Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

העבודה המתוארת כאן מומנה על ידי Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

אנדרו ליס הוא המייסד והבעלים של פינה ביוסולוטיונים. הוא מחזיק במספר פטנטים הנוגעים לכימיה של CDAP ויתרונות ברישוי של ידע הכימיה וההטיה של CDAP.

CDAP הוא ריאגנט נוח לגזור ולצדות פוליסכרידים. מאמר זה מתאר את השיטה הכללית לשימוש ב- CDAP כדי להפיק פוליסכרידים עם הידרזידים (PS-ADH) ומשלב שיפורים שפורסמו לאחרונה8. ראשית, הטכניקה מדגישה את החשיבות של שמירה על pH היעד כדי לשלוט בתהליך ההפעלה. מצאנו כי בעוד מאגרים נפוצים רבים להפריע תגובת הפעלת CDAP, DMAP יכול לשמש בהצלחה כחוצץ לניהול pH8. יתר על כן, DMAP הוא כבר תוצר לוואי של תגובה של הפעלת CDAP. לבסוף, אגירת פתרון הפוליסכריד עם DMAP לפני הוספת ה- CDAP מקלה על פילוח ותחזוקה מדויקים של pH התגובה. כפי שאנו מתארים, כדאי להתאים את ה- pH של פתרון מלאי DMAP מרוכז כך שכאשר מדולל, הוא מגיע ל- pH היעד. שנית, ביצוע התהליך בקור האט את זמן התגובה, מה שהופך את תהליך ההפעלה לפחות תזזיתי ויותר סלחני. טמפרטורה נמוכה יותר הפחיתה את קצב ההידרוליזה של CDAP, וזמן ההפעלה האופטימלי ב- pH 9 עולה מ ~ 3 דקות לכ - 15 דקות. בנוסף, פחות CDAP נדרש כדי להשיג את אותה רמת הפעלה מאשר כאשר מבוצע בטמפרטורת החדר. 
ניתן להטות פוליסכרידים שמקורם ב-ADH לחלבונים באמצעות קרבודימידים (למשל, EDAC)7. לדוגמה, מספר חיסונים מורשים של המופילוס שפעת b (Hib) משתמשים בפולירבוסילרביטבולפוספט (PRP) שמקורם ב- ADH כדי להצית לטוקסואיד טטנוס באמצעות EDAC. CNBr הועסק בתחילה, אך CDAP הוא ריאגנט הרבה יותר קל לשימוש למטרה זו. מניסיוננו, טווח יעד טוב עבור derivatization ADH הוא 10-30 הידראזידים לכל 100 kDa פוליסכריד או ~ 1-3% ADH לפי משקל. 
אותו תהליך יכול לשמש כדי לגזור פוליסכרידים עם אמינים ראשוניים על ידי החלפת ADH עבור דיאמין. מומלץ להשתמש הקסאן דיאמין כדי להפיק פוליסכרידים עם אמינים8. ניתן להטות את הפוליסכריד המנוכה (PS-NH2)באמצעות ריאגנטים שפותחו להטיית חלבונים11. בדרך כלל, PS-NH2 נגזר עם maleimide (למשל, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-קרבוקסילאט (SMCC) או N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide אסתר (GMBS)), ואת החלבון הוא thiolated (למשל, עם תמציתימידיל 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP)). הכימיה של תיול-מאלימייד יעילה מאוד.
חלבונים יכולים גם להיות מצמידים ישירות לפוליסכרידים המופעלים על ידי CDAP באמצעות ɛ-amine על ליזינים. בעוד פרוטוקול ההפעלה בשימוש דומה בדרך כלל לזה המתואר כאן, יש צורך לייעל את רמת ההפעלה, פוליסכריד וריכוז החלבון, כמו גם את יחס החלבון:יחס פוליסכריד5,6,8. 
Dextran הוא אחד הפוליסכרידים הקלים ביותר להפעלה עם CDAP בשל הצפיפות הגבוהה יחסית של קבוצות הידרוקסיל, אבל כמה פוליסכרידים, כגון Vi אנטיגן, יכול להיות מאתגר. כתוצאה מכך, אין פרוטוקול "הטוב ביותר" יחיד עבור הטיות CDAP ישירות חלבונים. אנו מציעים תחילה לפתח פרוטוקול כדי להשיג רמות מתאימות של הפעלה, כפי שנקבע על ידי היקף נגזרת הידראזיד, ולאחר מכן להמשיך לכוון הטיות חלבון לפוליסכריד המופעל על ידי CDAP.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

חיסונים מצומדים, כגון אלה המורכבים מפוליסכרידים הקשורים באופן קוולנטי לחלבון נשא, הם בין ההתקדמות המדהימה בחיסון1,2. פוליסכרידים, כמו אנטיגנים עצמאיים לתאי T, הם אימונוגניים בצורה גרועה בתינוקות ואינם מעוררים זיכרון, החלפת מעמדות או התבגרות זיקה של נוגדנים3. חסרונות אלה מתגברים בחיסונים מצומדיםפוליסכריד 4. כמו רוב polysaccharides אין ידית כימית נוחה עבור הטיות, הם חייבים להיות תחילה תגובתי או "מופעל". לאחר מכן, הפוליסכריד הפעיל מקושר ישירות לחלבון (או לחלבון שעבר שינוי) או שהוא פונקציונלי לגזרות נוספות לפני ההטיה4. רוב החיסונים המצוידים בפוליסכריד משתמשים במינוי רדוקטיבי או ציאנילציה כדי להפעיל הידרוקסילים פוליסכרידים. ציאנוגן ברומיד (CNBr), ריאגנט ששימש בעבר להפעלת שרפים כרומטוגרפיים, שימש בתחילה לגזרת פוליסכריד. עם זאת, CNBr דורש pH גבוה, בדרך כלל ~ pH 10.5 או יותר, באופן חלקי deprotonate hydroxyls פוליסכריד, כך שהם נוקלאופיליים מספיק לתקוף את קבוצת cyano. ה-pH הגבוה יכול להזיק לפוליסכרידים בסיסיים, ולא CNBr ולא הציאנו-אסתר הפעיל שנוצר בתחילה יציבים מספיק ברמת חומציות גבוהה כל כך.
CDAP (1-ציאנו-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובורט; איור 1) הוצג על ידי ליס ואח 'לשימוש כסוכן ציאנילטינג להפעלת פוליסכרידים5,6. CDAP, שהוא גבישי וקל לטיפול, נמצא להפעיל פוליסכרידים ברמת חומציות נמוכה יותר מאשר CNBr ועם פחות תגובות צד. שלא כמו CNBr, ניתן להטות ישירות פוליסכרידים המופעלים על ידי CDAP לחלבונים, ובכך לפשט את תהליך הסינתזה. ניתן לתפקד פוליסכרידים המופעלים על ידי CDAP עם דיאמין (למשל, דיאמין הקסאן) או דיהידרזיד (למשל, דיהידרזיד אדיפיק, ADH) כדי ליצור פוליסכרידים שמקורם באמינויות או הידרזידים. ריכוז גבוה של ריאגנט הומוביפונקציוני משמש לדיכוי הצלבה של פוליסכרידים. לאחר מכן ניתן להטות פוליסכרידים אמינו באמצעות כל אחת מהטכניקות הרבות המשמשות להטיית חלבונים. פוליסכרידים שמקורם בהידראזיד מצמידים לעתים קרובות לחלבונים המשתמשים בריאגנט קרבודימיד (למשל, 1-אתיל-3-(3-דימתילאמיל)קרבודימיד (EDAC))7. אופטימיזציה נוספת של הפעלת CDAP פוליסכריד תוארה על ידי Lees et al.8 והוא משולב בפרוטוקול המתואר כאן.
מבט כולל על הטיות CDAP ניתן להמשיג את פרוטוקול CDAP כשני שלבים: (1) הפעלת הפוליסכריד ו-(2) ההטיה של הפוליסכריד הפעיל עם חלבון או ליגנד(איור 2). מטרת הצעד הראשון היא להפעיל ביעילות את הפוליסכריד, בעוד שהמטרה של השני היא להצדווג ביעילות לפוליסכריד המופעל. הפוליסכריד הפעיל קובר את שני השלבים יחד. תפיסה זו מסייעת להתמקד באלמנטים הקריטיים של כל שלב. איור 2 מרחיב את התפיסה הזו, ומראה את תגובות ההפעלה והצימוד הרצויות, יחד עם תגובות ההידרוליזה ותגובות הצד.
במהלך שלב ההפעלה, שלושת החששות העיקריים הם יציבות CDAP, תגובת CDAP עם הידרוקסילים פוליסכריד, ואת היציבות של פוליסכריד מופעל (איור 3). הידרוליזה CDAP עולה עם pH, כמו גם הידרוליזה של פוליסכריד מופעל ואת תגובות הצד. עם זאת, תגובת CDAP עם פוליסכריד מקלה על ידי הגדלת ה- pH. הפעלה יעילה של פוליסכרידים עם CDAP דורשת איזון בין 1) התגובה של הפוליסכריד וה- CDAP ו- 2) ההידרוליזה ותגובות הצד של ריאגנט והפוליסכריד המופעל.
בפרוטוקול ההפעלה המקורי של CDAP שתואר על ידי Lees et al.5, הפעלת CDAP של פוליסכרידים בוצעה בטמפרטורת החדר בתמיסת pH 9 לא מכווצת. קצב ההפעלה נמצא מהיר במצב זה, וההפעלה תושלם תוך 3 דקות. התגובה לוותה גם בהידרוליזה מהירה של CDAP, מה שגרם לירידה מהירה ב- pH של פתרון התגובה הבלתי מנוטרל. היה מאתגר להעלות במהירות ולשמור על רמת ה-pH של התגובה בערך היעד במסגרת זמן כה קצרה. בפרוטוקול המתואר, ההפעלה בוצעה על-ידי הוספת CDAP מפתרון מלאי של 100 מ"ג/מ"ל לפתרון הפוליסכריד הלא מנוצל. ה- pH הועלה 30 שניות מאוחר יותר עם "נפח שווה של 0.2 M טריאתילאמין". חלבון שיש להצית נוספה לאחר 2.5 דקות לתגובת ההפעלה. ראוי לציין, ה- pH של שלב ההפעלה לא היה מבוקר היטב וסביר להניח בתחילה חרג pH היעד. התגובה המהירה הדורשת התאמת pH מהירה הקשתה על תהליך ההפעלה ומאתגרת את ההרחבה.
בניגוד לפרוטוקול המקורי, לפרוטוקול שהשתנה המתואר כאן יש שני שיפורים משמעותיים. ראשית, ה- pH של פתרון הפוליסכריד מותאם מראש ל- pH של הפעלת היעד, תוך שימוש ב- DMAP כחוצץ, לפני הוספת CDAP. DMAP יש pKa של 9.5 ולכן יש כוח אגירה טוב סביב pH 9, ובניגוד למאגרים רבים אחרים, DMAP לא נמצא כדי לקדם הידרוליזה CDAP8. יתר על כן, DMAP הוא כבר תהליך ביניים ולכן אינו מוסיף רכיב חדש לתערובת התגובה. כוונון מראש של ה- pH לפני הוספת CDAP מבטל את תנופת ה- pH הגדולה בתחילת התגובה ומאפשר תחזוקה יעילה יותר של pH היעד במהלך התגובה. השיפור השני הוא לבצע את תגובת ההפעלה ב 0 °C (50 °F), שבו קצב הידרוליזה CDAP הוא איטי משמעותית מזה בטמפרטורת החדר. עם מחצית החיים של ריאגנט ארוך יותר ב 0 °C (50 °F), זמן ההפעלה גדל מ 3 דקות ל 15 דקות כדי לפצות על קצב ההפעלה האיטי בטמפרטורה הנמוכה יותר. זמן התגובה הארוך יותר, בתורו, מקל על שמירה על pH התגובה. השימוש ב 0 °C (50 °F) גם מאט את השפלה של פוליסכרידים רגישים ל- pH, מה שמאפשר להכין מצומדים מסוג זה של פוליסכריד. השיפורים בפרוטוקול הופכים את תהליך ההפעלה לפחות תזזיתי, קל יותר לשליטה, לניתן לשחזור יותר וניתן יותר לשנות את קנה המידה שלו.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול המשופר לביצוע הפעלת CDAP מבוקרת של פוליסכריד ב 0 °C (70 °F) וב- pH היעד שצוין וביצוע נגזרת לאחר מכן של פוליסכרידים מופעלים עם ADH. מתואר גם הוא טרינדרובנזן חומצה גופרתית (TNBS) אסאי, המבוסס על השיטה של Qi ואח'9, לקביעת רמת הידראזיד על פוליסכריד שונה. בדיקת שונה עבור hexoses המבוסס על resorcinol וחומצה גופרתית10 מתואר גם, אשר ניתן להשתמש בו לקביעת מגוון רחב יותר של פוליסכרידים. לקבלת מידע נוסף אודות הפעלת CDAP והטיה, הקורא מופנה לפרסומים קודמים5,6,8 על ידי Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

חיסונים מצומדים הם התקדמות יוצאת דופן בחיסון. להכנת חיסונים מצומדים פוליסכריד, ניתן לתפקד בנוחות את הפוליסכרידים ולקשר אותם לחלבונים נושאי חיסונים באמצעות 1-ציאנו-4-דימתילאמינופירידאין טטרפלואורובוראט (CDAP), ריאגנט ציאנילציה קל לטיפול. CDAP מפעיל פוליסכרידים על ידי תגובה עם קבוצות הידרוקסיל פחמימות ב pH 7-9. היציבות והתגובה של CDAP תלויות מאוד ב- pH. ה- pH של התגובה גם פוחת במהלך ההפעלה עקב הידרוליזה של CDAP, מה שהופך את השליטה הטובה ב- pH למפתח להפעלה ניתנת לשחזור. פרוטוקול ההפעלה המקורי של CDAP בוצע בטמפרטורת החדר בפתרונות pH 9 לא מכוסים.
בשל התגובה המהירה במצב זה (<3 דקות) וצניחת ה- pH המהירה הנלווית מההידרוליזה המהירה של CDAP, היה מאתגר להתאים במהירות ולשמור על ה- pH של תגובת היעד במסגרת הזמן הקצרה. הפרוטוקול המשופר המתואר כאן מבוצע ב 0 °C (50 °F), אשר מאט הידרוליזה CDAP ומאריך את זמן ההפעלה מ 3 דקות כדי ~ 15 דקות. Dimethylaminopyridine (DMAP) שימש גם כחוצץ להתאמה מראש של פתרון הפוליסכריד ל- pH של הפעלת היעד לפני הוספת ריאגנט CDAP. זמן התגובה הארוך יותר, יחד עם הידרוליזה CDAP איטית יותר ושימוש במאגר DMAP, מקל על שמירה על pH ההפעלה במשך כל תהליך ההפעלה. הפרוטוקול המשופר הופך את תהליך ההפעלה לפחות תזזיתי, לניתן לשחזור יותר וניתן יותר לשינוי קנה מידה.

כדי להמחיש את ההפעלה והנגזרת של פוליסכריד באמצעות הכימיה של CDAP, דקסטרן הופעל ב 0.25 ו 0.5 מ"ג CDAP / מ"ג דקסטרן. עבור כל תגובה, תמיסה דקסטרן 10 מ"ג / מ"ל במים היה צונן על קרח, ו 1/10נפח של 2.5 M M DMAP מלאי (מוכן כמתואר בסעיף 3) נוספה. הפתרון הסופי הובא pH 9 על ידי תוספת של 0.1 M NaOH ב 10 aliquots μL. הפתרון היה צונן ומעורב, הוסיף CDAP, ואת ה- pH נשמר ב- pH 9 על ידי הוספת 10 עליקוטים μL של 0.1 M NaOH במשך 15 דקות. רק 0.25 מ"ל של 0.5 M ADH ב pH 9 נוספה (פחות מהכמות הרגילה) והתגובה מותרת להמשיך לילה ב 4 °C (5 °F).
דקסטרן שכותרתו אז היה חיוג ברצף נגד 1 M NaCl, 0.15 M NaCl, ומים כמתואר בסעיף 6. ה- ADH-dextran נטען לאחר מכן לדקסטרן באמצעות בדיקת הסרסורצינול/חומצה גופרתית (סעיף 7.2). עקומה סטנדרטית טיפוסית המשתמשת בגלוקוז כפי שמוצג בתקן הסוכר באיור 4A. תכולת ההידרזיד נקבעה באמצעות TNBS assay המתואר בסעיף 7.3. עקומת הידראזיד סטנדרטית טיפוסית המשתמשת ב-ADH, שכן התקן ניתן באיור 4B.
חישובים מייצגים מהפעלת דקסטרן בשתי רמות ההפעלה מוצגים באיור 4A, B. הנתונים מוצגים הן כהידראזידים לכל 100 kDa של פולימר דקסטרן וכאחוז משקל של ADH כדי dextran, כמתואר בסעיפים 7.9.3.4 ו 7.9.3.5, בהתאמה, באיור 4C. מידת ההפקה הוכפלה בערך עם הוכפל יחס ה- CDAP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> איור 1: מבנה כימי של CDAP. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> איור 2: תהליך הפעלת CDAP והטיות. התהליך מחולק מושגית לשני שלבים, כאשר הפוליסכריד הפעיל משותף לשניהם. בתנאים בסיסיים, CDAP מפעיל הידרוקסילים פוליסכריד, משחרר DMAP (תגובה 1). הידרוליזה CDAP גם משחרר DMAP (תגובה 3). למרות cyano-אסתר מוצג, זה לא יכול להיות ביניים בפועל. לפיכך, אמצעי הביניים נקרא (CDAP) "מופעל" פוליסכריד. במהלך שלב ההפעלה הראשון, הפוליסכריד הפעיל יכול הידרוליזה (תגובה 4) או לעבור תגובות צד (תגובה 5). בשלב ההטיות השני (תגובה 2), הפוליסכריד הפעיל מגיב עם אמין כדי ליצור קשר איזוריאה יציב בנוסף לתגובות 4 ו -5. קיצורים: CDAP = 1-cyano-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט; DMAP = 4-דימתילמינופירידין; R-NH2 = אמין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> איור 3: הפעלת CDAP והטיות. התהליך דורש איזון תגובתיות CDAP עם פוליסכריד, היציבות של CDAP ופוליסכריד מופעל, כמו גם את התגובה של פוליסכריד מופעל עם זה של האמין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות להפעלת CDAP של dextran. עקומות סטנדרטיות אופייניות עבור (A)resorcinol / חומצה גופרתית ו (B) TNBS אסיונים. תוצאות הבחינה עבור דקסטרן מופעל עם 0.25 ו 0.5 מ"ג CDAP / מ"ג דקסטרן מוצגים. גלוקוז שימש כסטנדרט לבדיקת ביטול. Dextran, mg /mL, מחולק על ידי 100 kDa לתת ריכוז טוחנת. ריכוז הידראזיד נקבע באמצעות ADH כסטנדרט ואת התוצאות לידי ביטוי כמו μM הרץ. (C)חישוב של הידראזיד: יחסי dextran. רמת ההגזמה חושבה כהידרזידים לכל 100 kDa של דקסטרן כדי להקל על ההשוואה בין פולימרים במשקלים מולקולריים ממוצעים שונים. יחס המשקל % של g ADH/ g dextran חושב באמצעות MW של 174 גרם / שומה עבור ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

חלבונים וליגנדים המכילים אמין יכולים להיות מקושרים באופן קוולנטי לפוליסכרידים המופעלים על ידי ריאגנט ציאנילציה, 1-ציאנו-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP), ליצירת הצמדת חלבון קוולנטי (ליגנד)-פוליסכריד. מאמר זה מתאר פרוטוקול משופר לביצוע הפעלת CDAP מבוקרת ב- 0 °C ו- pH משתנה וביצוע ההטיות הבאות של הפוליסכרידים הפעילים.

הפעלה והטיאה של פוליסכרידים מסיסים באמצעות 1-Cyano-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

פוליסכרידים הם אימונוגניים בצורה גרועה אלא אם כן הם קשורים לחלבון ויש להפעילם לצורך נגזרת או הטיות לחלבונים. בשיטה זו, CDAP משמש כמדבר חול. ה- CDAP מפעיל הידרוקסילים פוליסכרידים לגזרה או להיות מקושר לחלבונים לשימוש בחיסונים או ריאגנטים אבחנתיים.CDAP החליף במידה רבה ציאנוגן ברומיד כמו ריאגנט מטען חול פוליסכריד. CDAP הוא פשוט יותר לשימוש, יעיל יותר, וניתן להשתמש בו ב- pH נמוך יותר מאשר ציאנוגן ברומיד. זה ריאגנט הרבה יותר טוב.CDAP יכול לשמש עם רוב פוליסכרידים, שלא כמו למשל amination רדוקטיבי, אשר דורש הידרוקסילים ויקנין. הכימיה יכולה לשמש הן במישרין והן בעקיפין מצומדת לחלבונים, וניתן להשתמש בה כדי ליצור ריאגנטים אבחנתיים. תגובת ההפעלה של CDAP, כפי שתואר במקור, הייתה מהירה מאוד וקשה לשליטה.הפרוטוקול המסופק כאן הופך את הכימיה להרבה יותר קלה לביצוע והרבה יותר ניתנת לשחזור. לפני תחילת הניסוי, להתאים את ה- pH של פתרון פוליסכריד ל 9 על ידי הוספת 200 microliters של תמיסת מלאי dimethylaminopyridine באופן dropwise תוך ערבוב. שמור את התגובה מקוררת באמבט מי קרח במשך כל תהליך ההפעלה.המשך עם צילאנו-דימטילמינופירידאין-טטרפלואורובוראט או הפעלת CDAP על ידי העברת 100 מיקרוליטרים של CDAP לתמיסת הפוליסכריד תוך כדי ערבוב. הפעל את טיימר ולנטר את שינוי ה- pH במהלך ההפעלה כולה במשך 15 דקות. שמור על התגובה ב- pH היעד על ידי הוספת 10 תוספת מיקרוליטר במהירות של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת.כאשר זמן ההפעלה האופטימלי הוא הגיע, להוסיף שני מיליליטר של 0.5 אדיפיק אדיהיפיק דיהידזיד 0.5 אדיפיק בבת אחת לפוליסכריד מופעל. בדוק כי ה- pH נמצא בטווח הנדרש לפונקציונליזציה של הידרוקסיד. לאחר ערבוב מתמשך של תערובת התגובה במשך שעה אחת לפחות, להעביר את תערובת התגובה לארבע מעלות צלזיוס.כדי להפחית את ריכוז ADH מהמוצר, חייג את פתרון הפוליסכריד הגולמי שמקורו באמצעות התקן הדיאליזה. לשחזר את הפוליסכריד נגזר דיאליזה ולקבוע את הריכוז של פוליסכרידים הידרזיד כדי לחשב את הידראזיד ליחס פוליסכריד. הכן מיליגרם אחד למיליליטר פתרון פוליסכריד לא שנופץ שישמש כסטנדרט.מחממים את בלוק החימום ל-140 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות כדי להשיג טמפרטורה אחידה ויציבה. השתמש כרית מגן מתחת וסביב בלוק החימום במקרה של שפיכות חומצה. הוסף כמויות משתנות של מיליגרם אחד למיליליטר פחמימות תקן לכותרת 13 על 100 מביצות borosilicate בטריפליקאטים ולהגדיר את הנפח ל 100 microliters עם מים כדי להשיג את הריכוזים הסטנדרטיים הרצויים.באופן דומה, להגדיר בדיקות מדגם על ידי הוספת נפח המכיל חמישה מיקרוגרם של פוליסכריד נגזר לשלושה צינורות מדגם. הוסף 100 מיקרוליטרים של שישה מיליגרם טרי מוכן למיליליטר resorcinol לכל צינור. באמצעות pipetter חוזר, להוסיף 300 microliters של חומצה גופרתית מוכן 75%לכל צינור, מערבולת הצינורות במרץ, הצבעת הצינור משם, ולאחר מכן למקם את כל הצינורות בלוק תנור בקצב קבוע בסדר רציף מיד להגדיר את הטיימר במשך שלוש דקות.בשלוש דקות, להסיר את הצינורות באותו סדר ולהניח אותם ישירות על מתלה באמבט מי קרח. הסר את צינורות קרים קרח כדי לאפשר להם להתפלש לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. קרא את הספיגה של כל הצינורות על ספקטרופוטומטר UV-Vis ב 430 ננומטר באמצעות cuvette אורך נתיב 10 מ"מ.כדי להגדיר תגובות מבחנים, מיין וסדר את הצינורות הסטנדרטיים המסומנים במתלה הצינורות על מנת להגביר את הריכוז. באמצעות מיקרופיפט מכויל, הוסף 100 מיקרוליטרים של הסטנדרטים לכל צינור מתאים. עבור תקן האפס, השתמש ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר הדגימה.באופן דומה, להכין ולסדר את צינורות מדגם. לאחר מכן, באמצעות מיקרופיט 1,000 מיקרוליטרים מכוילים, הוסף 875 מיקרוליטרים של חיץ בדיקות לכל צינורות ה- assay. כדי להתחיל את תגובת בדיקת ההסתה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של 1%, חומצה גופרתית טריניטרבנזן לכל צינור אסאי בסדר קבוע מראש תוך חמש דקות.מערבולת צינורות ה- assay במשך שתי שניות במהירות גבוהה, מוודאת שהנוזל מסתחרר לגובה של חצי סנטימטר מפתיחת הצינור. הקלט את שעת ההתחלה של ההסתה והגדר את הטיימר לשעתיים. ואז למקם את מתלה צינור בדיקת בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.בסיום הזמן, מערבולת הצינורות ולהמשיך לאיסוף נתונים. דקסטרן ADH נטען עבור דקסטרן באמצעות בדיקת חומצה גופרתית resorcinol. צינור סטנדרטי טיפוסי באמצעות גלוקוז כמו תקן הסוכר היה שרטט.תכולת ההידרזיד בפוליסכריד נגזר או דקסטרן נקבעה באמצעות בדיקת TNBS. רמת הגזרה חושבה כהירידים לכל 100 קילודלטון של דקסטרן כדי להקל על ההשוואה בין פולימרים במשקלים מולקולריים ממוצעים שונים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן לפוליסכריד מסוים.הכימיה CDAP יכול לשמש כדי פונקציונליזציה פוליסכרידים לשימוש עם מגוון רחב של ריאגנטים הטיות. זה יכול לשמש, למשל, כדי biotinylate פוליסכרידים לשימוש ב ELISAs. חלבונים יכולים להיות מקושרים ישירות פוליסכרידים המופעלים על ידי CDAP, אבל זה בדרך כלל דורש קצת אופטימיזציה עבור פוליסכריד ספציפי.תפוקת ההטיה יכולה להיות מעל 75% השימוש בכימיה של CDAP איפשר חיסונים מצומדים בעלות נמוכה, כמו אלה שנעשו, למשל, על ידי מכון הסרום של הודו.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Assay חינם Cell מערכת הערכת קיבולת נטרול של נוגדן GM-CSF באמצעות קולטן מסיס רקומביננטי GM-CSF

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...