Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
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<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

アンドリュー・リースは、Fina Biosolutionsの創設者兼オーナーです。CDAP化学に関する特許を複数保有し、化学とCDAP活用ノウハウのライセンス取得のメリットを得ています。

CDAPは、多糖類を誘導し、共役するための便利な試薬です。この記事では、CDAP を使用してヒドラジド (PS-ADH) を使用して多糖類を誘導する一般的な方法について説明し、最近発表された改善点8を取り入れた。まず、この技術は、活性化プロセスを制御するために目標pHを維持することの重要性を強調する。多くの一般的なバッファがCDAP活性化反応を妨げる一方で、DMAPを正常にpH8を管理するバッファとして使用できることがわかりました。さらに、DMAPはすでにCDAP活性化の反応副産物である。最後に、CDAPを添加する前にDMAPで多糖溶液を緩衝し、反応pHの正確なターゲティングおよび維持を容易にする。説明するように、濃縮DMAPストック溶液のpHを希釈すると、目標pHに達するように調整すると便利です。第二に、低温でプロセスを行うことは反応時間を遅くし、活性化プロセスをより熱狂的で寛容にした。低い温度はCDAP加水分解の速度を低下させ、pH9の最適な活性化時間は~3分から〜15分に増加する。さらに、室温で行った場合と同じレベルの活性化を達成するために必要なCDAPが少ない。 
ADH誘導体化多糖類は、カルボジイミド(例えば、EDAC)7を用いてタンパク質に結合することができる。例えば、いくつかの認可されたヘモフィルスインフルエンザb(Hib)ワクチンは、EDACを使用して破傷風トキソイドに共役するためにADHで誘導体化されたポリリボシリビトールリン酸(PRP)を使用する。CNBrは当初採用されていましたが、CDAPは、この目的のために使用するはるかに簡単な試薬です。我々の経験では、ADH誘導体化のための良い目標範囲は100 kDa多糖類または〜1-3%ADH重量あたり10-30ヒドラジドである。
同じプロセスを使用して、ADHをジアミンに置き換えることで、多糖類を一次アミンと誘導することができます。ヘキサン・ダイアミンを使用してアミン8で多糖類を誘導することをお勧めします。このアミネート多糖類(PS−NH2)は、タンパク質共役11のために開発された試薬を用いて共役することができる。典型的には、PS-NH2はマレイミド(例えば、 スクシニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)またはN-γ-マレイミドブチル-オキシスクイクシニミドエステル(GMBS))、タンパク質はチオラ化され(例えば、スクシニニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)。チオールマライムド化学は非常に効率的です。
タンパク質は、リジンのɛアミンを介してCDAP活性化多糖に直接結合することもできる。使用される活性化プロトコルは一般にここで説明したものと類似しているが、活性化のレベル、多糖およびタンパク質濃度、ならびにタンパク質:多糖比5、6、8を最適化する必要がある。
Dextranは、比較的高密度のヒドロキシル基のためにCDAPで活性化する最も簡単な多糖の1つですが、Vi抗原などの多糖類は挑戦的な場合があります。その結果、タンパク質に直接CDAPを結合するための単一の「最良」プロトコルはありません。まず、ヒドラジド誘導体の程度によって決定される適切なレベルの活性化を達成するためのプロトコルを開発し、次にCDAP活性化多糖へのタンパク質結合を直接進めることを提案する。

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<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

コンジュゲートワクチンは、担体タンパク質に共有結合する多糖類からなるような、空態学1,2における顕著な進歩の一つである。多糖類は、T細胞非依存性抗原として、乳児の免疫原性が低く、抗体3の記憶、クラス切り替え、または親和性成熟を誘発しない。これらの欠点は、多糖共役ワクチン4で克服される。ほとんどの多糖類は、結合のための便利な化学ハンドルを持っていないため、まず反応性または「活性化」する必要があります。活性化された多糖は、次にタンパク質(または修飾タンパク質)と直接結合されるか、または共役前に追加の誘導体化のために機能化される4。ほとんどのライセンスを受けた多糖コンジュゲートワクチンは、還元的アミノ化またはシアニル化のいずれかを使用して多糖ヒドロキシルを活性化します。シアン臭化物(CNBr)は、クロマトグラフィー樹脂を活性化するために使用されていた試薬で、当初は多糖誘導体化に使用されていました。しかし、CNBrは高いpHを必要とし、典型的には~pH10.5以上、シアノ基を攻撃するのに十分な有核性となるように多糖ヒドロキシルを部分的に脱プロトネイトする。高pHは、塩基性不安定多糖に有害であり、また、CNBrも最初に形成された活性シアノエステルも、このような高pHで十分に安定していない。
CDAP (1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロボレート;図1)は、多糖類5,6の活性化のためのシアニル化剤として使用するためにLeesらによって導入された。結晶性で取り扱いが容易なCDAPは、CNBrよりも低いpHで多糖類を活性化し、副反応が少ないことが判明した。CNBrとは異なり、CDAP活性化多糖類はタンパク質に直接結合することができ、合成プロセスを簡素化します。CDAP活性化多糖類は、ジアミン(例えば、ヘキサンジアミン)またはジヒドラジド(例えば、アジピックジヒドラジド、ADH)で機能し、アミノ酸またはヒドラジド誘導体多糖を作製することができる。高濃度のホモ機能性試薬は、多糖類の架橋を抑制するために使用される。アミノ多糖は、タンパク質の結合に使用される無数の技術のいずれかを使用して共役することができます。ヒドラジド誘導体化多糖は、カルボジイミド試薬を用いてタンパク質に結合することが多い(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルプロピル)カルジギミド(EDAC))7.CDAP多糖活性化のさらなる最適化は、Leesらら 8によって説明されており、ここで説明するプロトコルに組み込まれている。
CDAP の活用の概要 CDAPプロトコルは、(1)多糖の活性化と(2)タンパク質またはリガンドによる活性化多糖の結合の2つの相として概念化することができる(図2)。第1のステップの目的は、多糖を効率的に活性化し、第2の目標は活性化多糖に効率的に共役することです。活性化された多糖は、2つのステップを結び合わせます。この概念化は、各ステップの重要な要素に焦点を当てるのに役立ちます。 図2 は、この概念化を展開し、所望の活性化反応およびカップリング反応を、加水分解反応および副反応と共に示す。
活性化段階の間、3つの主要な懸念事項は、CDAP安定性、CDAP反応と多糖ヒドロキシル、および活性化多糖類の安定性である(図3)。CDAP加水分解は、活性化多糖類および副反応の加水分解と同様に、pHとともに増加する。しかし、CDAPと多糖との反応は、pHを増加させることによって促進される。CDAPで多糖類を効率的に活性化するには、1)多糖とCDAPの反応性と2)試薬と活性化多糖の両方の加水分解および副反応とのバランスが必要です。
Leesらら 5で記述された元のCDAP活性化プロトコルでは、非バッファpH9溶液中で多糖のCDAP活性化が室温で行われた。この条件下では、活性化の速度が速く、活性化は3分以内に完了するであろう。この反応はまた、CDAPの急速な加水分解を伴い、非バッファ化反応溶液の急速なpH低下を引き起こした。このような短い時間枠で、迅速に反応pHを目標値に維持することは困難であった。記載されたプロトコルにおいて、活性化は、100mg/mLストック溶液から非バッファ化多糖溶液にCDAPを添加することによって行われた。pHを30s後に「0.2Mトリエチルアミンの等量」で引き上げた。次に、共役するタンパク質を、活性化反応に2.5分後に添加した。特に、活性化段階のpHは十分に制御されておらず、当初は標的pHを上回った可能性が最も高い。迅速なpH調整を必要とする速い反応により、活性化プロセスの制御が困難になり、スケールアップが困難になりました。
元のプロトコルとは対照的に、ここで説明する変更されたプロトコルには、2 つの大きな改良があります。まず、多糖溶液のpHは、CDAPを添加する前に、DMAPをバッファとして用いて、標的活性化pHに事前調整される。DMAPはpKaが9.5であり、従ってpH 9の周りに良好なバッファリング力を有し、そして他の多くのバッファとは異なり、DMAPはCDAP加水分解8を促進するために見つからなかった。さらに、DMAPは既にプロセス中間プロセスであるため、反応混合物に新しい成分を追加しません。CDAPを追加する前にpHを事前調整することで、反応開始時の大きなpHスイングが排除され、反応中のターゲットpHのメンテナンスがより効率的になります。第2の改善は、CDAP加水分解の速度が室温でのそれよりも著しく遅い0°Cで活性化反応を行うことである。0°Cで試薬の半減期が長くなると、活性化時間が3分から15分に増加し、より低い温度での遅い活性化速度を補います。反応時間が長いほど、反応pHを維持しやすくなります。また、0°Cの使用により、pH感受性多糖類の分解が遅くなり、このタイプの多糖類のコンジュゲートを調製することが可能になります。プロトコルの改良により、アクティベーションプロセスの熱狂性が低下し、制御しやすく、再現性が高まり、スケールアップが容易になりました。
本稿では、0°Cで、指定された標的pHで制御されたCDAP活性化を実施し、ADHで活性化された多糖のその後の誘導体化を行うための改良されたプロトコルについて説明する。また、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)アッセイは、Qi et9の方法に基づいて、改変多糖に対するヒドラジドレベルの測定に関するものである。レゾルシノールおよび硫酸10に基づくヘキソスに対する修飾アッセイも記載されており、これはより広い範囲の多糖類を決定するために使用することができる。CDAPの活性化と活用の詳細については、読者は、Leesらによる以前の出版物5、6、8を参照する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

共役ワクチンは、ワクチン接種の顕著な進歩である。多糖類共役ワクチンの調製のために、多糖類は便利に機能し、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジン四フルオロプロ酸(CDAP)を使用してワクチンキャリアタンパク質に結合することができ、容易に扱いやすいシアニル化試薬である。CDAPは、pH 7-9で炭水化物ヒドロキシル基と反応することにより、多糖類を活性化します。CDAPの安定性と反応性は、pHに依存します。反応のpHはまたCDAPの加水分解による活性化の間に減少し、再現性活性化への鍵を制御する良好なpHを作る。元のCDAP活性化プロトコルは、非バッファpH 9ソリューションで室温で実行されました。
この条件下での迅速な反応(<3分)とそれに伴う高速PH低下により、迅速にCDAP加水分解から、短時間で目標反応pHを迅速に調整し、維持することは困難でした。ここで説明する改良されたプロトコルは、CDAP加水分解を遅くし、活性化時間を3分から〜15分に延長する0°Cで行われます。ジメチルアミノピリジン(DMAP)は、CDAP試薬を添加する前に、標的活性化pHに多糖溶液を事前調整するバッファーとしても使用された。より長い反応時間は、遅いCDAP加水分解とDMAPバッファの使用と相まって、活性化プロセスの全期間の活性化pHを維持することが容易になります。強化されたプロトコルにより、アクティベーションプロセスは、より熱狂的で、再現性が高く、スケールアップに適しています。

CDAP化学を用いた多糖の活性化と誘導体化を例示するために、デキストランは0.25および0.5mgのCDAP/mgデキストランで活性化された。反応ごとに、水中の10mg/mLデキストラン溶液を氷上で冷却し、2.5M DMAPストック(セクション3で説明したとおりに調製)の1/10体積 を添加した。最終的な溶液は、10 μLアリコートに0.1 M NaOHを添加してpH 9に持ち込んだ。溶液を冷やして撹拌し、CDAPを加え、pH9でpH9に維持し、0.1M NaOHの10μLアリコートを15分間加え、pH9で0.25mLの0.5M ADHのみを加え(通常の量より少ない量)、反応を4°Cで一晩進行させた。
標識デキストランは、セクション6に記載されているように、1 M NaCl、0.15 M NaCl、および水に対して順次透析した。次に、ADHデキストランを、レゾルシノール/硫酸アッセイ(セクション7.2)を用いてデキストランについてアッセイした。糖標準としてグルコースを用いた典型的な標準曲線を 図4Aに示す。ヒドラジド含有量は、セクション7.3に記載のTNBSアッセイを用いて決定した。ADHを標準として用いた典型的なヒドラジド標準曲線を 図4Bに示す。
2 段階の活性化レベルでのデキストランの活性化による代表的な計算を、図 4A,Bに示します。データは、図4Cの7.9.3.4および7.9.3.5のセクションでそれぞれ説明されているように、デキストランポリマーの100kDa当たりヒドラジドとADHの重量パーセントとして提示される。CDAP比が2倍になったため、誘導体化の度合いはほぼ2倍になった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> 図1: CDAPの化学構造CDAP= 1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロ化物. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> 図2: CDAPの活性化と活用のプロセス このプロセスは概念的に2つの相に分けられ、活性化された多糖は両方に共通する。基本的な条件下では、CDAPは多糖類ヒドロキシルを活性化し、DMAP(反応1)を放出する。CDAP加水分解はDMAP(反応3)も放出する。シアノエステルが示されているが、これは実際の中間体ではないかもしれない。この中間体は、したがって、(CDAP)「活性化された」多糖類と呼ばれる。第1活性化段階の間、活性化された多糖類は加水分解(反応4)、または副反応(反応5)を受けることができる。第2の共役相(反応2)において、活性化多糖はアミンと反応して、反応4及び5に加えて安定なイズリア結合を形成する。略語: CDAP = 1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロ化;DMAP = 4-ジメチルアミノピリジン;R-NH2 = アミン. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> 図3:CDAPの活性化と活用 このプロセスでは、CDAP反応性と多糖類のバランス、CDAPおよび活性化多糖の安定性、ならびに活性化多糖類とアミンの反応性のバランスを取る必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> 図4: デキストランのCDAP活性化の代表的な結果 典型的な標準曲線(A)レゾルシノール/硫酸および(B)TNBSアッセイ。0.25および0.5mgのCDAP/mgデキストランで活性化されたデキストランのアッセイ結果を示す。グルコースは、レゾルシノールアッセイの標準として使用した。デキストランは、mg/mLで、100kDaで割って、モル濃度を与える。ヒドラジド濃度は、ADHを標準として決定し、結果をμMHz(C)ヒドラジドの計算:デキストラン比で表します。誘導体化のレベルは、異なる平均分子量のポリマー間の比較を容易にするためにデキストランの100kDa当たりヒドラジドとして計算した。G ADH/gデキストランの重量比%は、ADHに対して174g/モルのMWを用いて計算した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

タンパク質およびアミン含有リガンドは、シアニル化試薬によって活性化される多糖類に共有結合することができ、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロゴウ酸塩(CDAP)、共有タンパク質(リガンド)多糖結合体を形成する。本稿では、制御されたCDAP活性化を0°Cで行い、pHを変化させ、活性化多糖の後で結合を行うための改良されたプロトコルについて説明します。

1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロ化物(CDAP)を用いた可溶性多糖の活性化と結合

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

多糖は、タンパク質にリンクしていない限り免疫原性が悪く、タンパク質への誘導体化または共役のために活性化する必要があります。この方法では、CDAPが砂の装持ち試薬として使用される。CDAPは、多糖ヒドロキシルを活性化し、誘導体化のために、またはワクチンや診断試薬に使用するためにタンパク質にリンクされます。CDAPは、多糖砂装用試薬として臭化シアンを大部分置き換えました。CDAPは使用が簡単で、より効率的で、臭化シアノーゲンよりも低いpHで使用することができます。それは試薬を活性化するはるかに良いです。CDAPは、還元的アミノ化とは異なり、ほとんどの多糖類と一緒に使用することができ、これはビジナルヒドロキシルを必要とする。この化学は、タンパク質に直接および間接的に結合するために使用することができ、診断試薬を作るために使用することができます。CDAP活性化反応は、当初述べたように、非常に迅速かつ制御が困難であった。ここで提供されるプロトコルは、化学をはるかに実行しやすく、はるかに再現可能になります。実験を開始する前に、攪拌しながら200マイクロリットルのジメチルアミノピリジンストック溶液を滴下して添加して、多糖液のpHを9に調整します。活性化のプロセス全体のために氷水浴で反応を冷やしてください。攪拌しながらCDAP100マイクロリットルを多糖液に移すことで、シアノ-ジメチルアミノピリジン-テトラフルオロゴレートまたはCDAP活性化を進めます。タイマーを開始し、15 分間のアクティベーション中に pH の変更を監視します。0.1モル水酸化ナトリウムを速やかに10マイクロリットルずつ添加することで、目標pHでの反応を維持します。最適な活性化時間に達したら、活性化多糖に0.5モルアジピックジヒドラジドを一度に2ミリリットル加えます。pHが水酸化物の官能化に必要な範囲であることを確認してください。反応混合物を少なくとも1時間撹拌した後、反応混合物を摂氏4度に移す。生成物からのADH濃度を低減するために、透析装置を用いて粗型誘導体多糖液を透析する。導出多糖類を透析から回収し、多糖類とヒドラジドの濃度を決定し、ヒドラジドを多糖比に算出します。標準として使用されるミリリットルの未修飾多糖溶液あたり1ミリグラムを準備します。.安定した均一な温度を達成するために最低1時間、140°Cに加熱ブロックを予熱します。酸がこぼれた場合には、下と暖房ブロックの周囲に保護パッドを使用してください。トリクリティートで100ホウケイ酸試験管でラベル13に1ミリグラムの炭水化物標準あたり1ミリグラムの様々な量を追加し、所望の標準濃度を達成するために水で100マイクロリットルに体積を構成します。同様に、誘導体化多糖の5マイクログラムを含む体積を3本のサンプルチューブに添加してサンプルアッセイを設定する。各チューブに1ミリリットルのレゾルシノールあたり1ミリグラムを作り、作りたての100マイクロリットルを加えます。繰り返しピペッタを使用して、各チューブに調製された75%硫酸の300マイクロリットルを追加し、チューブを激しく渦盛り、チューブを離れて指し、ヒーターブロック内のすべてのチューブを連続した順序で安定したペースで配置し、すぐにタイマーを3分間設定します。3分で、チューブを同じ順序で取り出し、氷水浴中のラックに直接入れます。氷冷管を取り外し、室温まで5分間平衡させます。10ミリメートルのパス長キュベットを使用して、430ナノメートルのUV-Vis分光光度計上のすべてのチューブの吸光度を読み取ります。アッセイ反応を設定するには、ラベル付き標準チューブをチューブラック内で並べ替え、濃度を上げる順序で配置します。キャリブレーションされたマイクロピペットを使用して、各対応するチューブに100マイクロリットルの標準を追加します。ゼロ標準の場合は、サンプルバッファーの 100 マイクロリットルを使用します。同様に、サンプルチューブを調製し、配置します。次に、校正した1,000マイクロリットルマイクロピペットを使用し、875マイクロリットルのアッセイバッファーをすべてのアッセイチューブに加えます。アッセイ反応を開始するには、25マイクロリットルの1%トリニトロベンゼンスルホン酸を各アッセイチューブに5分以内に所定の順序で加える。アッセイチューブを高速で2秒間渦巻き、液体がチューブ開口部から半インチの高さまで渦巻くことを確認します。アッセイの開始時刻を記録し、タイマーを2時間に設定します。その後、アッセイチューブラックを室温で暗く2時間置きます。時間が過ぎると、チューブを渦に入れ、データ収集に進みます。ADHデキストランを、レゾルシノール硫酸アッセイを用いてデキストランについてアッセイした。糖標準としてグルコースを用いた典型的な標準チューブをプロットした。誘導体化多糖またはデキストランにおけるヒドラジド含量を、TNBSアッセイを用いて決定した。誘導体化のレベルは、異なる平均分子量のポリマー間の比較を容易にするために、デキストランの100キロダルトン当たりの水素化物として計算した。ここで説明するプロトコルは、特定の多糖に適合する必要がある場合があります。CDAP化学は、多糖類を機能化し、多種多様なコンジュゲーション試薬を使用することができます。これは、例えば、多糖類をエリサで使用するためにビオチン化するために使用することができる。タンパク質はCDAP活性化多糖に直接リンクすることができますが、これは通常、特定の多糖に対していくらかの最適化が必要です。共役収量は75%以上になる可能性 CDAP 化学の使用は、インド血清研究所が作ったような低コストの共役ワクチンを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム

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ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

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B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

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密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...