Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Le travail décrit ici a été financé par Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees est fondateur et propriétaire de Fina Biosolutions. Il détient plusieurs brevets relatifs à la chimie CDAP et bénéficie de licences sur le savoir-faire en chimie et en conjugaison CDAP.

Le CDAP est un réactif pratique pour dévatiser et conjuguer les polysaccharides. Cet article décrit la méthode générale d’utilisation du CDAP pour dévatiser les polysaccharides avec des hydrazides (PS-ADH) et intègre des améliorations récemment publiées8. Tout d’abord, la technique souligne l’importance de maintenir le pH cible pour contrôler le processus d’activation. Nous avons constaté que bien que de nombreux tampons courants interfèrent avec la réaction d’activation du CDAP, le DMAP pouvait être utilisé avec succès comme tampon pour gérer le pH8. De plus, le DMAP est déjà un sous-produit de réaction de l’activation du CDAP. Enfin, la mise en mémoire tampon de la solution de polysaccharide avec du DMAP avant l’ajout du CDAP facilite le ciblage précis et le maintien du pH de la réaction. Comme nous le décrivons, il est utile d’ajuster le pH de la solution centrale concentrée de DMAP de telle sorte que, lorsqu’elle est diluée, elle atteigne le pH ciblé. Deuxièmement, l’exécution du processus dans le froid a ralenti le temps de réaction, rendant le processus d’activation moins frénétique et plus indulgent. Une température plus basse a diminué le taux d’hydrolyse CDAP et le temps d’activation optimal à pH 9 passe de ~3 min à ~15 min. De plus, moins de CDAP est nécessaire pour atteindre le même niveau d’activation que lorsqu’il est effectué à température ambiante. 
Les polysaccharides dérivés de l’ADH peuvent être conjugués à des protéines à l’aide de carbodiimides (par exemple, EDAC)7. Par exemple, plusieurs vaccins homologués contre Haemophilus influenzae b (Hib) utilisent le polyribosylribitolphosphate (PRP) dérivé de l’ADH pour se conjuguer à l’anatoxine tétanique à l’aide de l’EDAC. CNBr a été initialement utilisé, mais CDAP est un réactif beaucoup plus facile à utiliser à cette fin. D’après notre expérience, une bonne plage cible pour la dérivatisation de l’ADH est de 10 à 30 hydrazides par polysaccharide de 100 kDa ou d’environ 1 à 3% d’ADH en poids. 
Le même procédé peut être utilisé pour dévatiser les polysaccharides avec des amines primaires en substituant l’ADH à une diamine. Il est recommandé d’utiliser l’hexane diamine pour dévatiser les polysaccharides avec des amines8. Le polysaccharide aminé (PS-NH2) peut être conjugué à l’aide de réactifs développés pour la conjugaison des protéines11. Typiquement, le PS-NH2 est dérivé avec un maléimide (par exemple, l’ester de succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) ou N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS)), et la protéine est thiolée (par exemple, avec le propionate de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)(SPDP)). La chimie thiol-maléimide est très efficace.
Les protéines peuvent également être directement couplées aux polysaccharides activés par le CDAP via l’ɛ-amine sur les lysines. Bien que le protocole d’activation utilisé soit généralement similaire à celui décrit ici, il est nécessaire d’optimiser le niveau d’activation, la concentration en polysaccharides et en protéines, ainsi que le rapport protéine/polysaccharide5,6,8.
Le dextran est l’un des polysaccharides les plus faciles à activer avec le CDAP en raison de sa densité relativement élevée de groupes hydroxyles, mais certains polysaccharides, tels que l’antigène Vi, peuvent être difficiles. Par conséquent, il n’existe pas de « meilleur » protocole unique pour la conjugaison CDAP directement aux protéines. Nous suggérons d’abord de développer un protocole pour atteindre des niveaux appropriés d’activation, tels que déterminés par l’étendue de la dérivatisation de l’hydrazide, puis de procéder à la conjugaison directe des protéines en polysaccharide activé par CDAP.

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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Les vaccins conjugués, tels que ceux constitués de polysaccharides liés de manière covalente à une protéine porteuse, font partie des avancées remarquables en vaccinologie1,2. Les polysaccharides, en tant qu’antigènes indépendants des lymphocytes T, sont peu immunogènes chez les nourrissons et n’induisent pas la mémoire, le changement de classe ou la maturation d’affinité des anticorps3. Ces lacunes sont surmontées dans les vaccins conjugués polysaccharidiques4. Comme la plupart des polysaccharides n’ont pas de poignée chimique pratique pour la conjugaison, ils doivent d’abord être rendus réactifs ou « activés ». Le polysaccharide activé est alors soit directement lié à la protéine (ou protéine modifiée), soit fonctionnalisé pour une dérivatisation supplémentaire avant conjugaison4. La plupart des vaccins conjugués polysaccharidiques homologués utilisent l’amination réductrice ou la cyanylation pour activer les hydroxyles polysaccharidiques. Le bromure de cyanogène (CNBr), un réactif qui avait déjà été utilisé pour activer les résines de chromatographie, a été initialement utilisé pour la dérivatisation des polysaccharides. Cependant, CNBr nécessite un pH élevé, généralement ~ pH 10,5 ou plus, pour déprotoner partiellement les hydroxyles polysaccharidiques afin qu’ils soient suffisamment nucléophiles pour attaquer le groupe cyano. Le pH élevé peut être préjudiciable aux polysaccharides base-labile, et ni le CNBr ni le cyano-ester actif initialement formé ne sont suffisamment stables à un pH aussi élevé.
CDAP (tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine; Figure 1) a été introduit par Lees et al. pour être utilisé comme agent cyanylant pour l’activation des polysaccharides5,6. Le CDAP, qui est cristallin et facile à manipuler, s’est avéré activer les polysaccharides à un pH inférieur à celui du CNBr et avec moins de réactions secondaires. Contrairement au CNBr, les polysaccharides activés par cdap peuvent être directement conjugués aux protéines, ce qui simplifie le processus de synthèse. Les polysaccharides activés par cdAP peuvent être fonctionnalisés avec une diamine (p. ex. diamine hexane) ou un dihydrazide (p. ex., dihydrazide adipique, ADH) pour fabriquer des polysaccharides dérivés d’amino- ou d’hydrazide. Une forte concentration du réactif homobifonctionnel est utilisée pour supprimer la réticulation des polysaccharides. Les polysaccharides aminés peuvent ensuite être conjugués en utilisant l’une des myriades de techniques utilisées pour la conjugaison des protéines. Les polysaccharides dérivés de l’hydrazide sont souvent couplés à des protéines à l’aide d’un réactif de carbodiimide (par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDAC))7. Une optimisation supplémentaire de l’activation des polysaccharides CDAP a été décrite par Lees et al.8 et est incorporée dans le protocole décrit ici.
Vue d’ensemble de la conjugaison CDAP Le protocole CDAP peut être conceptualisé en deux phases : (1) l’activation du polysaccharide et (2) la conjugaison du polysaccharide activé avec une protéine ou un ligand(Figure 2). Le but de la première étape est d’activer efficacement le polysaccharide, tandis que le but de la seconde est de conjuguer efficacement au polysaccharide activé. Le polysaccharide activé relie les deux étapes ensemble. Cette conceptualisation permet de se concentrer sur les éléments critiques de chaque étape. La figure 2 développe cette conceptualisation, montrant les réactions d’activation et de couplage souhaitées, ainsi que les réactions d’hydrolyse et les réactions secondaires.
Au cours de la phase d’activation, les trois préoccupations majeures sont la stabilité du CDAP, la réaction du CDAP avec les hydroxyles de polysaccharide et la stabilité du polysaccharide activé(Figure 3). L’hydrolyse CDAP augmente avec le pH, tout comme l’hydrolyse du polysaccharide activé et les réactions secondaires. Cependant, la réaction CDAP avec le polysaccharide est facilitée par l’augmentation du pH. L’activation efficace des polysaccharides avec CDAP nécessite un équilibre entre 1) la réactivité du polysaccharide et du CDAP et 2) l’hydrolyse et les réactions secondaires du réactif et du polysaccharide activé.
Dans le protocole d’activation CDAP original décrit par Lees et al.5,l’activation CDAP des polysaccharides a été réalisée à température ambiante dans une solution de pH 9 sans tampon. Le taux d’activation s’est avéré rapide dans cette condition, et l’activation serait terminée dans les 3 minutes. La réaction s’est également accompagnée d’une hydrolyse rapide du CDAP, provoquant une chute rapide du pH de la solution réactionnaire sans tampon. Il était difficile d’augmenter rapidement et de maintenir le pH de réaction à la valeur cible dans un laps de temps aussi court. Dans le protocole décrit, l’activation a été effectuée en ajoutant du CDAP à partir d’une solution stock de 100 mg/mL à la solution de polysaccharide sans tampon. Le pH a été relevé 30 s plus tard avec « un volume égal de 0,2 M de triéthylamine ». La protéine à conjuguer a ensuite été ajoutée après 2,5 minutes à la réaction d’activation. Notamment, le pH de l’étape d’activation n’était pas bien contrôlé et dépassait très probablement initialement le pH cible. La réaction rapide nécessitant un ajustement rapide du pH a rendu le processus d’activation difficile à contrôler et difficile à mettre à l’échelle.
Contrairement au protocole original, le protocole modifié décrit ici présente deux améliorations majeures. Tout d’abord, le pH de la solution de polysaccharide est pré-ajusté pour cibler le pH d’activation, en utilisant le DMAP comme tampon, avant l’ajout de CDAP. DMAP a un pKa de 9,5 et a donc un bon pouvoir tampon autour de pH 9, et contrairement à beaucoup d’autres tampons, DMAP n’a pas été trouvé pour favoriser l’hydrolyse CDAP8. De plus, le DMAP est déjà un intermédiaire de procédé et n’ajoute donc pas de nouveau composant au mélange réactionnel. Le préréglage du pH avant l’ajout de CDAP élimine la grande variation de pH au début de la réaction et permet un maintien plus efficace du pH cible pendant la réaction. La deuxième amélioration consiste à effectuer la réaction d’activation à 0 °C, où le taux d’hydrolyse CDAP est nettement plus lent que celui à température ambiante. Avec la demi-vie plus longue du réactif à 0 °C, le temps d’activation est augmenté de 3 min à 15 min pour compenser le taux d’activation plus lent à la température inférieure. Le temps de réaction plus long, à son tour, facilite le maintien du pH de la réaction. L’utilisation de 0 °C ralentit également la dégradation des polysaccharides sensibles au pH, ce qui permet de préparer des conjugués de ce type de polysaccharide. Les améliorations apportées au protocole rendent le processus d’activation moins frénétique, plus facile à contrôler, plus reproductible et plus facile à mettre à l’échelle.
Cet article décrit le protocole amélioré pour effectuer l’activation CDAP contrôlée du polysaccharide à 0 °C et à un pH cible spécifié et effectuer une dérivatisation ultérieure des polysaccharides activés avec de l’ADH. On décrit également un dosage de l’acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS), basé sur la méthode de Qi et al.9, pour la détermination du taux d’hydrazide sur le polysaccharide modifié. Un dosage modifié pour les hexoses à base de résorcinol et d’acide sulfurique10 est également décrit, qui peut être utilisé pour déterminer une gamme plus large de polysaccharides. Pour plus d’informations sur l’activation et la conjugaison cdap, le lecteur est renvoyé aux publicationsantérieures5,6,8 de Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Les vaccins conjugués sont des avancées remarquables en vaccinologie. Pour la préparation de vaccins conjugués polysaccharidiques, les polysaccharides peuvent être facilement fonctionnalisés et liés aux protéines porteuses du vaccin à l’aide du tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP), un réactif cyanylant facile à manipuler. CdAP active les polysaccharides en réagissant avec les groupes hydroxyles glucidiques à pH 7-9. La stabilité et la réactivité du CDAP dépendent fortement du pH. Le pH de la réaction diminue également lors de l’activation en raison de l’hydrolyse du CDAP, ce qui fait du bon contrôle du pH la clé d’une activation reproductible. Le protocole d’activation CDAP original a été réalisé à température ambiante dans des solutions de pH 9 sans tampon.
En raison de la réaction rapide dans ces conditions (<3 min) et de la chute rapide du pH qui l’accompagne en raison de l’hydrolyse rapide du CDAP, il était difficile d’ajuster et de maintenir rapidement le pH de la réaction cible dans un court laps de temps. Le protocole amélioré décrit ici est effectué à 0 °C, ce qui ralentit l’hydrolyse CDAP et prolonge le temps d’activation de 3 min à ~15 min. La diméthylaminopyridine (DMAP) a également été utilisée comme tampon pour pré-ajuster la solution de polysaccharide au pH d’activation cible avant d’ajouter le réactif CDAP. Le temps de réaction plus long, associé à l’hydrolyse CDAP plus lente et à l’utilisation d’un tampon DMAP, facilite le maintien du pH d’activation pendant toute la durée du processus d’activation. Le protocole amélioré rend le processus d’activation moins frénétique, plus reproductible et plus facile à mettre à l’échelle.

Pour illustrer l’activation et la dérivatisation d’un polysaccharide à l’aide de la chimie CDAP, le dextran a été activé à 0,25 et 0,5 mg de CDAP/mg dextran. Pour chaque réaction, une solution de dextran de 10 mg/mL dans de l’eau a été réfrigérée sur de la glace etle 1/10e volume d’un stock de DMAP de 2,5 M (préparé comme décrit à la rubrique 3) a été ajouté. La solution finale a été portée à pH 9 par addition de NaOH de 0,1 M dans des aliquotes de 10 μL. La solution a été réfrigérée et agitée, le CDAP ajouté et le pH maintenu à pH 9 en ajoutant 10 μL aliquotes de 0,1 M NaOH pendant 15 min. Seulement 0,25 mL de 0,5 M ADH à pH 9 a été ajouté (inférieur à la quantité habituelle) et la réaction a pu se poursuivre pendant la nuit à 4 °C.
Le dextran étiqueté a ensuite été dialysé séquentiellement contre 1 M NaCl, 0,15 M NaCl et de l’eau comme décrit à la rubrique 6. L’ADH-dextran a ensuite été analysé pour le dextran à l’aide du dosage résorcinol/acide sulfurique (rubrique 7.2). Une courbe standard typique utilisant le glucose comme étalon de sucre est illustrée à la figure 4A. La teneur en hydrazide a été déterminée à l’aide du dosage TNBS décrit à la rubrique 7.3. Une courbe standard typique d’hydrazide utilisant l’ADH comme étalon est donnée à la figure 4B.
Des calculs représentatifs de l’activation du dextran aux deux niveaux d’activation sont présentés à la figure 4A,B. Les données sont présentées à la fois sous forme d’hydrazides par 100 kDa de polymère de dextran et en pourcentage en poids d’ADH par rapport au dextran, comme décrit aux rubriques 7.9.3.4 et 7.9.3.5, respectivement, de la figure 4C. Le degré de dérivatisation a presque doublé à mesure que le ratio CDAP a été doublé.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figure 1: Structure chimique du CDAP. CDAP = tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figure 2: Processus d’activation et de conjugaison du CDAP. Le processus est conceptuellement divisé en deux phases, avec le polysaccharide activé commun aux deux. Dans des conditions de base, le CDAP active les hydroxyles polysaccharidiques, libérant du DMAP (réaction 1). L’hydrolyse CDAP libère également du DMAP (réaction 3). Bien qu’un cyano-ester soit montré, ce n’est peut-être pas l’intermédiaire réel. L’intermédiaire est donc appelé polysaccharide « activé » (CDAP). Au cours de la première phase d’activation, le polysaccharide activé peut s’hydrolyser (réaction 4) ou subir des réactions secondaires (réaction 5). Dans la deuxième phase de conjugaison (réaction 2), le polysaccharide activé réagit avec une amine pour former une liaison isourée stable en plus des réactions 4 et 5. Abréviations : CDAP = tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine; DMAP = 4-diméthylaminopyridine; R-NH2 = amine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figure 3: Activation et conjugaison du CDAP. Le processus nécessite d’équilibrer la réactivité du CDAP avec le polysaccharide, la stabilité du CDAP et du polysaccharide activé, ainsi que la réactivité du polysaccharide activé avec celle de l’amine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figure 4: Résultats représentatifs de l’activation CDAP du dextran. Courbes standard typiques pour les essais (A) résorcinol/acide sulfurique et (B) TNBS. Les résultats du test pour le dextran activé avec 0,25 et 0,5 mg cdAP/mg de dextran sont présentés. Le glucose a été utilisé comme norme pour le dosage du résorcinol. Le dextran, en mg/mL, est divisé par 100 kDa pour donner une concentration molaire. La concentration d’hydrazide est déterminée en utilisant l’ADH comme étalon et les résultats exprimés en μM Hz. (C) Calcul des rapports hydrazide:dextran. Le niveau de dérivatisation a été calculé en hydrazides par 100 kDa de dextran pour faciliter la comparaison entre polymères de différents poids moléculaires moyens. Le rapport en % en poids de g ADH/g dextran a été calculé en utilisant un MW de 174 g/mole pour l’ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Les protéines et les ligands contenant des amines peuvent être liés de manière covalente aux polysaccharides activés par le réactif de cyanylation, le tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP), pour former des conjugués protéine covalente (ligand)-polysaccharide. Cet article décrit un protocole amélioré pour effectuer une activation contrôlée du CDAP à 0 °C et faire varier le pH et effectuer une conjugaison ultérieure des polysaccharides activés.

Activation et conjugaison de polysaccharides solubles à l’aide de tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Les polysaccharides sont peu immunogènes à moins d’être liés aux protéines et doivent être activés pour la dérivatisation ou la conjugaison aux protéines. Dans cette méthode, le CDAP est utilisé comme réactif de moulage de sable. Le CDAP active les hydroxyles polysaccharidiques pour la dérivatisation ou pour être liés à des protéines pour une utilisation dans les vaccins ou les réactifs de diagnostic.Le CDAP a largement remplacé le bromure de cyanogène en tant que réactif de moulage de sable polysaccharidique. Le CDAP est plus simple à utiliser, plus efficace et peut être utilisé à un pH inférieur à celui du bromure de cyanogène. C’est un réactif d’activation bien meilleur.CdAP peut être utilisé avec la plupart des polysaccharides, contrairement à l’amination réductrice, qui nécessite des hydroxyles vicinaux. La chimie peut être utilisée pour conjuguer directement et indirectement aux protéines, et elle peut être utilisée pour fabriquer des réactifs de diagnostic. La réaction d’activation du CDAP, telle que décrite à l’origine, était très rapide et difficile à contrôler.Le protocole fourni ici rend la chimie beaucoup plus facile à effectuer et beaucoup plus reproductible. Avant de commencer l’expérience, ajustez le pH de la solution de polysaccharide à 9 en ajoutant 200 microlitres de solution stock de diméthylaminopyridine de manière goutte à goutte tout en remuant. Gardez la réaction au frais dans un bain-marie pendant tout le processus d’activation.Procéder à l’activation du cyano-diméthylaminopyridine-tétrafluoroborate ou du CDAP en transférant 100 microlitres de CDAP dans la solution de polysaccharides pendant l’agitation. Démarrez la minuterie et surveillez le changement de pH pendant toute l’activation pendant 15 minutes. Maintenez la réaction au pH cible en ajoutant rapidement 10 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,1 molaire.Lorsque le temps d’activation optimal est atteint, ajouter deux millilitres de dihydrazide adipique de 0,5 molaire en une seule fois au polysaccharide activé. Vérifiez que le pH est dans la plage requise pour la fonctionnalisation de l’hydroxyde. Après agitation continue du mélange réactionnel pendant au moins une heure, transférer le mélange réactionnel à quatre degrés Celsius.Pour réduire la concentration d’ADH du produit, dialysez la solution de polysaccharide dérivatisée brute à l’aide du dispositif de dialyse. Récupérez le polysaccharide dérivé de la dialyse et déterminez la concentration des polysaccharides et de l’hydrazide pour calculer le rapport hydrazide/polysaccharide. Préparer un milligramme par millilitre de solution polysaccharidique non modifiée à utiliser comme étalon.Préchauffez le bloc chauffant à 140 degrés Celsius pendant au moins une heure pour obtenir une température uniforme stable. Utilisez un coussin de protection sous et autour du bloc chauffant en cas de déversement d’acide. Ajouter des volumes variables d’un milligramme par millilitre de glucides standard aux tubes à essai 13 par 100 borosilicates étiquetés en trois exemplaires et augmenter le volume à 100 microlitres avec de l’eau pour atteindre les concentrations standard souhaitées.De même, mettez en place des tests d’échantillon en ajoutant un volume contenant cinq microgrammes du polysaccharide dérivé à trois tubes d’échantillonnage. Ajouter 100 microlitres de six milligrammes par millilitre de résorcinol fraîchement préparés à chaque tube. À l’aide d’un pipetter répétitif, ajoutez 300 microlitres d’acide sulfurique à 75% préparé à chaque tube, vortexez vigoureusement les tubes en pointant le tube, puis placez tous les tubes dans un bloc chauffant à un rythme régulier dans l’ordre séquentiel et réglez immédiatement la minuterie pendant trois minutes.À trois minutes, retirez les tubes dans le même ordre et placez-les directement dans une grille dans un bain-marie. Retirez les tubes glacés pour leur permettre de s’équilibrer à la température ambiante pendant cinq minutes. Lisez l’absorbance de tous les tubes sur un spectrophotomètre UV-Vis à 430 nanomètres à l’aide d’une cuvette de 10 millimètres de longueur de trajet.Pour mettre en place des réactions de dosage, triez et disposez les tubes standard étiquetés dans le rack de tubes par ordre de concentration croissante. À l’aide d’une micropipette calibrée, ajoutez 100 microlitres des étalons à chaque tube correspondant. Pour l’étalon zéro, utilisez 100 microlitres du tampon d’échantillon.De même, préparez et disposez les tubes d’échantillonnage. Ensuite, à l’aide d’une micropipette calibrée de 1 000 microlitres, ajoutez 875 microlitres de tampon d’essai à tous les tubes d’essai. Pour commencer la réaction d’essai, ajoutez 25 microlitres d’acide trinitrobenzène sulfonique à 1% à chaque tube d’essai dans l’ordre prédéterminé dans les cinq minutes.Vortex les tubes d’essai pendant deux secondes à grande vitesse, en s’assurant que le liquide tourbillonne à une hauteur d’un demi-pouce de l’ouverture du tube. Enregistrez l’heure de début du test et réglez la minuterie sur deux heures. Placez ensuite le porte-tubes d’essai dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures.Lorsque le temps est terminé, vortex les tubes et procéder à la collecte de données. L’ADH dextran a été analysé pour le dextran à l’aide du dosage de l’acide sulfurique résorcinol. Un tube standard typique utilisant le glucose comme étalon de sucre a été tracé.La teneur en hydrazide du polysaccharide dérivé ou du dextran a été déterminée à l’aide du test TNBS. Le niveau de dérivatisation a été calculé en hydrures par 100 kilodaltons de dextran pour faciliter la comparaison entre polymères de différents poids moléculaires moyens. Le protocole décrit ici peut devoir être adapté pour un polysaccharide spécifique.La chimie CDAP peut être utilisée pour fonctionnaliser les polysaccharides pour une utilisation avec une grande variété de réactifs de conjugaison. Il peut être utilisé, par exemple, pour biotinyler les polysaccharides pour une utilisation dans les ELISA. Les protéines peuvent être directement liées aux polysaccharides activés par le CDAP, mais cela nécessite généralement une certaine optimisation pour un polysaccharide spécifique.Le rendement de conjugaison peut être supérieur à 75%L’utilisation de la chimie CDAP a permis des vaccins conjugués à faible coût, comme ceux fabriqués, par exemple, par le Serum Institute of India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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