Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Il lavoro qui descritto è stato finanziato da Fina Biosolutions LLC.

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Andrew Lees è fondatore e proprietario di Fina Biosolutions. Detiene diversi brevetti relativi alla chimica CDAP e beneficia della licenza del know-how di chimica e coniugazione CDAP.

CDAP è un reagente conveniente per derivare e coniugare polisaccaridi. Questo articolo descrive il metodo generale per utilizzare CDAP per derivare polisaccaridi con idrazidi (PS-ADH) e incorpora i miglioramenti pubblicati di recente8. In primo luogo, la tecnica sottolinea l'importanza di mantenere il pH target per controllare il processo di attivazione. Abbiamo scoperto che mentre molti buffer comuni interferiscono con la reazione di attivazione CDAP, DMAP potrebbe essere utilizzato con successo come buffer per gestire il pH8. Inoltre, DMAP è già un sottoprodotto di reazione dell'attivazione CDAP. Infine, il buffering della soluzione di polisaccaride con DMAP prima di aggiungere il CDAP facilita il targeting preciso e il mantenimento del pH di reazione. Come descriviamo, è utile regolare il pH della soluzione stock DMAP concentrata in modo tale che, una volta diluita, raggiunga il pH target. In secondo luogo, eseguire il processo al freddo ha rallentato il tempo di reazione, rendendo il processo di attivazione meno frenetico e più indulgente. La temperatura più bassa ha ridotto il tasso di idrolisi CDAP e il tempo di attivazione ottimale a pH 9 aumenta da ~ 3 min a ~ 15 min. Inoltre, è necessario meno CDAP per raggiungere lo stesso livello di attivazione rispetto a quando viene eseguito a temperatura ambiente. 
I polisaccaridi derivati dall'ADH possono essere coniugati alle proteine usando carbodiimmidi (ad esempio, EDAC)7. Ad esempio, diversi vaccini autorizzati Haemophilus influenzae b (Hib) utilizzano il poliribosilribitolofosfato (PRP) derivato con ADH per coniugare al tossoide tetanico utilizzando EDAC. CNBr è stato inizialmente impiegato, ma CDAP è un reagente molto più facile da usare per questo scopo. Nella nostra esperienza, un buon intervallo target per la derivatizzazione dell'ADH è di 10-30 idrazidi per polisaccaride da 100 kDa o ~ 1-3% di ADH in peso. 
Lo stesso processo può essere utilizzato per derivare polisaccaridi con ammine primarie sostituendo l'ADH con una diammina. Si consiglia di utilizzare esano diammina per derivare polisaccaridi con ammine8. Il polisaccaride aminato (PS-NH2) può essere coniugato utilizzando reagenti sviluppati per la coniugazione proteica11. Tipicamente, il PS-NH2 è derivato con una maleimmide (ad esempio, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) o N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), e la proteina è tiolata (ad esempio, con succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP)). La chimica tiolo-maleimmide è molto efficiente.
Le proteine possono anche essere accoppiate direttamente ai polisaccaridi attivati da CDAP tramite l'ɛ-ammina sulle lisine. Mentre il protocollo di attivazione utilizzato è generalmente simile a quello qui descritto, è necessario ottimizzare il livello di attivazione, la concentrazione di polisaccaridi e proteine, nonché il rapporto proteina:polisaccaride5,6,8.
Il destro è uno dei polisaccaridi più facili da attivare con CDAP a causa della sua densità relativamente elevata di gruppi ossidrilici, ma alcuni polisaccaridi, come l'antigene Vi, possono essere impegnativi. Di conseguenza, non esiste un unico protocollo "migliore" per la coniugazione CDAP direttamente alle proteine. Suggeriamo prima di sviluppare un protocollo per raggiungere adeguati livelli di attivazione, come determinato dall'entità della derivatizzazione dell'idrazide, e quindi di procedere alla coniugazione proteica diretta al polisaccaride attivato da CDAP.

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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

I vaccini coniugati, come quelli costituiti da polisaccaridi legati covalentemente ad una proteina vettore, sono tra i notevoli progressi della vaccinologia1,2. I polisaccaridi, come antigeni indipendenti dalle cellule T, sono scarsamente immunogenici nei neonati e non inducono memoria, cambio di classe o maturazione di affinità degli anticorpi3. Queste carenze sono superate nei vaccini coniugati con polisaccaridi4. Poiché la maggior parte dei polisaccaridi non ha una comoda maniglia chimica per la coniugazione, devono prima essere resi reattivi o "attivati". Il polisaccaride attivato viene quindi collegato direttamente con la proteina (o proteina modificata) o viene funzionalizzato per un'ulteriore derivatizzazione prima della coniugazione4. La maggior parte dei vaccini coniugati con polisaccaridi autorizzati utilizzano l'aminazione riduttiva o la cianilizzazione per attivare gli idrossili polisaccaridi. Il bromuro di cianogeno (CNBr), un reagente che era stato precedentemente utilizzato per attivare le resine per cromatografia, è stato inizialmente utilizzato per la derivatizzazione dei polisaccaridi. Tuttavia, CNBr richiede un pH elevato, in genere ~ pH 10,5 o superiore, a idrossili polisaccaridi parzialmente deprotonati in modo che siano sufficientemente nucleofili da attaccare il gruppo ciano. L'alto pH può essere dannoso per i polisaccaridi base-labili e né il CNBr né il ciano-estere attivo inizialmente formato sono sufficientemente stabili a un pH così elevato.
CDAP (1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato; Figura 1) è stato introdotto da Lees et al. per l'uso come agente cianilante per l'attivazione dei polisaccaridi5,6. CDAP, che è cristallino e facile da maneggiare, è stato trovato per attivare polisaccaridi ad un pH inferiore rispetto a CNBr e con meno reazioni collaterali. A differenza del CNBr, i polisaccaridi attivati da CDAP possono essere coniugati direttamente alle proteine, semplificando il processo di sintesi. I polisaccaridi attivati da CDAP possono essere funzionalizzati con una diammina (ad esempio, esano diammina) o un diidrazide (ad esempio, diidrazide adipico, ADH) per produrre polisaccaridi derivati da amino o idrazide. Un'alta concentrazione del reagente omobifunzionale viene utilizzata per sopprimere la reticolazione dei polisaccaridi. Gli amminopolisaccaridi possono quindi essere coniugati utilizzando una qualsiasi delle miriadi di tecniche utilizzate per la coniugazione delle proteine. I polisaccaridi derivati dall'idrazide sono spesso accoppiati a proteine utilizzando un reagente di carbodiimide (ad esempio, 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimide (EDAC))7. Un'ulteriore ottimizzazione dell'attivazione del polisaccaride CDAP è stata descritta da Lees et al.8 ed è incorporata nel protocollo qui descritto.
Panoramica della coniugazione CDAP Il protocollo CDAP può essere concettualizzato in due fasi: (1) l'attivazione del polisaccaride e (2) la coniugazione del polisaccaride attivato con una proteina o un ligando (Figura 2). L'obiettivo del primo passo è quello di attivare in modo efficiente il polisaccaride, mentre l'obiettivo del secondo è quello di coniugare in modo efficiente al polisaccaride attivato. Il polisaccaride attivato lega insieme i due passaggi. Questa concettualizzazione aiuta a concentrarsi sugli elementi critici di ogni passaggio. La Figura 2 espande questa concettualizzazione, mostrando le reazioni di attivazione e accoppiamento desiderate, insieme alle reazioni di idrolisi e alle reazioni collaterali.
Durante la fase di attivazione, le tre principali preoccupazioni sono la stabilità del CDAP, la reazione del CDAP con gli idrossili polisaccaridi e la stabilità del polisaccaride attivato (Figura 3). L'idrolisi CDAP aumenta con il pH, così come l'idrolisi del polisaccaride attivato e le reazioni collaterali. Tuttavia, la reazione CDAP con il polisaccaride è facilitata aumentando il pH. L'attivazione efficiente dei polisaccaridi con CDAP richiede un equilibrio tra 1) la reattività del polisaccaride e del CDAP e 2) l'idrolisi e le reazioni collaterali sia del reagente che del polisaccaride attivato.
Nel protocollo di attivazione CDAP originale descritto da Lees et al.5, l'attivazione CDAP dei polisaccaridi è stata effettuata a temperatura ambiente in soluzione di pH 9 non tamponata. Il tasso di attivazione è risultato essere rapido in questa condizione e l'attivazione sarebbe stata completata entro 3 minuti. La reazione è stata anche accompagnata da una rapida idrolisi del CDAP, causando un rapido calo del pH della soluzione di reazione non tamponata. È stato difficile aumentare rapidamente e mantenere il pH di reazione al valore target in un lasso di tempo così breve. Nel protocollo descritto, l'attivazione è stata eseguita aggiungendo CDAP da una soluzione stock da 100 mg/mL alla soluzione di polisaccaride non tamponata. Il pH è stato aumentato di 30 s in seguito con "un volume uguale di 0,2 M di trietilammina". La proteina da coniugare è stata quindi aggiunta dopo 2,5 minuti alla reazione di attivazione. In particolare, il pH della fase di attivazione non era ben controllato e molto probabilmente inizialmente superava il pH target. La reazione rapida che richiedeva una rapida regolazione del pH rendeva il processo di attivazione difficile da controllare e difficile da scalare.
In contrasto con il protocollo originale, il protocollo modificato qui descritto ha due importanti miglioramenti. In primo luogo, il pH della soluzione di polisaccaride viene pre-regolato per indirizzare il pH di attivazione, utilizzando DMAP come tampone, prima dell'aggiunta di CDAP. DMAP ha un pKa di 9,5 e quindi ha un buon potere tampone intorno a pH 9 e, a differenza di molti altri buffer, DMAP non è stato trovato per promuovere l'idrolisi CDAP8. Inoltre, DMAP è già un intermedio di processo e quindi non aggiunge un nuovo componente alla miscela di reazione. La pre-regolazione del pH prima di aggiungere CDAP elimina la grande oscillazione del pH all'inizio della reazione e consente un mantenimento più efficiente del pH target durante la reazione. Il secondo miglioramento consiste nell'eseguire la reazione di attivazione a 0 °C, dove la velocità di idrolisi CDAP è notevolmente più lenta di quella a temperatura ambiente. Con l'emivita del reagente più lunga a 0 °C, il tempo di attivazione viene aumentato da 3 minuti a 15 minuti per compensare il tasso di attivazione più lento alla temperatura più bassa. Il tempo di reazione più lungo, a sua volta, rende più facile mantenere il pH di reazione. L'uso di 0 °C rallenta anche la degradazione dei polisaccaridi pH-sensibili, rendendo possibile la preparazione di coniugati di questo tipo di polisaccaride. I miglioramenti nel protocollo rendono il processo di attivazione meno frenetico, più facile da controllare, più riproducibile e più suscettibile di scalare.
Questo articolo descrive il protocollo migliorato per l'esecuzione controllata dell'attivazione CDAP del polisaccaride a 0 °C e ad un pH target specificato e l'esecuzione della successiva derivatizzazione dei polisaccaridi attivati con ADH. Viene inoltre descritto un saggio di acido trinitrobenzene solfonico (TNBS), basato sul metodo di Qi et al.9,per la determinazione del livello di idrazide sul polisaccaride modificato. Viene inoltre descritto un saggio modificato per le esosi a base di resorcinolo e acido solforico10, che può essere utilizzato per determinare una gamma più ampia di polisaccaridi. Per ulteriori informazioni sull'attivazione e la coniugazione cdAP, il lettore è rimandato alle precedenti pubblicazioni5,6,8 di Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

I vaccini coniugati sono notevoli progressi nella vaccinologia. Per la preparazione di vaccini coniugati con polisaccaridi, i polisaccaridi possono essere comodamente funzionalizzati e collegati alle proteine portanti del vaccino utilizzando 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato (CDAP), un reagente cianolante facile da maneggiare. CDAP attiva i polisaccaridi reagendo con i gruppi ossidrilici dei carboidrati a pH 7-9. La stabilità e la reattività del CDAP dipendono fortemente dal pH. Il pH della reazione diminuisce anche durante l'attivazione a causa dell'idrolisi del CDAP, che rende un buon controllo del pH la chiave per l'attivazione riproducibile. Il protocollo di attivazione CDAP originale è stato eseguito a temperatura ambiente in soluzioni di pH 9 non tamponate.
A causa della reazione rapida in questa condizione (<3 min) e del rapido calo del pH che accompagna la rapida idrolisi CDAP, è stato difficile regolare rapidamente e mantenere il pH della reazione target nel breve lasso di tempo. Il protocollo migliorato qui descritto viene eseguito a 0 °C, che rallenta l'idrolisi CDAP ed estende il tempo di attivazione da 3 min a ~15 min. La dimetilamminopiridina (DMAP) è stata anche utilizzata come tampone per pre-regolare la soluzione di polisaccaride al pH di attivazione target prima di aggiungere il reagente CDAP. Il tempo di reazione più lungo, unito all'idrolisi CDAP più lenta e all'uso del tampone DMAP, rende più facile mantenere il pH di attivazione per l'intera durata del processo di attivazione. Il protocollo migliorato rende il processo di attivazione meno frenetico, più riproducibile e più suscettibile di scalare.

Per illustrare l'attivazione e la derivatizzazione di un polisaccaride utilizzando la chimica CDAP, il destrano è stato attivato a 0,25 e 0,5 mg cdAP/mg destrorsano. Per ogni reazione, una soluzione di destrano da 10 mg/mL in acqua è stata raffreddata su ghiaccio ed è stato aggiunto1/10 di volume di uno stock DMAP da 2,5 M (preparato come descritto al paragrafo 3). La soluzione finale è stata portata a pH 9 mediante l'aggiunta di 0,1 M NaOH in aliquote da 10 μL. La soluzione è stata refrigerata e mescolata, ha aggiunto CDAP, e il pH è stato mantenuto a pH 9 aggiungendo aliquote di 10 μL di 0,1 M NaOH per 15 minuti. Sono stati aggiunti solo 0,25 mL di 0,5 M ADH a pH 9 (meno della quantità abituale) e la reazione ha permesso di procedere durante la notte a 4 °C.
Il destrano etichettato è stato quindi dializzato sequenzialmente contro 1 M NaCl, 0,15 M NaCl e acqua come descritto nel paragrafo 6. L'ADH-destrano è stato quindi valutato per il destrorso utilizzando il saggio del resorcinolo/acido solforico (paragrafo 7.2). Una tipica curva standard che utilizza il glucosio come standard dello zucchero è mostrata nella Figura 4A. Il contenuto di idrazide è stato determinato utilizzando il test TNBS descritto al paragrafo 7.3. Una tipica curva standard dell'idrazide che utilizza ADH come standard è riportata nella Figura 4B.
I calcoli rappresentativi dall'attivazione del destrano ai due livelli di attivazione sono mostrati in Figura 4A,B. I dati sono presentati sia come idrazidi per 100 kDa di polimero destrano che come percentuale in peso di ADH a destrano, come descritto rispettivamente nei sezioni 7.9.3.4 e 7.9.3.5 nella Figura 4C. Il grado di derivatizzazione è approssimativamente raddoppiato quando il rapporto CDAP è stato raddoppiato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figura 1: Struttura chimica del CDAP. CDAP = 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figura 2: Processo di attivazione e coniugazione CDAP. Il processo è concettualmente diviso in due fasi, con il polisaccaride attivato comune ad entrambe. In condizioni di base, CDAP attiva idrossili polisaccaridi, rilasciando DMAP (reazione 1). L'idrolisi CDAP rilascia anche DMAP (reazione 3). Sebbene venga mostrato un ciano-estere, questo potrebbe non essere l'intermedio effettivo. L'intermedio è, quindi, indicato come polisaccaride "attivato" (CDAP). Durante la prima fase di attivazione, il polisaccaride attivato può idrolizzare (reazione 4) o subire reazioni collaterali (reazione 5). Nella seconda fase di coniugazione (reazione 2), il polisaccaride attivato reagisce con un'ammina per formare un legame isoureico stabile oltre alle reazioni 4 e 5. Abbreviazioni: CDAP = 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato; DMAP = 4-dimetilamminopiridina; R-NH2 = ammina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figura 3: Attivazione e coniugazione CDAP. Il processo richiede il bilanciamento della reattività del CDAP con il polisaccaride, la stabilità del CDAP e del polisaccaride attivato, nonché la reattività del polisaccaride attivato con quella dell'ammina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figura 4: Risultati rappresentativi per l'attivazione CDAP del destrano. Curve standard tipiche per i saggi (A) resorcinolo/ acido solforico e (B) TNBS. Vengono mostrati i risultati del test per il destro attivato con 0,25 e 0,5 mg di CDAP/mg di destrano. Il glucosio è stato utilizzato come standard per il test del resorcinolo. Il destro, in mg/ml, è diviso per 100 kDa per dare una concentrazione molare. La concentrazione di idrazide è determinata utilizzando ADH come standard e i risultati espressi come μM Hz. (C) Calcolo dell'idrazide: rapporti destrano. Il livello di derivatizzazione è stato calcolato come idrazidi per 100 kDa di destrano per facilitare il confronto tra polimeri di diversi pesi molecolari medi. Il rapporto % peso di g ADH/g destrano è stato calcolato utilizzando un MW di 174 g/mole per ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Le proteine e i ligandi contenenti ammine possono essere legati covalentemente ai polisaccaridi attivati dal reagente di cianilazione, 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato (CDAP), per formare coniugati di proteine covalenti (ligando)-polisaccaridi. Questo articolo descrive un protocollo migliorato per eseguire l'attivazione controllata del CDAP a 0 °C e il pH variabile ed eseguire la successiva coniugazione dei polisaccaridi attivati.

Attivazione e coniugazione di polisaccaridi solubili utilizzando 1-ciano-4-dimetilamminopiridina tetrafluoroborato (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

I polisaccaridi sono scarsamente immunogenici a meno che non siano legati alle proteine e devono essere attivati per la derivatizzazione o la coniugazione alle proteine. In questo metodo, CDAP viene utilizzato come reagente per il vano sabbia. Il CDAP attiva idrossili polisaccaridi per derivatizzazione o per essere collegato a proteine per l'uso in vaccini o reagenti diagnostici.CDAP ha in gran parte sostituito il bromuro di cianogeno come reagente di polisaccaride per il polisaccaride. CDAP è più semplice da usare, più efficiente e può essere utilizzato a un pH inferiore rispetto al bromuro di cianogeno. È un reagente attivante molto migliore.CDAP può essere utilizzato con la maggior parte dei polisaccaridi, a differenza di dire aminazione riduttiva, che richiede idrossili vicinali. La chimica può essere utilizzata sia per coniugare direttamente che indirettamente alle proteine e può essere utilizzata per produrre reagenti diagnostici. La reazione di attivazione del CDAP, come originariamente descritta, è stata molto rapida e difficile da controllare.Il protocollo fornito qui rende la chimica molto più facile da eseguire e molto più riproducibile. Prima di iniziare l'esperimento, regolare il pH della soluzione di polisaccaride a 9 aggiungendo 200 microlitri di soluzione stock di dimetilamminopiridina in modo goccioso mentre si mescola. Mantenere la reazione refrigerata a bagnomaria per l'intero processo di attivazione.Procedere con l'attivazione di ciano-dimetilamminopiridina-tetrafluoroborato o CDAP trasferendo 100 microlitri di CDAP alla soluzione di polisaccaride durante l'agitazione. Avviare il timer e monitorare la variazione di pH durante l'intera attivazione per 15 minuti. Mantenere la reazione al pH target aggiungendo prontamente incrementi di 10 microlitri di 0,1 idrossido di sodio molare.Quando viene raggiunto il tempo di attivazione ottimale, aggiungere due millilitri di 0,5 molari adipico diidrazide tutto in una volta al polisaccaride attivato. Verificare che il pH sia nell'intervallo richiesto per la funzionalizzazione dell'idrossido. Dopo aver mescolato continuamente la miscela di reazione per almeno un'ora, trasferire la miscela di reazione a quattro gradi Celsius.Per ridurre la concentrazione di ADH dal prodotto, dializzare la soluzione di polisaccaride derivato grezzo utilizzando il dispositivo di dialisi. Recuperare il polisaccaride derivato dalla dialisi e determinare la concentrazione dei polisaccaridi e dell'idrazide per calcolare il rapporto idrazide/polisaccaride. Preparare un milligrammo per millilitro soluzione di polisaccaride non modificato da utilizzare come standard.Preriscaldare il blocco riscaldante a 140 gradi Celsius per un minimo di un'ora per ottenere una temperatura uniforme stabile. Utilizzare un cuscinetto protettivo sotto e intorno al blocco riscaldante in caso di fuoriuscite di acido. Aggiungere volumi variabili di un milligrammo per millilitro di carboidrati standard alle provette di borosilicato etichettate 13 per 100 in triplicati e portare il volume a 100 microlitri con acqua per raggiungere le concentrazioni standard desiderate.Allo stesso modo, impostare i saggi del campione aggiungendo un volume contenente cinque microgrammi del polisaccaride derivato a tre provette campione. Aggiungere 100 microlitri di sei milligrammi per millilitro di resorcinolo appena preparati a ciascun tubo. Usando un pipetter ripetuto, aggiungere 300 microlitri dell'acido solforico al 75% preparato a ciascun tubo, vorticare vigorosamente i tubi, puntando via il tubo, quindi posizionare tutti i tubi in un blocco riscaldatore a un ritmo costante in ordine sequenziale e impostare immediatamente il timer per tre minuti.A tre minuti, rimuovere i tubi nello stesso ordine e metterli direttamente in un rack in un bagno di acqua ghiacciata. Rimuovere i tubi ghiacciati per consentire loro di equilibrarsi a temperatura ambiente per cinque minuti. Leggi l'assorbanza di tutti i tubi su uno spettrofotometro UV-Vis a 430 nanometri usando una cuvetta di lunghezza del percorso di 10 millimetri.Per impostare le reazioni di analisi, ordinare e disporre i tubi standard etichettati nel rack del tubo in ordine di concentrazione crescente. Utilizzando una micropipetta calibrata, aggiungere 100 microlitri degli standard a ciascun tubo corrispondente. Per lo standard zero, utilizzare 100 microlitri del buffer del campione.Allo stesso modo, preparare e disporre le provette campione. Quindi, utilizzando una micropipetta calibrata da 1.000 microlitri, aggiungere 875 microlitri di tampone di dosaggio a tutti i tubi di analisi. Per avviare la reazione di dosaggio, aggiungere 25 microlitri di acido solfonico trinitrobenzene all'1% di ciascun tubo di dosaggio nell'ordine predeterminato entro cinque minuti.Ruotare i tubi di analisi per due secondi ad alta velocità, assicurandosi che il liquido rotti ad un'altezza di mezzo pollice dall'apertura del tubo. Registrare l'ora di inizio del test e impostare il timer su due ore. Quindi posizionare il rack del tubo di analisi al buio a temperatura ambiente per due ore.Quando il tempo è finito, vortice i tubi e procedere alla raccolta dei dati. Il destro di ADH è stato studiato per il destrorsano utilizzando il test dell'acido solforico resorcinolo. È stato tracciato un tipico tubo standard che utilizza il glucosio come standard di zucchero.Il contenuto di idrazide in polisaccaride o destrano derivatizzato è stato determinato utilizzando il test TNBS. Il livello di derivatizzazione è stato calcolato come idruri per 100 kilodalton di destrano per facilitare il confronto tra polimeri di diversi pesi molecolari medi. Potrebbe essere necessario adattare il protocollo qui descritto per un polisaccaride specifico.La chimica CDAP può essere utilizzata per funzionalizzare i polisaccaridi per l'uso con un'ampia varietà di reagenti di coniugazione. Può essere utilizzato, ad esempio, per biotinilato polisaccaridi per l'uso in ELISA. Le proteine possono essere direttamente collegate ai polisaccaridi attivati da CDAP, ma questo di solito richiede una certa ottimizzazione per uno specifico polisaccaride.La resa di coniugazione può essere superiore al 75% L'uso della chimica CDAP ha permesso vaccini coniugati a basso costo, come quelli realizzati, ad esempio, dal Serum Institute of India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

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A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor

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Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

L&#39;attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

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Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

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Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...