en rangschikt u de gelabelde standaardbuizen in het buizenrek in volgorde van toenemende concentratie. Voeg met behulp van een gekalibreerde micropipette 100 microliter van de standaarden toe aan elke overeenkomstige buis. Gebruik voor de nulstandaard 100 microliter van de monsterbuffer.Bereid op dezelfde manier de monsterbuizen voor en schik deze. Voeg vervolgens met behulp van een gekalibreerde micropipette van 1.000 microliter 875 microliter testbuffer toe aan alle testbuizen. Om de testreactie te starten, voegt u binnen vijf minuten 25 microliter 1% trinitrobenzeensulfonzuur toe aan elke testbuis in de vooraf bepaalde volgorde.Vortex de testbuizen gedurende twee seconden met hoge snelheid en zorg ervoor dat de vloeistof tot een hoogte van een halve centimeter van de buisopening wervelt. Noteer de starttijd van de test en stel de timer in op twee uur. Plaats vervolgens het assaybuisrek gedurende twee uur in het donker bij kamertemperatuur.Wanneer de tijd voorbij is, vortex de buizen en ga verder met het verzamelen van gegevens. De ADH-dextran werd getest op dextran met behulp van de resorcinol zwavelzuurtest. Een typische standaardbuis met glucose als suikerstandaard werd uitgezet.Het hydrazidegehalte in gederivatiseerde polysaccharide of dextran werd bepaald met behulp van de TNBS-test. Het niveau van derivatisatie werd berekend als hydroogden per 100 kilodalton dextran om de vergelijking tussen polymeren met verschillende gemiddelde molecuulgewichten te vergemakkelijken. Het hier beschreven protocol moet mogelijk worden aangepast voor een specifieke polysacharide.CDAP-chemie kan worden gebruikt om polysacchariden te functionaliseren voor gebruik met een breed scala aan conjugatiereagentia. Het kan bijvoorbeeld worden gebruikt om polysacchariden te biotinyleren voor gebruik in ELISA's. Eiwitten kunnen direct worden gekoppeld aan CDAP-geactiveerde polysacchariden, maar dit vereist meestal enige optimalisatie voor een specifieke polysaccharide.De conjugatieopbrengst kan meer dan 75% zijn Het gebruik van CDAP-chemie heeft goedkope geconjugeerde vaccins mogelijk gemaakt, zoals die bijvoorbeeld door het Serum Institute of India zijn gemaakt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Een celvrij Assay System Het inschatten van de neutraliserende vermogen van GM-CSF antilichaam met behulp van recombinante oplosbare GM-CSF receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...