Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

यहां वर्णित कार्य को फिना बायोसॉल्यूशंस एलएलसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

एंड्रयू लीस फिना बायोसॉल्यूशंस के संस्थापक और मालिक हैं। वह सीडीएपी रसायन विज्ञान और रसायन विज्ञान और CDAP conjugation पता है कि कैसे के लाइसेंस से लाभ से संबंधित कई पेटेंट रखती है ।

सीडीएपी पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने और संयोजित करने के लिए एक सुविधाजनक अभिकर्षक है। यह लेख हाइड्राज़ाइड (पीएस-एडीएच) के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए सीडीएपी का उपयोग करने की सामान्य विधि का वर्णन करता है और हाल ही में प्रकाशित सुधार8को शामिल करता है। सबसे पहले, तकनीक सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य पीएच को बनाए रखने के महत्व पर जोर देती है। हमने पाया कि जबकि कई आम बफ़र्स सीडीएपी सक्रियण प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं, डीएमएपी को पीएच8का प्रबंधन करने के लिए बफर के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही सीडीएपी सक्रियण का एक प्रतिक्रिया प्रतिफल है। अंत में, सीडीएपी को जोड़ने से पहले डीएमएपी के साथ पॉलीसैकराइड समाधान बफरिंग प्रतिक्रिया पीएच के सटीक लक्ष्यीकरण और रखरखाव की सुविधा प्रदान करता है। जैसा कि हम वर्णन करते हैं, केंद्रित डीएमएपी स्टॉक समाधान के पीएच को समायोजित करना उपयोगी है जैसे कि पतला होने पर, यह लक्षित पीएच तक पहुंचता है। दूसरे, ठंड में प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रतिक्रिया समय धीमा, सक्रियण प्रक्रिया कम उंमत्त और अधिक क्षमा कर रही है । कम तापमान सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर में कमी आई, और पीएच 9 पर इष्टतम सक्रियण समय ~ 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ जाता है। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर प्रदर्शन की तुलना में सक्रियण के समान स्तर को प्राप्त करने के लिए कम सीडीएपी की आवश्यकता होती है। 
एडीएच-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को कार्बोडिमाइड्स (जैसे, EDAC)7का उपयोग करके प्रोटीन के लिए संयोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कई लाइसेंस प्राप्त हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा बी (हिब) टीके एडीएच के साथ प्राप्त पॉलीरिबाइल्रिबिटोल्फॉस्फेट (पीआरपी) का उपयोग करते हैं ताकि EDAC का उपयोग करके टेटनस टॉक्सोइड को संयोजित किया जा सके। CNBr शुरू में कार्यरत था, लेकिन CDAP इस उद्देश्य के लिए उपयोग करने के लिए एक बहुत आसान अभिकर् ता है। हमारे अनुभव में, एडीएच व्युत्पन्नीकरण के लिए एक अच्छा लक्ष्य सीमा प्रति 100 केडीए पॉलीसैकराइड या वजन के अनुसार ~ 1-3% एडीएच 10-30 हाइड्राज़ाइड है। 
इसी प्रक्रिया का उपयोग डायमिन के लिए एडीएच को प्रतिस्थापन करके प्राथमिक अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। 8 अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स प्राप्त करने केलिए हेक्साने डाइमाइन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अमीनेटेड पॉलीसैकराइड (पीएस-एनएच2)को प्रोटीन संयुग्मण11के लिए विकसित अभिजेंट्स का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। आमतौर पर, पीएस-एनएच2 एक मालेमाइड (उदाहरण के लिए, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] साइक्लोहेक्साने-1-कार्बोक्सिलेट (एसएमसीसी) या एन-γ-मालेमिडोबुटिलिल-ऑक्सीस्यूसिनिमाइड एस्टर (जीएमबीएस)), और प्रोटीन थिओलेटेड (जैसे, succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) प्रोपेलेट (एसपीडीपी) के साथ) है । थिओल-मलीमाइड केमिस्ट्री बहुत कुशल है।
प्रोटीन को सीधे ɛ-अमीन ऑन lysines के माध्यम से सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स में भी जोड़ा जा सकता है। जबकि सक्रियण प्रोटोकॉल का उपयोग आम तौर पर यहां वर्णित एक के समान होता है, सक्रियण, पॉलीसैकराइड और प्रोटीन एकाग्रता के स्तर के साथ-साथ प्रोटीन: पॉलीसैकराइड अनुपात5,6,8को अनुकूलित करना आवश्यक है।
डेक्सट्रान हाइड्रोक्सिल समूहों के अपेक्षाकृत उच्च घनत्व के कारण सीडीएपी के साथ सक्रिय करने के लिए सबसे आसान पॉलीसैकराइड्स में से एक है, लेकिन Vi एंटीजन जैसे कुछ पॉलीसैकराइड चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। नतीजतन, प्रोटीन के लिए सीधे सीडीएपी संयोजित करने के लिए कोई "सर्वश्रेष्ठ" प्रोटोकॉल नहीं है। हम पहले सक्रियण के उपयुक्त स्तरों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि हाइड्राज़ाइड व्युत्पन्न की सीमा तक निर्धारित होता है, और फिर सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड को सीधे प्रोटीन संग्राम करने के लिए आगे बढ़ना।

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

वैकसिकोलॉजी1,2 में उल्लेखनीय प्रगति के बीच हैं, जैसे कि पॉलीसैकराइड से जुड़े टीकों, जैसे कि पॉलीसैकराइड्स से जुड़ेहुएहैं। पॉलीसैकराइड्स, टी-सेल-स्वतंत्र एंटीजन के रूप में, शिशुओं में खराब इम्यूनोजेनिक होते हैं और स्मृति, वर्ग स्विचिंग, या एंटीबॉडी3की आत्मीयता परिपक्वता को प्रेरित नहीं करते हैं। पॉलीसैकराइड संयोजित टीकों में इन कमियों को दूर किया जाता है4. चूंकि अधिकांश पॉलीसैकराइड्स में संवध के लिए एक सुविधाजनक रासायनिक हैंडल नहीं होता है, इसलिए उन्हें पहले प्रतिक्रियाशील या "सक्रिय" बनाया जाना चाहिए। सक्रिय पॉलीसैकराइड को तब सीधे प्रोटीन (या संशोधित प्रोटीन) से जोड़ा जाता है या संजीदशन 4 से पहले अतिरिक्त व्युत्पन्न के लिए कार्यात्मक कियाजाताहै। अधिकांश लाइसेंस प्राप्त पॉलीसैकराइड संयोजित टीके पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करने के लिए या तो अपचय अमीनेशन या साइनिलेशन का उपयोग करते हैं। सायनोजेन ब्रोमाइड (सीएनबीआर), एक अभिवात जिसका उपयोग पहले क्रोमेटोग्राफी रेजिन को सक्रिय करने के लिए किया गया था, का उपयोग शुरू में पॉलीसैकराइड व्युत्पन्नीकरण के लिए किया जाता था। हालांकि, सीएनबीआर को उच्च पीएच की आवश्यकता होती है, आमतौर पर ~ पीएच 10.5 या उससे अधिक, आंशिक रूप से पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को विकृत करने के लिए ताकि वे साइनो समूह पर हमला करने के लिए पर्याप्त रूप से न्यूक्लियोफिलिक हों। उच्च पीएच आधार-लैबाइल पॉलीसैकराइड्स के लिए हानिकारक हो सकता है, और न तो सीएनबीआर और न ही सक्रिय साइनानो-एस्टर शुरू में गठित इस तरह के उच्च पीएच पर पर्याप्त रूप से स्थिर है।
सीडीएपी (1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट; चित्रा 1) 5,6के सक्रियण के लिए एक साइनिलेटिंग एजेंट केरूप में उपयोग के लिए Lees et al. द्वारा पेश किया गया था । CDAP, जो क्रिस्टलीय और संभालना आसान है, CNBr की तुलना में कम पीएच पर पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करने और कम साइड प्रतिक्रियाओं के साथ पाया गया। सीएनबीआर के विपरीत, सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को संश्लेषण प्रक्रिया को सरल बनाते हुए प्रोटीन के लिए सीधे संयोजित किया जा सकता है। सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को अमीनो-या हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड बनाने के लिए डायमाइन (जैसे, हेक्सेन डायमाइन) या एक डाइहाइड्राजाइड (जैसे, एडिपिक डाइहाइड्राजाइड, एडीएच) के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। पॉलीसैकराइड्स के क्रॉसलिंकिंग को दबाने के लिए होमोबियल रिएजेंट की उच्च एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। अमीनो पॉलीसैकराइड्स को प्रोटीन संयुग्मण के लिए उपयोग की जाने वाली असंख्य तकनीकों में से किसी का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को अक्सर कार्बोडिमाइड रिएजेंट (जैसे, 1-एथिल-3-(3-डाइमेथाइलमिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडीएसी)7का उपयोग करके प्रोटीन के साथ जोड़ा जाता है। सीडीएपी पॉलीसैकराइड एक्टिवेशन का इसके अलावा अनुकूलन Lees et al.8 द्वारा वर्णित किया गया है और यहां वर्णित प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है।
सीडीएपी संयोजीय अवलोकन सीडीएपी प्रोटोकॉल को दो चरणों के रूप में अवधारणा किया जा सकता है: (1) पॉलीसैकराइड की सक्रियता और (2) प्रोटीन या लिगामेंट(चित्र 2)के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड का संविलियन। पहले चरण का लक्ष्य पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करना है, जबकि दूसरे का लक्ष्य सक्रिय पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक संयोजित करना है। सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों चरणों को एक साथ जोड़ता है। यह अवधारणा प्रत्येक चरण के महत्वपूर्ण तत्वों पर ध्यान केंद्रित करने में मदद करती है। चित्रा 2 इस अवधारणा पर फैलता है, जिसमें हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाओं और साइड प्रतिक्रियाओं के साथ वांछित सक्रियण और युग्मन प्रतिक्रियाएं दिखाई देती हैं।
सक्रियण चरण के दौरान, तीन प्रमुख चिंताएं सीडीएपी स्थिरता, पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल के साथ सीडीएपी प्रतिक्रिया, और सक्रिय पॉलीसैकराइड(चित्रा 3)की स्थिरता हैं। पीएच के साथ सीडीएपी हाइड्रोलिसिस बढ़ जाता है, जैसा कि सक्रिय पॉलीसैकराइड और साइड प्रतिक्रियाओं का हाइड्रोलिसिस है। हालांकि, पीएच बढ़ाने से पॉलीसैकराइड के साथ सीडीएपी रिएक्शन की सुविधा है। सीडीएपी के साथ पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करने के लिए पॉलीसैकराइड और सीडीएपी और 2 की प्रतिक्रियाशीलता के बीच संतुलन की आवश्यकता होती है) रिएजेंट और सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों की हाइड्रोलिसिस और साइड प्रतिक्रियाएं।
लीस एट अल द्वारा वर्णित मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉलमें,पॉलीसैकराइड्स की सीडीएपी सक्रियण बिना खरीदार पीएच 9 समाधान में कमरे के तापमान पर किया गया था। इस स्थिति के तहत सक्रियण की दर तेजी से पाई गई, और सक्रियण 3 मिनट के भीतर पूरा हो जाएगा। प्रतिक्रिया भी CDAP के तेजी से हाइड्रोलिसिस के साथ था, unbuffered प्रतिक्रिया समाधान की एक तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण । इतनी कम समय सीमा में लक्ष्य मूल्य पर प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से उठाना और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। वर्णित प्रोटोकॉल में, 100 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से बिना बड़े पॉलीसैकराइड समाधान के लिए सीडीएपी जोड़कर सक्रियण किया गया था। पीएच को 30 एस बाद में "0.2 एम ट्राइथिलमाइन की बराबर मात्रा" के साथ उठाया गया था। प्रोटीन को संयुग्मित किया जाना था, फिर सक्रियण प्रतिक्रिया में 2.5 मिनट के बाद जोड़ा गया था। विशेष रूप से, सक्रियण कदम का पीएच अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं था और सबसे अधिक संभावना शुरू में लक्ष्य पीएच से अधिक थी। त्वरित पीएच समायोजन की आवश्यकता वाली तेज प्रतिक्रिया ने सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने और बड़े पैमाने पर चुनौतीपूर्ण बना दिया।
मूल प्रोटोकॉल के विपरीत, यहां वर्णित संशोधित प्रोटोकॉल में दो प्रमुख सुधार हैं। सबसे पहले, पॉलीसैकराइड समाधान का पीएच सीडएपी के अलावा, बफर के रूप में डीएमएपी का उपयोग करके सक्रियण पीएच को लक्षित करने के लिए पूर्व-समायोजित किया जाता है। DMAP 9.5 का एक पीसीए है और इस तरह पीएच 9 के आसपास अच्छी बफरिंग शक्ति है, और कई अन्य बफ़र्स के विपरीत, DMAP CDAP हाइड्रोलिसिस8को बढ़ावा देने के लिए नहीं पाया गया था। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही एक प्रक्रिया मध्यवर्ती है और इसलिए प्रतिक्रिया मिश्रण में एक नया घटक नहीं जोड़ता है। सीडीएपी जोड़ने से पहले पीएच को पूर्व-समायोजित करना प्रतिक्रिया की शुरुआत में बड़े पीएच स्विंग को समाप्त करता है और प्रतिक्रिया के दौरान लक्ष्य पीएच के अधिक कुशल रखरखाव की अनुमति देता है। दूसरा सुधार 0 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण प्रतिक्रिया करना है, जहां सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर कमरे के तापमान की तुलना में स्पष्ट रूप से धीमी है। 0 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक अभिकर्ण आधा जीवन के साथ, कम तापमान पर धीमी सक्रियण दर की भरपाई के लिए सक्रियण समय 3 मिनट से बढ़कर 15 मिनट हो जाता है। अब प्रतिक्रिया समय, बदले में, प्रतिक्रिया पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। 0 डिग्री सेल्सियस का उपयोग पीएच-संवेदनशील पॉलीसैकराइड्स के क्षरण को भी धीमा कर देता है, जिससे इस प्रकार के पॉलीसैकराइड के संजूगेट तैयार करना संभव हो जाता है। प्रोटोकॉल में सुधार सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, नियंत्रित करने में आसान, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाते हैं।
यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीसैकराइड के नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और एक निर्दिष्ट लक्ष्य पीएच पर और एडीएच के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड के बाद के व्युत्पन्न प्रदर्शन के लिए बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इसके अलावा वर्णित एक त्रिनीट्रोबेनजेन सल्फोनिक एसिड (TNBS) परख, क्यूई एट अल9की विधि के आधार पर, संशोधित पॉलीसैकराइड पर हाइड्राजाइड स्तर के निर्धारण के लिए है। रेसोरसिनॉल और सल्फ्यूरिक एसिड10 पर आधारित हेक्सोस के लिए एक संशोधित परख भी वर्णित है, जिसका उपयोग पॉलीसैकराइड्स की व्यापक श्रृंखला निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सीडीएपी सक्रियण और संयोजण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठक को पहले के प्रकाशनों5,6, 8को लीस एट अल द्वारा संदर्भित कियाजाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

वैकसिनोलॉजी में कंजूगेट टीके उल्लेखनीय प्रगति हैं। पॉलीसैकराइड संजूबा टीकों की तैयारी के लिए, पॉलीसैकराइड्स को आसानी से कार्यात्मक किया जा सकता है और 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरोबोरेट (सीडीएपी), एक आसान-से-हैंडल साइनिलेटिंग रिएजेंट का उपयोग करके वैक्सीन वाहक प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। सीडीएपी पीएच 7-9 पर कार्बोहाइड्रेट हाइड्रोक्सिल समूहों के साथ प्रतिक्रिया करके पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करता है। सीडीएपी की स्थिरता और प्रतिक्रियाशीलता अत्यधिक पीएच-निर्भर है। सीडीएपी के हाइड्रोलिसिस के कारण सक्रियण के दौरान प्रतिक्रिया का पीएच भी कम हो जाता है, जो अच्छा पीएच प्रजनन सक्रियण की कुंजी को नियंत्रित करता है। मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर बिना खरीदार पीएच 9 समाधानों में किया गया था।
इस स्थिति (<3 मिनट) के तहत तेजी से प्रतिक्रिया और तेजी से सीडीएपी हाइड्रोलिसिस से तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण, कम समय सीमा में लक्ष्य प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से समायोजित और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। यहां वर्णित बेहतर प्रोटोकॉल 0 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, जो सीडीएपी हाइड्रोलिसिस को धीमा कर देता है और सक्रियण समय को 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ाता है। CDAP रिएजेंट जोड़ने से पहले लक्ष्य सक्रियण पीएच के पॉलीसैकराइड समाधान को पूर्व-समायोजित करने के लिए डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन (डीएमएपी) का भी उपयोग बफर के रूप में किया गया था। लंबी प्रतिक्रिया समय, धीमी सीडीएपी हाइड्रोलिसिस और डीएमएपी बफर के उपयोग के साथ मिलकर, सक्रियण प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए सक्रियण पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। बेहतर प्रोटोकॉल सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाता है।

सीडीएपी रसायन शास्त्र का उपयोग करके पॉलीसैकराइड के सक्रियण और व्युत्पन्न को समझाने के लिए, डेक्सट्रान को 0.25 और 0.5 मिलीग्राम सीडीएपी/एमजी डेक्सट्रान पर सक्रिय किया गया था। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, पानी में एक 10 मिलीग्राम/एमएल डेक्सट्रन समाधान बर्फ पर ठंडा किया गया था, और 2.5 एम DMAP स्टॉक की 1/10 मात्रा (धारा 3 में वर्णित के रूप में तैयार) जोड़ा गया था। अंतिम समाधान 10 μL aliquots में 0.1 एम NaOH के अलावा पीएच 9 के लिए लाया गया था। समाधान ठंडा और उभारा गया था, CDAP जोड़ा, और पीएच 9 में 15 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH के 10 μL aliquots जोड़कर बनाए रखा । पीएच 9 पर ०.५ एम एडीएच के केवल ०.२५ एमएल (सामान्य राशि से कम) और प्रतिक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ने की अनुमति दी गई ।
तब लेबल किए गए डेक्सट्रान को धारा 6 में वर्णित 1 एम एनएसीएल, 0.15 एम एनएसीएल और पानी के खिलाफ क्रमिक रूप से अलग किया गया था। इसके बाद एडीएच-डेक्सट्रान को रेसोरसिनॉल/सल्फ्यूरिक एसिड परख (धारा ७.२) का उपयोग करके डेक्सट्रान के लिए परख लिया गया । चीनी मानक के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करके एक विशिष्ट मानक वक्र चित्रा 4 एमें दिखाया गया है। हाइड्राजाइड सामग्री धारा 7.3 में वर्णित TNBS परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मानक के रूप में एडीएच का उपयोग करते हुए एक विशिष्ट हाइड्राजाइड मानक वक्र चित्रा 4Bमें दिया गया है।
सक्रियण के दो स्तरों पर डेक्सट्रान की सक्रियता से प्रतिनिधि गणना चित्रा 4 ए,बीमें दिखाई जाती है। डेटा को डेक्सट्रान बहुलक के 100 केडीए में दोनों हाइड्राज़ाइड के रूप में प्रस्तुत किया गया है और एडह के वजन प्रतिशत के रूप में डेक्सट्रान के लिए, जैसा कि चित्र 4 सीमें क्रमशः 7.9.3.4 और 7.9.3.5 वर्गों में वर्णित है। CDAP अनुपात दोगुनी हो गई थी के रूप में व्युत्पन्न की डिग्री लगभग दोगुनी हो गई थी।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> चित्रा 1:सीडीएपी की रासायनिक संरचना। CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> चित्रा 2:सीडीएपी सक्रियण और संयोजण की प्रक्रिया। प्रक्रिया को अवधारणानता से दो चरणों में विभाजित किया गया है, जिसमें सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों के लिए आम है। बुनियादी परिस्थितियों में, सीडीएपी पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करता है, डीएमएपी (प्रतिक्रिया 1) जारी करता है। सीडीएपी हाइड्रोलिसिस भी DMAP (प्रतिक्रिया 3) जारी करता है। हालांकि एक साइनो-एस्टर दिखाया गया है, यह वास्तविक मध्यवर्ती नहीं हो सकता है। इसलिए, मध्यवर्ती को (सीडीएपी) "सक्रिय" पॉलीसैकराइड कहा जाता है। पहले सक्रियण चरण के दौरान, सक्रिय पॉलीसैकराइड हाइड्रोलाइज (प्रतिक्रिया 4) या साइड प्रतिक्रियाओं (प्रतिक्रिया 5) से गुजरना कर सकता है। दूसरे संवध चरण (प्रतिक्रिया 2) में, सक्रिय पॉलीसैकराइड प्रतिक्रियाओं 4 और 5 के अलावा एक स्थिर आइसोरिया बांड बनाने के लिए एक अमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है। संक्षिप्त: CDAP = 1-सायनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; आर-एनएच2 = अमीन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> चित्र 3:सीडीएपी सक्रियण और संजीदशन। इस प्रक्रिया में पॉलीसैकराइड के साथ सीडीएपी प्रतिक्रियाशीलता, सीडीएपी की स्थिरता और सक्रिय पॉलीसैकराइड के साथ-साथ अमीन के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड की प्रतिक्रियाशीलता की आवश्यकता होती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> चित्रा 4:डेक्सट्रान के सीडीएपी सक्रियण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए)resorcinol/सल्फ्यूरिक एसिड और(बी)TNBS परख के लिए विशिष्ट मानक घटता है । 0.25 और 0.5 एमजी सीडीएपी/एमजी डेक्सट्रान के साथ सक्रिय डेक्सट्रान के परख परिणाम दिखाए गए हैं। ग्लूकोज का उपयोग रेसोरसिनॉल परख के मानक के रूप में किया जाता था। एमजी/एमएल में डेक्सट्रान को मोलर कंसंट्रेशन देने के लिए 100 केडीए द्वारा विभाजित किया गया है। हाइड्राज़ाइड एकाग्रता मानक के रूप में एडीएच का उपयोग करके निर्धारित की जाती है और परिणाम μM Hz के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।(C)हाइड्राज़ाइड की गणना: डेक्सट्रान अनुपात। विभिन्न औसत आणविक भार के बहुलकों के बीच तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए डेक्सट्रान के 100 केडीए में हाइड्राज़ाइड के रूप में व्युत्पन्न के स्तर की गणना की गई थी। जी एडीएच/जी डेक्सट्रान के% वजन अनुपात की गणना एडीएच के लिए 174 ग्राम/तिल के मेगावाट का उपयोग करके की गई थी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

प्रोटीन और अमीन युक्त लिगामेंट्स को सहसंयोजक प्रोटीन (लिगामेंट)-पॉलीसैकराइड कंजूगेट्स बनाने के लिए साइनिलेशन रिएजेंट, 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) द्वारा सक्रिय पॉलीसैकराइड्स से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है । यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और अलग-अलग पीएच और सक्रिय पॉलीसैकराइड्स के बाद के संविलियन को अंजाम देने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

1-सायनो-4-डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) का उपयोग करके घुलनशील पॉलीसैकराइड्स का सक्रियण और संाधीनता

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

पॉलीसैकराइड खराब इम्यूनोजेनिक होते हैं जब तक कि प्रोटीन से लिंक न हो और प्रोटीन के लिए व्युत्पन्न या संजीदशन के लिए सक्रिय होने की आवश्यकता हो। इस विधि में सीडीएपी का उपयोग सैंड लैलिंग रिएजेंट के रूप में किया जाता है। सीडीएपी व्युत्पन्न के लिए पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करता है या टीकों या नैदानिक अभिकर्मकों में उपयोग के लिए प्रोटीन से जोड़ा जाता है।सीडीएपी ने काफी हद तक सायनोजेन ब्रोमाइड को पॉलीसैकराइड सैंड लैलिंग रिएजेंट के रूप में बदल दिया है। CDAP का उपयोग करने के लिए सरल है, अधिक कुशल है, और सायनोजेन ब्रोमाइड की तुलना में एक कम पीएच पर इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एक बहुत बेहतर सक्रिय अभिकर् य है।CDAP का उपयोग अधिकांश पॉलीसैकराइड्स के साथ किया जा सकता है, जो अपचय अमीनेशन के विपरीत होता है, जिसके लिए विसिनल हाइड्रोक्सिल की आवश्यकता होती है। रसायन विज्ञान का उपयोग प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से प्रोटीन के लिए दोनों को संयोजित करने के लिए किया जा सकता है, और इसका उपयोग नैदानिक अभिकर्ण बनाने के लिए किया जा सकता है। CDAP सक्रियण प्रतिक्रिया, जैसा कि मूल रूप से वर्णित है, बहुत तेजी से और नियंत्रित करने के लिए मुश्किल था ।यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल रसायन विज्ञान को प्रदर्शन करने में कहीं आसान बनाता है और बहुत अधिक प्रजनन योग्य होता है। प्रयोग शुरू करने से पहले, 200 माइक्रोलीटर डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन स्टॉक समाधान को हिलाते समय ड्रॉपवाइज तरीके से जोड़कर पॉलीसैकराइड समाधान के पीएच को 9 में समायोजित करें। सक्रियण की पूरी प्रक्रिया के लिए एक बर्फ के पानी के स्नान में प्रतिक्रिया ठंडा रखें।सरगर्मी करते समय सीडीएपी के 100 माइक्रोलीटर को पॉलीसैचराइड समाधान में स्थानांतरित करके साइनो-डाइमेथाइलमिनोपाइरिडीन-टेट्राफ्लोरोबोरेट या सीडीएपी एक्टिवेशन के साथ आगे बढ़ें। टाइमर शुरू करें और 15 मिनट के लिए पूरे एक्टिवेशन के दौरान पीएच चेंज की निगरानी करें। 0.1 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड की 10 माइक्रोलीटर वेतन वृद्धि को तुरंत जोड़कर लक्ष्य पीएच पर प्रतिक्रिया बनाए रखें।जब इष्टतम सक्रियण समय पहुंच जाता है, तो सक्रिय पॉलीसैकराइड में एक बार में 0.5 मोलर एडिपिक डिहाइड्राज़ाइड के दो मिलीलीटर जोड़ें। जांच करें कि पीएच हाइड्रोक्साइड कार्यात्मकता के लिए आवश्यक सीमा में है। कम से कम एक घंटे तक प्रतिक्रिया मिश्रण की निरंतर सरगर्मी के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को चार डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।उत्पाद से एडीएच एकाग्रता को कम करने के लिए, डायलिसिस डिवाइस का उपयोग करके क्रूड व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड समाधान को डायलिज करें। डायलिसिस से प्राप्त पॉलीसैकराइड को ठीक करें और पॉलीसैकराइड अनुपात में हाइड्राज़ाइड की गणना करने के लिए पॉलीसैकराइड और हाइड्राज़ाइड की एकाग्रता निर्धारित करें। मानक के रूप में उपयोग किए जाने वाले मिलीलीटर अनमॉडिफाइड पॉलीसैकराइड समाधान के अनुसार एक मिलीग्राम तैयार करें।एक स्थिर समान तापमान प्राप्त करने के लिए न्यूनतम एक घंटे के लिए हीटिंग ब्लॉक को 140 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें। एसिड फैल के मामले में हीटिंग ब्लॉक के नीचे और आसपास एक सुरक्षात्मक पैड का उपयोग करें। त्रिपाल में 100 बोरोसिलिकेट टेस्ट ट्यूब द्वारा लेबल किए गए 13 में एक मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम की अलग-अलग मात्रा जोड़ें और वांछित मानक सांद्रता प्राप्त करने के लिए पानी के साथ 100 माइक्रोलीटर तक मात्रा बनाएं।इसी प्रकार, तीन नमूना ट्यूबों में पांच माइक्रोग्राम व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड की मात्रा जोड़कर नमूना परख स्थापित करें। प्रत्येक ट्यूब में हौसले से तैयार छह मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर रिसोरसिनॉल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक दोहराने पिपेटर का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में तैयार 75% सल्फ्यूरिक एसिड के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, ट्यूब को सख्ती से भंवर करें, ट्यूब को दूर इंगित करें, फिर सभी ट्यूबों को अनुक्रमिक क्रम में स्थिर गति से एक हीटर ब्लॉक में रखें और तुरंत टाइमर को तीन मिनट के लिए सेट करें।तीन मिनट पर, एक ही क्रम में ट्यूबों को हटा दें और उन्हें सीधे एक रैक में बर्फ के पानी के स्नान में रखें। बर्फ ठंड ट्यूबों को हटा दें ताकि उन्हें पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान तक बराबरी करने की अनुमति दी जा सके। 10 मिलीमीटर पथ लंबाई क्यूवेट का उपयोग करके 430 नैनोमीटर पर यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर सभी ट्यूबों का अवशोषण पढ़ें।परख प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने के लिए, एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में ट्यूब रैक में लेबल मानक ट्यूबों को सॉर्ट और व्यवस्थित करें। एक कैलिब्रेटेड माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक संबंधित ट्यूब में मानकों के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। शून्य मानक के लिए, नमूना बफर के 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें।इसी तरह सैंपल ट्यूब तैयार कर उसके इंतजाम करें। फिर एक अंशांकित 1, 000 माइक्रोलीटर माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, सभी परख ट्यूबों में परख बफर के 875 माइक्रोलीटर जोड़ें। परख प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, पांच मिनट के भीतर पूर्व निर्धारित क्रम में प्रत्येक परख ट्यूब में 1% त्रिनीट्रोबेनजेन सल्फोनिक एसिड के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें।भंवर उच्च गति पर दो सेकंड के लिए परख ट्यूब, सुनिश्चित करें कि तरल ट्यूब खोलने से आधा इंच की ऊंचाई तक घूमता है । परख शुरू समय रिकॉर्ड करें और टाइमर को दो घंटे तक सेट करें। फिर परख ट्यूब रैक को दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखें।जब समय समाप्त हो जाता है, तो ट्यूबों को भंवर से और डेटा संग्रह के लिए आगे बढ़ें। एडीएच डेक्सट्रान को रेसोरसिनॉल सल्फ्यूरिक एसिड परख का उपयोग करके डेक्सट्रान के लिए परख लिया गया था। चीनी मानक के रूप में ग्लूकोज का उपयोग कर एक ठेठ मानक ट्यूब की साजिश रची गई थी।व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड या डेक्सट्रान में हाइड्राज़ाइड सामग्री टीएनबीएस परख का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। विभिन्न औसत आणविक भार के बहुलकों के बीच तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए डेक्सट्रान के 100 किलोडटन प्रति हाइड्राइड के रूप में व्युत्पन्न के स्तर की गणना की गई थी। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एक विशिष्ट पॉलीसैकराइड के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।सीडीएपी रसायन का उपयोग विभिन्न प्रकार के कंजूगेशन रिएजेंट्स के साथ उपयोग के लिए पॉलीसैकराइड्स को कार्यात्मक करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग एलिसा में उपयोग के लिए बायोटाइनलेट पॉलीसैकराइड्स के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन को सीधे सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स से जोड़ा जा सकता है, लेकिन इसके लिए आमतौर पर एक विशिष्ट पॉलीसैकराइड के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता होती है।संयोजित उपज 75% से अधिक हो सकती है सीडीएपी रसायन विज्ञान के उपयोग ने भारतीय सीरम संस्थान द्वारा बनाए गए लोगों की तरह कम लागत वाले संजूगेट टीके सक्षम किए हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

बी कोशिकाओं की CD40 सक्रियण के murine मॉडल

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Neu1 Sialidase गतिविधि के टॉल की तरह रिसेप्टर सक्रियण विनियमन में जांच

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

एक फ्री सेल परख जीएम-CSF एंटीबॉडी के उदासीन क्षमता का आकलन प्रणाली पुनः संयोजक घुलनशील रिसेप्टर जीएम-CSF का उपयोग

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

ड्रग अतिसंवेदनशीलता में IgE की मध्यस्थता तंत्र की जांच के लिए बेसोफिल सक्रियकरण टेस्ट

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

लाल रक्त कोशिकाओं पर एंटीबॉडी प्रेरित सक्रियण पूरक के मात्रात्मक जांच के लिए तरीके

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

सक्रियण और मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में आईएल 1β का प्रयोग NLRP3 inflammasome गतिविधि की माप

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

टी lymphocytes में Integrin से सक्रियण के अध्ययन के लिए स्टेटिक आसंजन परख

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

अलगाव और murine लिम्फोसाइटों के सक्रियण

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

ऐसे ई कोलाई या शिगेला flexneri के रूप में Enterobacterial उपभेदों में बैक्टीरियल विकार का उपयोग कर एक घने Transposon प्रविष्टि पुस्तकालय का निर्माण

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...