Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
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Die hier beschriebene Arbeit wurde von Fina Biosolutions LLC finanziert.

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	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees ist Gründer und Inhaber von Fina Biosolutions. Er hält mehrere Patente in Bezug auf cdAP-Chemie und profitiert von der Lizenzierung des Chemie- und CDAP-Konjugations-Know-hows.

CDAP ist ein praktisches Reagenz zur Derivatisierung und Konjugierung von Polysacchariden. Dieser Artikel beschreibt die allgemeine Methode zur Verwendung von CDAP zur Derivatisierung von Polysacchariden mit Hydraziden (PS-ADH) und enthält kürzlich veröffentlichte Verbesserungen8. Erstens betont die Technik, wie wichtig es ist, den Ziel-pH-Wert aufrechtzuerhalten, um den Aktivierungsprozess zu kontrollieren. Wir fanden heraus, dass, während viele gängige Puffer die CDAP-Aktivierungsreaktion stören, DMAP erfolgreich als Puffer zur Verwaltung despH-Werts 8verwendet werden könnte. Darüber hinaus ist DMAP bereits ein Reaktionsnebenprodukt der CDAP-Aktivierung. Schließlich ermöglicht die Pufferung der Polysaccharidlösung mit DMAP vor der Zugabe des CDAP eine präzise Ausrichtung und Aufrechterhaltung des pH-Werts der Reaktion. Wie wir beschreiben, ist es nützlich, den pH-Wert der konzentrierten DMAP-Stammlösung so einzustellen, dass sie, wenn sie verdünnt wird, den angestrebten pH-Wert erreicht. Zweitens verlangsamte die Durchführung des Prozesses in der Kälte die Reaktionszeit, wodurch der Aktivierungsprozess weniger hektisch und verzeihender wurde. Eine niedrigere Temperatur verringerte die CDAP-Hydrolyserate, und die optimale Aktivierungszeit bei pH 9 steigt von ~ 3 min auf ~ 15 min. Darüber hinaus ist weniger CDAP erforderlich, um das gleiche Aktivierungsniveau zu erreichen, als bei Raumtemperatur. 
ADH-derivatisierte Polysaccharide können mit Carbodiimiden (z.B. EDAC)7zu Proteinen konjugiert werden. Zum Beispiel verwenden mehrere zugelassene Haemophilus influenzae b (Hib) -Impfstoffe das polyribosylribitolphosphat (PRP), das mit ADH derivatisiert wurde, um mit EDAC zu Tetanustoxoid zu konjugieren. CNBr wurde ursprünglich verwendet, aber CDAP ist ein viel einfacheres Reagenz für diesen Zweck. Nach unserer Erfahrung liegt ein guter Zielbereich für die ADH-Derivatisierung bei 10-30 Hydraziden pro 100 kDa Polysaccharid oder ~1-3 Gewachsprozent. 
Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um Polysaccharide mit primären Aminen zu derivatisieren, indem die ADH durch ein Diamin ersetzt wird. Es wird empfohlen, Hexandiamin zu verwenden, um Polysaccharide mit Aminen8 zuderivatisieren. Das aminierte Polysaccharid(PS-NH2)kann mit Reagenzien konjugiert werden, die für die Proteinkonjugation entwickelt wurden11. Typischerweise wird das PS-NH2 mit einem Maleimid (z. B. Succinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) oder N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimid-Ester (GMBS)) derivatisiert und das Protein thioliert (z. B. mit Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Die Thiol-Maleimid-Chemie ist sehr effizient.
Proteine können auch direkt an CDAP-aktivierte Polysaccharide über das ɛ-Amin an Lysine gekoppelt werden. Während das verwendete Aktivierungsprotokoll im Allgemeinen dem hier beschriebenen ähnlich ist, ist es notwendig, das Aktivierungsniveau, die Polysaccharid- und Proteinkonzentration sowie das Protein:Polysaccharid-Verhältnis5,6,8zu optimieren. 
Dextran ist eines der am einfachsten zu aktivierenden Polysaccharide mit CDAP aufgrund seiner relativ hohen Dichte an Hydroxylgruppen, aber einige Polysaccharide, wie das Vi-Antigen, können eine Herausforderung darstellen. Folglich gibt es kein einziges "bestes" Protokoll für die CDAP-Konjugation direkt mit Proteinen. Wir schlagen vor, zunächst ein Protokoll zu entwickeln, um geeignete Aktivierungsniveaus zu erreichen, die durch das Ausmaß der Hydrazidderivatisierung bestimmt werden, und dann mit der direkten Proteinkonjugation zu CDAP-aktiviertem Polysaccharid fortzufahren.

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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Konjugierte Impfstoffe, wie sie aus Polysacchariden bestehen, die kovalent mit einem Trägerprotein verbunden sind, gehören zu den bemerkenswerten Fortschritten in der Vakzinologie1,2. Polysaccharide sind als T-Zell-unabhängige Antigene bei Säuglingen schlecht immunogen und induzieren kein Gedächtnis, Klassenwechsel oder Affinitätsreifung von Antikörpern3. Diese Mängel werden in Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffen überwunden4. Da die meisten Polysaccharide keinen geeigneten chemischen Griff für die Konjugation haben, müssen sie zuerst reaktiv oder "aktiviert" werden. Das aktivierte Polysaccharid wird dann entweder direkt mit dem Protein (oder modifizierten Protein) verknüpft oder vor der Konjugation zur zusätzlichen Derivatisierung funktionalisiert4. Die meisten zugelassenen Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffe verwenden entweder reduktive Aminierung oder Cyanylierung, um Polysaccharidhydroxyle zu aktivieren. Cyanogenbromid (CNBr), ein Reagenz, das zuvor zur Aktivierung von Chromatographieharzen verwendet wurde, wurde zunächst zur Polysaccharidderivatisierung verwendet. CNBr erfordert jedoch einen hohen pH-Wert, typischerweise ~ pH 10,5 oder mehr, um Polysaccharidhydroxyle teilweise zu deprotonieren, so dass sie ausreichend nukleophil sind, um die Cyanogruppe anzugreifen. Der hohe pH-Wert kann sich nachteilig auf baselabile Polysaccharide auswirken, und weder CNBr noch der ursprünglich gebildete aktive Cyanoester sind bei einem so hohen pH-Wert ausreichend stabil.
CDAP (1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat; Abbildung 1) wurde von Lees et al. zur Verwendung als Cyylierungsmittel zur Aktivierung von Polysaccharideneingeführt 5,6. Es wurde festgestellt, dass CDAP, das kristallin und einfach zu handhaben ist, Polysaccharide bei einem niedrigeren pH-Wert als CNBr und mit weniger Nebenreaktionen aktiviert. Im Gegensatz zu CNBr können CDAP-aktivierte Polysaccharide direkt mit Proteinen konjugiert werden, was den Syntheseprozess vereinfacht. CDAP-aktivierte Polysaccharide können mit einem Diamin (z. B. Hexandiamin) oder einem Dihydrazid (z. B. adipinisches Dihydrazid, ADH) funktionalisiert werden, um amino- oder hydrazidderivatisierte Polysaccharide herzustellen. Eine hohe Konzentration des homobifunktionellen Reagenzes wird verwendet, um die Vernetzung von Polysacchariden zu unterdrücken. Aminopolysaccharide können dann mit einer der unzähligen Techniken zur Proteinkonjugation konjugiert werden. Hydrazid-derivatisierte Polysaccharide werden häufig mit einem Carbodiimid-Reagenz (z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC)) an Proteine gekoppelt7. Eine weitere Optimierung der CDAP-Polysaccharidaktivierung wurde von Lees et al.8 beschrieben und ist in das hier beschriebene Protokoll integriert.
Übersicht über die CDAP-Konjugation Das CDAP-Protokoll kann als zwei Phasen konzipiert werden: (1) die Aktivierung des Polysaccharids und (2) die Konjugation des aktivierten Polysaccharids mit einem Protein oder Liganden (Abbildung 2). Ziel des ersten Schritts ist es, das Polysaccharid effizient zu aktivieren, während das Ziel des zweiten Schritts darin besteht, effizient an das aktivierte Polysaccharid zu konjugieren. Das aktivierte Polysaccharid bindet die beiden Schritte zusammen. Diese Konzeptualisierung hilft, sich auf die kritischen Elemente jedes Schritts zu konzentrieren. Abbildung 2 erweitert diese Konzeptualisierung und zeigt die gewünschten Aktivierungs- und Kopplungsreaktionen sowie die Hydrolysereaktionen und Nebenreaktionen.
Während der Aktivierungsphase sind die drei Hauptanliegen die CDAP-Stabilität, die CDAP-Reaktion mit den Polysaccharidhydroxylen und die Stabilität des aktivierten Polysaccharids (Abbildung 3). Die CDAP-Hydrolyse nimmt mit dem pH-Wert zu, ebenso wie die Hydrolyse des aktivierten Polysaccharids und die Nebenreaktionen. Die CDAP-Reaktion mit dem Polysaccharid wird jedoch durch Erhöhung des pH-Werts erleichtert. Die effiziente Aktivierung von Polysacchariden mit CDAP erfordert ein Gleichgewicht zwischen 1) der Reaktivität des Polysaccharids und CDAP und 2) der Hydrolyse und nebenreaktionen sowohl des Reagenzes als auch des aktivierten Polysaccharids.
Im ursprünglichen CDAP-Aktivierungsprotokoll, das von Lees et al.5beschrieben wurde, wurde die CDAP-Aktivierung von Polysacchariden bei Raumtemperatur in ungepufferter pH-9-Lösung durchgeführt. Die Aktivierungsrate erwies sich unter dieser Bedingung als schnell und die Aktivierung wäre innerhalb von 3 Minuten abgeschlossen. Die Reaktion wurde auch von einer schnellen Hydrolyse von CDAP begleitet, was zu einem schnellen pH-Abfall der ungepufferten Reaktionslösung führte. Es war eine Herausforderung, den Reaktions-pH-Wert in so kurzer Zeit schnell anzuheben und am Zielwert zu halten. Im beschriebenen Protokoll wurde die Aktivierung durch Zugabe von CDAP aus einer 100 mg/ml Stammlösung zur ungepufferten Polysaccharidlösung durchgeführt. Der pH-Wert wurde 30 s später mit "einem gleichen Volumen von 0,2 M Triethylamin" erhöht. Das zu konjugierte Protein wurde dann nach 2,5 min zur Aktivierungsreaktion hinzugefügt. Bemerkenswerterweise war der pH-Wert des Aktivierungsschritts nicht gut kontrolliert und überschritt höchstwahrscheinlich zunächst den Ziel-pH-Wert. Die schnelle Reaktion, die eine sofortige pH-Anpassung erforderte, machte den Aktivierungsprozess schwer zu kontrollieren und schwierig zu skalieren.
Im Gegensatz zum ursprünglichen Protokoll weist das hier beschriebene modifizierte Protokoll zwei wesentliche Verbesserungen auf. Zuerst wird der pH-Wert der Polysaccharidlösung vor der Zugabe von CDAP auf den pH-Wert der Zielaktivierung unter Verwendung von DMAP als Puffer vorjustiert. DMAP hat eine pKa von 9,5 und hat somit eine gute Pufferleistung um pH 9, und im Gegensatz zu vielen anderen Puffern wurde nicht festgestellt, dass DMAP die CDAP-Hydrolysefördert 8. Darüber hinaus ist DMAP bereits ein Prozesszwischenprodukt und fügt dem Reaktionsgemisch daher keine neue Komponente hinzu. Die Voreinstellung des pH-Werts vor der Zugabe von CDAP eliminiert den großen pH-Schwung zu Beginn der Reaktion und ermöglicht eine effizientere Aufrechterhaltung des Ziel-pH-Werts während der Reaktion. Die zweite Verbesserung besteht darin, die Aktivierungsreaktion bei 0 °C durchzuführen, wobei die CDAP-Hydrolyserate deutlich langsamer ist als bei Raumtemperatur. Mit der längeren Reagenzhalbwertszeit bei 0 °C wird die Aktivierungszeit von 3 min auf 15 min erhöht, um die langsamere Aktivierungsrate bei der niedrigeren Temperatur auszugleichen. Die längere Reaktionszeit wiederum erleichtert die Aufrechterhaltung des Reaktions-pH-Werts. Die Verwendung von 0 °C verlangsamt auch den Abbau von pH-empfindlichen Polysacchariden, so dass Konjugate dieser Art von Polysacchariden vorbereitet werden können. Die Verbesserungen im Protokoll machen den Aktivierungsprozess weniger hektisch, einfacher zu kontrollieren, reproduzierbarer und zugänglicher für die Skalierung.
Dieser Artikel beschreibt das verbesserte Protokoll zur Durchführung einer kontrollierten CDAP-Aktivierung von Polysaccharid bei 0 °C und bei einem bestimmten Ziel-pH-Wert und zur anschließenden Derivatisierung der aktivierten Polysaccharide mit ADH. Ebenfalls beschrieben ist ein Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) Assay, basierend auf der Methode von Qi et al.9,zur Bestimmung des Hydrazidgehalts an dem modifizierten Polysaccharid. Ein modifizierter Assay für Hexosen auf Basis von Resorcin und Schwefelsäure10 wird ebenfalls beschrieben, der zur Bestimmung eines breiteren Spektrums von Polysacchariden verwendet werden kann. Für weitere Informationen zur CDAP-Aktivierung und -Konjugation wird der Leser auf frühere Publikationen5,6,8 von Lees et al. verwiesen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Konjugierte Impfstoffe sind bemerkenswerte Fortschritte in der Vakzinologie. Für die Herstellung von Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffen können die Polysaccharide mit 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP), einem einfach zu handhabenden cyylierenden Reagenz, bequem funktionalisiert und mit Impfstoffträgerproteinen verknüpft werden. CDAP aktiviert Polysaccharide, indem es mit Kohlenhydrathydroxylgruppen bei pH 7-9 reagiert. Die Stabilität und Reaktivität von CDAP sind stark pH-abhängig. Der pH-Wert der Reaktion sinkt auch während der Aktivierung aufgrund der Hydrolyse von CDAP, was eine gute pH-Kontrolle zum Schlüssel für eine reproduzierbare Aktivierung macht. Das ursprüngliche CDAP-Aktivierungsprotokoll wurde bei Raumtemperatur in ungepufferten pH-9-Lösungen durchgeführt.
Aufgrund der schnellen Reaktion unter dieser Bedingung (<3 min) und des damit einhergehenden schnellen pH-Abfalls aus der schnellen CDAP-Hydrolyse war es schwierig, den Zielreaktions-pH-Wert in kurzer Zeit schnell anzupassen und aufrechtzuerhalten. Das hier beschriebene verbesserte Protokoll wird bei 0 °C durchgeführt, was die CDAP-Hydrolyse verlangsamt und die Aktivierungszeit von 3 min auf ~15 min verlängert. Dimethylaminopyridin (DMAP) wurde auch als Puffer verwendet, um die Polysaccharidlösung vor der Zugabe des CDAP-Reagens an den pH-Wert der Zielaktivierung anzupassen. Die längere Reaktionszeit, gepaart mit der langsameren CDAP-Hydrolyse und der Verwendung von DMAP-Puffer, erleichtert die Aufrechterhaltung des Aktivierungs-pH-Werts für die gesamte Dauer des Aktivierungsprozesses. Das verbesserte Protokoll macht den Aktivierungsprozess weniger hektisch, reproduzierbarer und skalierbarer.

Um die Aktivierung und Derivatisierung eines Polysaccharids mittels CDAP-Chemie zu veranschaulichen, wurde Dextran bei 0,25 und 0,5 mg CDAP/mg Dextran aktiviert. Für jede Reaktion wurde eine 10 mg/ml Dextranlösung in Wasser auf Eis gekühlt und 1/10 Volumen eines 2,5 M DMAP-Vorrats (hergestellt wie in Abschnitt 3 beschrieben) zugegeben. Die endgültige Lösung wurde durch Zugabe von 0,1 M NaOH in 10 μL Aliquoten auf pH 9 gebracht. Die Lösung wurde gekühlt und gerührt, CDAP hinzugefügt und der pH-Wert bei pH 9 gehalten, indem 10 μL Aliquoten von 0,1 M NaOH für 15 min hinzugefügt wurden. Nur 0,25 ml 0,5 M ADH bei pH 9 wurden zugegeben (weniger als die übliche Menge) und die Reaktion konnte über Nacht bei 4 °C fortgesetzt werden.
Das markierte Dextran wurde dann sequenziell gegen 1 M NaCl, 0,15 M NaCl und Wasser dialysiert, wie in Abschnitt 6 beschrieben. Das ADH-Dextran wurde dann mit dem Resorcin/Schwefelsäure-Assay auf Dextran untersucht (Abschnitt 7.2). Eine typische Standardkurve, die Glukose als Zuckerstandard verwendet, ist in Abbildung 4A dargestellt. Der Hydrazidgehalt wurde mit dem in Abschnitt 7.3 beschriebenen TNBS-Assay bestimmt. Eine typische Hydrazid-Standardkurve mit ADH als Standard ist in Abbildung 4Bdargestellt.
Repräsentative Berechnungen aus der Aktivierung von Dextran auf den beiden Aktivierungsebenen sind in Abbildung 4A,B dargestellt. Die Daten werden sowohl als Hydrazide pro 100 kDa Dextranpolymer als auch als Gewichtsprozent ADH zu Dextran dargestellt, wie in den Abschnitten 7.9.3.4 bzw. 7.9.3.5 in Abbildung 4Cbeschrieben. Der Derivatisierungsgrad verdoppelte sich in etwa, als sich das CDAP-Verhältnis verdoppelte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Abbildung 1: Chemische Struktur von CDAP. CDAP = 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Abbildung 2: Prozess der CDAP-Aktivierung und -Konjugation. Der Prozess ist konzeptionell in zwei Phasen unterteilt, wobei das aktivierte Polysaccharid beiden gemeinsam ist. Unter grundlegenden Bedingungen aktiviert CDAP Polysaccharidhydroxyle und setzt DMAP frei (Reaktion 1). Die CDAP-Hydrolyse setzt auch DMAP frei (Reaktion 3). Obwohl ein Cyanoester gezeigt wird, ist dies möglicherweise nicht das eigentliche Zwischenprodukt. Das Zwischenprodukt wird daher als (CDAP) "aktiviertes" Polysaccharid bezeichnet. Während der ersten Aktivierungsphase kann das aktivierte Polysaccharid hydrolysieren (Reaktion 4) oder Nebenreaktionen (Reaktion 5) durchlaufen. In der zweiten Konjugationsphase (Reaktion 2) reagiert das aktivierte Polysaccharid mit einem Amin, um neben den Reaktionen 4 und 5 eine stabile Isoureabindung zu bilden. Abkürzungen: CDAP = 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat; DMAP = 4-Dimethylaminopyridin; R-NH2 = Amin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Abbildung 3:CDAP-Aktivierung und -Konjugation. Der Prozess erfordert ein Gleichgewicht zwischen der CDAP-Reaktivität mit dem Polysaccharid, der Stabilität des CDAP und des aktivierten Polysaccharids sowie der Reaktivität des aktivierten Polysaccharids mit der des Amins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse für die CDAP-Aktivierung von Dextran. Typische Standardkurven für die (A) Resorcin/Schwefelsäure und (B) TNBS Assays. Die Assay-Ergebnisse für Dextran, das mit 0,25 und 0,5 mg CDAP/mg Dextran aktiviert wurde, werden gezeigt. Glukose wurde als Standard für den Resorcin-Assay verwendet. Dextran, in mg / ml, wird durch 100 kDa geteilt, um eine molare Konzentration zu erhalten. Die Hydrazidkonzentration wird unter Verwendung von ADH als Standard bestimmt und die Ergebnisse als μM Hz ausgedrückt. (C) Berechnung von Hydrazid: Dextranverhältnissen. Der Grad der Derivatisierung wurde als Hydrazide pro 100 kDa Dextran berechnet, um den Vergleich zwischen Polymeren unterschiedlicher mittlerer Molekulargewichte zu erleichtern. Das Prozentgewicht von g ADH/g Dextran wurde mit einem MW von 174 g/Mol für ADH berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteine und aminhaltige Liganden können kovalent mit Polysacchariden verknüpft werden, die durch das Cyanylierungsreagenz 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) aktiviert werden, um kovalente Protein-(Liganden)-Polysaccharid-Konjugate zu bilden. Dieser Artikel beschreibt ein verbessertes Protokoll für die Durchführung einer kontrollierten CDAP-Aktivierung bei 0 °C und variierendem pH-Wert und die anschließende Konjugation der aktivierten Polysaccharide.

Aktivierung und Konjugation löslicher Polysaccharide unter Verwendung von 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polysaccharide sind schlecht immunogen, es sei denn, sie sind mit Proteinen verbunden und müssen für die Derivatisierung oder Konjugation mit Proteinen aktiviert werden. Bei dieser Methode wird CDAP als Sandpfannenreagenz verwendet. Das CDAP aktiviert Polysaccharidhydroxyle zur Derivatisierung oder zur Verknüpfung mit Proteinen für die Verwendung in Impfstoffen oder diagnostischen Reagenzien.CDAP hat Cyanogenbromid als Polysaccharid-Sand-Lading-Reagenz weitgehend ersetzt. CDAP ist einfacher zu verwenden, effizienter und kann bei einem niedrigeren pH-Wert als Cyanogenbromid verwendet werden. Es ist ein viel besseres aktivierendes Reagenz.CDAP kann mit den meisten Polysacchariden verwendet werden, im Gegensatz zu einer reduktiven Aminierung, die vicinale Hydroxyle erfordert. Die Chemie kann sowohl direkt als auch indirekt mit Proteinen konjugiert werden, und sie kann verwendet werden, um diagnostische Reagenzien herzustellen. Die CDAP-Aktivierungsreaktion, wie ursprünglich beschrieben, war sehr schnell und schwer zu kontrollieren.Das hier bereitgestellte Protokoll macht die Chemie viel einfacher durchzuführen und viel reproduzierbarer. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, stellen Sie den pH-Wert der Polysaccharidlösung auf 9 ein, indem Sie unter Rühren 200 Mikroliter Dimethylaminopyridin-Stammlösung tropfenweise hinzufügen. Halten Sie die Reaktion während des gesamten Aktivierungsprozesses in einem Eiswasserbad gekühlt.Fahren Sie mit der Cyano-Dimethylaminopyridin-Tetrafluoroborat- oder CDAP-Aktivierung fort, indem Sie unter Rühren 100 Mikroliter CDAP in die Polysaccharidlösung überführen. Starten Sie den Timer und überwachen Sie die pH-Änderung während der gesamten Aktivierung für 15 Minuten. Halten Sie die Reaktion auf dem Ziel-pH-Wert, indem Sie umgehend 10 Mikroliterschritte von 0,1 molarem Natriumhydroxid hinzufügen.Wenn die optimale Aktivierungszeit erreicht ist, fügen Sie dem aktivierten Polysaccharid zwei Milliliter 0,5 molares adipinisches Dihydrazid auf einmal hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert im erforderlichen Bereich für die Hydroxidfunktionalisierung liegt. Nach kontinuierlichem Rühren des Reaktionsgemisches für mindestens eine Stunde wird das Reaktionsgemisch auf vier Grad Celsius übertragen.Um die ADH-Konzentration aus dem Produkt zu reduzieren, dialysieren Sie die rohe derivatisierte Polysaccharidlösung mit dem Dialysegerät. Gewinnen Sie das derivatisierte Polysaccharid aus der Dialyse zurück und bestimmen Sie die Konzentration der Polysaccharide und Hydrazide, um das Verhältnis von Hydrazid zu Polysaccharid zu berechnen. Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter unmodifizierte Polysaccharidlösung vor, die als Standard verwendet werden soll.Den Heizblock mindestens eine Stunde auf 140 Grad Celsius vorheizen, um eine stabile gleichmäßige Temperatur zu erreichen. Verwenden Sie ein Schutzpad unter und um den Heizblock herum, falls Säure verschüttet wird. Fügen Sie den markierten 13 x 100 Borosilikat-Reagenzgläsern in Triplikaten unterschiedliche Mengen von einem Milligramm pro Milliliter Kohlenhydratstandard hinzu und machen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 Mikroliter, um die gewünschten Standardkonzentrationen zu erreichen.In ähnlicher Weise richten Sie Probenassays ein, indem Sie ein Volumen mit fünf Mikrogramm des derivatisierten Polysaccharids in drei Probenröhrchen geben. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete sechs Milligramm pro Milliliter Resorcin zu jedem Röhrchen hinzu. Fügen Sie mit einem wiederholten Pipetter 300 Mikroliter der vorbereiteten 75% Schwefelsäure zu jedem Rohr hinzu, wirbeln Sie die Rohre kräftig ein, richten Sie das Rohr weg, legen Sie dann alle Rohre in einem gleichmäßigen Tempo in sequenzieller Reihenfolge in einen Heizblock und stellen Sie den Timer sofort für drei Minuten ein.Nach drei Minuten die Schläuche in der gleichen Reihenfolge entfernen und direkt in ein Gestell in einem Eiswasserbad legen. Entfernen Sie die eiskalten Röhren, damit sie sich fünf Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen können. Lesen Sie die Absorption aller Röhrchen auf einem UV-Vis-Spektralphotometer bei 430 Nanometern mit einer 10-Millimeter-Pfadlängenküvette.Um Assay-Reaktionen einzurichten, sortieren und ordnen Sie die markierten Standardröhrchen im Röhrchengestell in der Reihenfolge der zunehmenden Konzentration an. Fügen Sie mit einer kalibrierten Mikropipette 100 Mikroliter der Standards zu jedem entsprechenden Rohr hinzu. Verwenden Sie für den Nullstandard 100 Mikroliter des Probenpuffers.Bereiten Sie die Probenröhrchen ebenfalls vor und ordnen Sie sie an. Dann mit einer kalibrierten 1.000 Mikroliter Mikropipette 875 Mikroliter Assay-Puffer zu allen Assay-Röhrchen hinzufügen. Um die Assay-Reaktion zu starten, fügen Sie innerhalb von fünf Minuten 25 Mikroliter 1% Trinitrobenzolsulfonsäure in jedem Assay-Röhrchen in der vorgegebenen Reihenfolge hinzu.Wirbeln Sie die Assay-Röhrchen für zwei Sekunden mit hoher Geschwindigkeit vor und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit bis zu einer Höhe von einem halben Zoll von der Rohröffnung wirbelt. Notieren Sie die Startzeit des Assays und stellen Sie den Timer auf zwei Stunden ein. Dann stellen Sie das Assay-Tube-Rack für zwei Stunden bei Raumtemperatur in die Dunkelheit.Wenn die Zeit vorbei ist, wirbeln Sie die Rohre und fahren Sie mit der Datenerfassung fort. Das ADH-Dextran wurde mit dem Resorcin-Schwefelsäure-Assay auf Dextran untersucht. Ein typisches Standardröhrchen mit Glukose als Zuckerstandard wurde gezeichnet.Der Hydrazidgehalt in derivatisiertem Polysaccharid oder Dextran wurde mit dem TNBS-Assay bestimmt. Der Grad der Derivatisierung wurde als Hydride pro 100 Kilodalton Dextran berechnet, um den Vergleich zwischen Polymeren unterschiedlicher mittlerer Molekulargewichte zu erleichtern. Das hier beschriebene Protokoll muss möglicherweise für ein bestimmtes Polysaccharid angepasst werden.CdAP-Chemie kann verwendet werden, um Polysaccharide für die Verwendung mit einer Vielzahl von Konjugationsreagenzien zu funktionalisieren. Es kann beispielsweise verwendet werden, um Polysaccharide für den Einsatz in ELISAs zu biotinylatieren. Proteine können direkt mit CDAP-aktivierten Polysacchariden in Verbindung gebracht werden, dies erfordert jedoch in der Regel eine gewisse Optimierung für ein bestimmtes Polysaccharid.Die Konjugationsausbeute kann über 75% betragen Die Verwendung der CDAP-Chemie hat kostengünstige Konjugiertimpfstoffe ermöglicht, wie sie beispielsweise vom Serum Institute of India hergestellt wurden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basophilenaktivierungstest für die Untersuchung von IgE-vermittelten Mechanismen in Drug Überempfindlichkeit

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...