Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Verket som er beskrevet her ble finansiert av Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees er grunnlegger og eier av Fina Biosolutions. Han har flere patenter knyttet til CDAP-kjemi og drar nytte av lisensiering av kjemi og CDAP-konjugerings-kunnskap.

CDAP er et praktisk reagens for å avlede og konjugere polysakkarider. Denne artikkelen beskriver den generelle metoden for å bruke CDAP til å avlede polysakkarider med hydrazides (PS-ADH) og inneholder nylig publiserteforbedringer 8. For det første understreker teknikken viktigheten av å opprettholde mål-pH for å kontrollere aktiveringsprosessen. Vi fant ut at selv om mange vanlige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaksjonen, kan DMAP brukes som buffer for å administrere pH8. Videre er DMAP allerede et reaksjonsbiprodukt av CDAP-aktivering. Til slutt, bufring av polysakkaridløsningen med DMAP før du legger til CDAP, letter presis målretting og vedlikehold av reaksjonen pH. Som vi beskriver, er det nyttig å justere pH for den konsentrerte DMAP-lagerløsningen slik at den når den fortynnes når den målrettede pH. For det andre bremset prosessen i kulde reaksjonstiden, noe som gjorde aktiveringsprosessen mindre frenetisk og mer tilgivende. Lavere temperatur reduserte hastigheten på CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstiden ved pH 9 øker fra ~ 3 min til ~ 15 min. I tillegg er det nødvendig med mindre CDAP for å oppnå samme aktiveringsnivå enn ved romtemperatur. 
ADH-derivatiserte polysakkarider kan konjugeres til proteiner ved hjelp av karbodiimider (f.eks. EDAC)7. For eksempel bruker flere lisensierte Haemophilus influensa b (Hib) vaksiner polyribosylribitolphosphate (PRP) derivatisert med ADH for å konjugere til stivkrampetoksoid ved hjelp av EDAC. CNBr ble opprinnelig ansatt, men CDAP er et mye enklere reagens å bruke til dette formålet. Etter vår erfaring er et godt målområde for ADH-avledning 10-30 hydrazides per 100 kDa polysakkarid eller ~ 1-3% ADH etter vekt. 
Den samme prosessen kan brukes til å avlede polysakkarider med primære aminer ved å erstatte ADH for en diamin. Det anbefales å bruke heksandiamin for å avlede polysakkarider med aminer8. Det aminerte polysakkaridet (PS-NH2) kan konjugeres ved hjelp av reagenser utviklet for proteinkonjugering11. PS-NH2 avledes vanligvis med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-karboksylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oksuccinimid ester (GMBS)), og proteinet er tiolated (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kjemi er svært effektiv.
Proteiner kan også kobles direkte til CDAP-aktiverte polysakkarider via ɛ-amin på lysiner. Mens aktiveringsprotokollen som brukes, generelt ligner den som er beskrevet her, er det nødvendig å optimalisere aktiveringsnivået, polysakkaridet og proteinkonsentrasjonen, samt protein: polysakkaridforholdet5,6,8. 
Dextran er en av de enkleste polysakkaridene å aktivere med CDAP på grunn av sin relativt høye tetthet av hydroksylgrupper, men noen polysakkarider, som Vi antigen, kan være utfordrende. Følgelig er det ingen enkelt "beste" protokoll for CDAP-konjugering direkte til proteiner. Vi foreslår først å utvikle en protokoll for å oppnå passende aktiveringsnivåer, som bestemt av omfanget av hydrazidavledning, og deretter fortsette å lede proteinkonjugering til CDAP-aktivert polysakkarid.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Konjugatvaksiner, som de som består av polysakkarider som er kovalent knyttet til et bærerprotein, er blant de bemerkelsesverdige fremskrittene innen vaccinologi1,2. Polysakkarider, som T-celleuavhengige antigener, er dårlig immunogene hos spedbarn og induserer ikke minne, klasseveksling eller affinitetsmodning av antistoffer3. Disse manglene overvinnes i polysakkaridkonjugatvaksiner4. Siden de fleste polysakkarider ikke har et praktisk kjemisk håndtak for konjugering, må de først gjøres reaktive eller "aktiverte". Det aktiverte polysakkaridet kobles deretter enten direkte til proteinet (eller modifisert protein) eller er funksjonalisert for ytterligere avledning før konjugering4. De fleste lisensierte polysakkaridkonjugatvaksiner bruker enten reduktiv aminering eller cyanylering for å aktivere polysakkaridhydroksyler. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens som tidligere hadde blitt brukt til å aktivere kromatografi harpikser, ble opprinnelig brukt til polysakkaridavledning. CNBr krever imidlertid høy pH, vanligvis ~ pH 10,5 eller høyere, for delvis å deprotonere polysakkaridhydroksyler slik at de er tilstrekkelig nukleofile til å angripe cyanogruppen. Den høye pH kan være skadelig for base-labile polysakkarider, og verken CNBr eller den aktive cyano-esteren som opprinnelig ble dannet, er tilstrekkelig stabil ved så høy pH.
CDAP (1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) ble introdusert av Lees et al. for bruk som et cyanylerende middel for aktivering av polysakkarider5,6. CDAP, som er krystallinsk og lett å håndtere, ble funnet å aktivere polysakkarider ved en lavere pH enn CNBr og med færre sidereaksjoner. I motsetning til CNBr kan CDAP-aktiverte polysakkarider direkte konjugeres til proteiner, noe som forenkler synteseprosessen. CDAP-aktiverte polysakkarider kan funksjonaliseres med diamin (f.eks. heksandiamin) eller en dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for å lage amino- eller hydrazid-derivatiserte polysakkarider. En høy konsentrasjon av homobifunctional reagens brukes til å undertrykke krysskobling av polysakkarider. Aminopolysakkarider kan deretter konjugereres ved hjelp av noen av de utallige teknikkene som brukes til proteinkonjugering. Hydrazid-derivatiserte polysakkarider kobles ofte til proteiner ved hjelp av karbodiimidreagens (f.eks. 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC))7. Ytterligere optimalisering av CDAP polysakkaridaktivering er beskrevet av Lees et al.8 og er innlemmet i protokollen som er beskrevet her.
Oversikt over CDAP-konjugering CDAP-protokollen kan konseptualiseres som to faser: (1) aktiveringen av polysakkaridet og (2) konjugering av det aktiverte polysakkaridet med et protein eller en ligand (figur 2). Målet med det første trinnet er å effektivt aktivere polysakkaridet, mens målet med det andre er å effektivt konjugere til det aktiverte polysakkaridet. Det aktiverte polysakkaridet binder de to trinnene sammen. Denne konseptualiseringen bidrar til å fokusere på de kritiske elementene i hvert trinn. Figur 2 utvider denne konseptualiseringen, og viser ønskede aktiverings- og koblingsreaksjoner, sammen med hydrolysereaksjonene og sidereaksjonene.
I aktiveringsfasen er de tre største bekymringene CDAP-stabilitet, CDAP-reaksjon med polysakkaridhydroksylene og stabiliteten til det aktiverte polysakkaridet (figur 3). CDAP-hydrolyse øker med pH, det samme gjør hydrolysen til det aktiverte polysakkaridet og sidereaksjonene. CDAP-reaksjonen med polysakkaridet forenkles imidlertid ved å øke pH. Effektiv aktivering av polysakkarider med CDAP krever en balanse mellom 1) reaktivitet av polysakkarid og CDAP og 2) hydrolyse- og sidereaksjonene til både reagenset og det aktiverte polysakkaridet.
I den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen beskrevet av Lees et al.5ble CDAP-aktivering av polysakkarider utført ved romtemperatur i ubufferet pH 9-løsning. Aktiveringshastigheten ble funnet å være rask under denne tilstanden, og aktiveringen ville være fullført innen 3 minutter. Reaksjonen ble også ledsaget av rask hydrolyse av CDAP, noe som førte til en rask pH-dråpe av den ubufferede reaksjonsløsningen. Det var utfordrende å raskt heve og opprettholde reaksjonen pH på målverdien på så kort tid. I den beskrevne protokollen ble aktivering utført ved å legge til CDAP fra en 100 mg /ml lagerløsning til den ubuffered polysakkaridløsningen. PH ble hevet 30 s senere med "et likt volum på 0,2 M trietylamin". Protein som skal konjugereres ble deretter tilsatt etter 2,5 min til aktiveringsreaksjonen. Spesielt var pH for aktiveringstrinnet ikke godt kontrollert og sannsynligvis i utgangspunktet overskredet målet pH. Den raske reaksjonen som krever rask pH-justering gjorde aktiveringsprosessen vanskelig å kontrollere og utfordrende å skalere opp.
I motsetning til den opprinnelige protokollen har den modifiserte protokollen som er beskrevet her to store forbedringer. For det første er pH i polysakkaridløsningen forhåndsjustert til målaktivering pH, ved hjelp av DMAP som buffer, før tillegg av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har dermed god bufferkraft rundt pH 9, og i motsetning til mange andre buffere ble det ikke funnet DMAP for å fremme CDAP hydrolyse8. Videre er DMAP allerede en prosess mellomliggende og legger derfor ikke til en ny komponent til reaksjonsblandingen. Forhåndsjustering av pH før du legger til CDAP eliminerer den store pH-svingen i begynnelsen av reaksjonen og gir mer effektivt vedlikehold av mål-pH under reaksjonen. Den andre forbedringen er å utføre aktiveringsreaksjonen ved 0 °C, der frekvensen av CDAP-hydrolyse er markert langsommere enn ved romtemperatur. Med lengre halveringstid for reagens ved 0 °C økes aktiveringstiden fra 3 min til 15 minutter for å kompensere for den langsommere aktiveringshastigheten ved lavere temperatur. Den lengre reaksjonstiden gjør det i sin tur lettere å opprettholde reaksjonen pH. Bruken av 0 °C reduserer også nedbrytningen av pH-sensitive polysakkarider, noe som gjør det mulig å forberede konjugater av denne typen polysakkarid. Forbedringene i protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, enklere å kontrollere, mer reproduserbar og mer mottagelig for oppskalering.
Denne artikkelen beskriver den forbedrede protokollen for å utføre kontrollert CDAP-aktivering av polysakkarid ved 0 °C og ved et angitt mål-pH og utføre etterfølgende avledning av de aktiverte polysakkaridene med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) analyse, basert på metoden til Qi et al.9, for bestemmelse av hydrazidnivå på det modifiserte polysakkaridet. En modifisert analyse for heksoser basert på resorcinol og svovelsyre10 er også beskrevet, som kan brukes til å bestemme et bredere spekter av polysakkarider. Hvis du vil ha mer informasjon om CDAP-aktivering og -konjugering, refereres leseren til tidligere publikasjoner5,6,8 av Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Konjugatvaksiner er bemerkelsesverdige fremskritt innen vaksinering. For fremstilling av polysakkaridkonjugatvaksiner kan polysakkaridene enkelt funksjonaliseres og knyttes til vaksinebærerproteiner ved hjelp av 1-cyano-4-dimetylaminopyridintetrafluoroborate (CDAP), et cyanylerende reagens som er lett å håndtere. CDAP aktiverer polysakkarider ved å reagere med karbohydrathydroksylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten til CDAP er svært pH-avhengig. pH-en til reaksjonen reduseres også under aktivering på grunn av hydrolysen til CDAP, noe som gjør at god pH kontrollerer nøkkelen til reproduserbar aktivering. Den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen ble utført ved romtemperatur i ubuffered pH 9-løsninger.
På grunn av den raske reaksjonen under denne tilstanden (<3 min) og det medfølgende raske pH-fallet fra den raske CDAP-hydrolysen, var det utfordrende å raskt justere og opprettholde målreaksjonen pH på kort tid. Den forbedrede protokollen som er beskrevet her, utføres ved 0 °C, noe som bremser CDAP-hydrolysen og forlenger aktiveringstiden fra 3 min til ~15 min. Dimetylaminopyridin (DMAP) ble også brukt som en buffer for å forhåndsjustere polysakkaridløsningen til målaktiverings-pH før du legger til CDAP-reagenset. Den lengre reaksjonstiden, kombinert med den langsommere CDAP-hydrolysen og bruken av DMAP-buffer, gjør det enklere å opprettholde aktiverings-pH for hele aktiveringsprosessens varighet. Den forbedrede protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, mer reproduserbar og mer egnet til å skalere opp.

For å illustrere aktivering og avledning av et polysakkarid ved hjelp av CDAP-kjemi ble dextran aktivert ved 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran. For hver reaksjon ble en 10 mg/ml dekstranoppløsning i vann avkjølt på is, og 1/10tonn av en 2,5 M DMAP-bestand (fremstilt som beskrevet i avsnitt 3) ble tilsatt. Den endelige løsningen ble brakt til pH 9 ved tilsetning av 0,1 M NaOH i 10 μL aliquots. Løsningen ble kjølt og rørt, CDAP lagt til, og pH opprettholdt ved pH 9 ved å legge til 10 μL aliquots på 0,1 M NaOH i 15 min. Bare 0,25 ml 0,5 M ADH ved pH 9 ble tilsatt (mindre enn vanlig mengde) og reaksjonen tillot å fortsette over natten ved 4 °C.
Den merkede dextranen ble deretter sekvensielt dialysert mot 1 M NaCl, 0,15 M NaCl og vann som beskrevet i avsnitt 6. ADH-dextran ble deretter analysert for dekstran ved hjelp av resorcinol/svovelsyreanalysen (pkt. 7.2). En typisk standardkurve med glukose som sukkerstandard er vist i figur 4A. Hydrazidinnholdet ble fastslått ved hjelp av TNBS-analysen beskrevet i pkt. 7.3. En typisk hydrazid standardkurve som bruker ADH som standard er gitt i figur 4B.
Representative beregninger fra aktivering av dextran på de to aktiveringsnivåene vises i figur 4A,B. Dataene presenteres som både hydrazides per 100 kDa dextran polymer og som en vektprosent av ADH til dextran, som beskrevet i pkt. 7.9.3.4 og 7.9.3.5, henholdsvis i figur 4C. Graden av avledning ble omtrent doblet da CDAP-forholdet ble doblet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figur 1: Kjemisk struktur av CDAP. CDAP = 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figur 2: Prosessen med CDAP-aktivering og konjugering. Prosessen er konseptuelt delt inn i to faser, med den aktiverte polysakkariden som er vanlig for begge. Under grunnleggende forhold aktiverer CDAP hydroksyler av polysakkarid, og frigjør DMAP (reaksjon 1). CDAP-hydrolyse frigjør også DMAP (reaksjon 3). Selv om en cyano-ester vises, kan det hende at dette ikke er det faktiske mellomproduktet. Mellomproduktet kalles derfor (CDAP) "aktivert" polysakkarid. I løpet av den første aktiveringsfasen kan det aktiverte polysakkaridet hydrolysere (reaksjon 4) eller gjennomgå sidereaksjoner (reaksjon 5). I den andre konjugeringsfasen (reaksjon 2) reagerer det aktiverte polysakkaridet med et amin for å danne en stabil isoureabinding i tillegg til reaksjonene 4 og 5. Forkortelser: CDAP = 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimetylaminopyridin; R-NH2 = Amin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figur 3: CDAP-aktivering og -konjugering. Prosessen krever balansering av CDAP-reaktivitet med polysakkaridet, stabiliteten til CDAP og aktivert polysakkarid, samt reaktivitet av det aktiverte polysakkaridet med aminets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figur 4: Representative resultater for CDAP-aktivering av dextran. Typiske standardkurver for (A) resorcinol/svovelsyre og (B) TNBS-analyser. Analyseresultatene for dekstran aktivert med 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran vises. Glukose ble brukt som standard for resorcinolanalysen. Dextran, i mg/ml, er delt på 100 kDa for å gi en molarkonsentrasjon. Hydrazidkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av ADH som standard og resultatene uttrykt som μM Hz. (C) Beregning av hydrazid: dekstranforhold. Nivået av avledning ble beregnet som hydrazides per 100 kDa dextran for å lette sammenligningen mellom polymerer av forskjellige gjennomsnittlige molekylvekter. Vektforholdet på g ADH/g dextran ble beregnet ved hjelp av en MW på 174 g/mol for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteiner og aminholdige ligander kan kovalent knyttes til polysakkarider aktivert av cyanyleringsreagenset, 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate (CDAP), for å danne kovalent protein (ligand)-polysakkaridkonjugater. Denne artikkelen beskriver en forbedret protokoll for å utføre kontrollert CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og utføre etterfølgende konjugering av de aktiverte polysakkaridene.

Aktivering og konjugering av løselige polysakkarider med 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polysakkarider er dårlig immunogene med mindre de er knyttet til protein og må aktiveres for avledning eller konjugering til proteiner. I denne metoden brukes CDAP som reagens for sandsnøring. CDAP aktiverer hydroksyler av polysakkarider for avledning eller for å være knyttet til proteiner for bruk i vaksiner eller diagnostiske reagenser.CDAP har i stor grad erstattet cyanogenbromid som et polysakkaridsand-reagens. CDAP er enklere å bruke, mer effektiv og kan brukes ved en lavere pH enn cyanogenbromid. Det er en mye bedre aktiverende reagens.CDAP kan brukes med de fleste polysakkarider, i motsetning til reduktiv aminering, som krever vicinale hydroksyler. Kjemien kan brukes til både direkte og indirekte å konjugere til proteiner, og den kan brukes til å lage diagnostiske reagenser. CDAP-aktiveringsreaksjonen, som opprinnelig beskrevet, var veldig rask og vanskelig å kontrollere.Protokollen her gjør kjemien langt enklere å utføre og mye mer reproduserbar. Før du starter eksperimentet, juster pH i polysakkaridoppløsningen til 9 ved å tilsette 200 mikroliter dimetylaminopyridin lagerløsning på en dråpevis måte under omrøring. Hold reaksjonen avkjølt i et isvannbad for hele aktiveringsprosessen.Fortsett med cyano-dimetylaminopyridin-tetrafluoroborate eller CDAP-aktivering ved å overføre 100 mikroliter CDAP til polysakkaridoppløsningen under omrøring. Start tidtakeren og overvåk pH-endringen under hele aktiveringen i 15 minutter. Opprettholde reaksjonen ved målet pH ved å umiddelbart legge til 10 mikroliter trinn på 0,1 molar natriumhydroksid.Når den optimale aktiveringstiden er nådd, tilsett to milliliter 0,5 molar adipic dihydrazid på en gang til det aktiverte polysakkaridet. Kontroller at pH er i det nødvendige området for hydroksidfunksjonalisering. Etter kontinuerlig omrøring av reaksjonsblandingen i minst en time, overfør reaksjonsblandingen til fire grader Celsius.For å redusere ADH-konsentrasjonen fra produktet, dialyze den rå avledede polysakkaridløsningen ved hjelp av dialyseenheten. Gjenopprett det avledede polysakkaridet fra dialyse og bestem konsentrasjonen av polysakkarider og hydrazid for å beregne hydrazid til polysakkaridforhold. Forbered ett milligram per milliliter umodifisert polysakkaridløsning som skal brukes som standard.Forvarm varmeblokken til 140 grader Celsius i minst en time for å oppnå en stabil jevn temperatur. Bruk en beskyttelsespute under og rundt varmeblokken i tilfelle syresøl. Tilsett varierende volumer på ett milligram per milliliter karbohydratstandard til merket 13 x 100 borosilikat reagensrør i triplikater og utgjør volumet til 100 mikroliter med vann for å oppnå de ønskede standardkonsentrasjonene.På samme måte kan du sette opp prøveanalyser ved å legge til et volum som inneholder fem mikrogram av det avledede polysakkaridet til tre prøverør. Tilsett 100 mikroliter nylagde seks milligram per milliliter resorcinol til hvert rør. Bruk en gjentatt pipetter, tilsett 300 mikroliter av den tilberedte 75% svovelsyren til hvert rør, virvel rørene kraftig, pek røret bort, legg deretter alle rørene i en varmeblokk i et jevnt tempo i sekvensiell rekkefølge og still umiddelbart timeren i tre minutter.På tre minutter fjerner du rørene i samme rekkefølge og legger dem direkte i et stativ i et isvannbad. Fjern de iskalde rørene slik at de kan likevekte til romtemperatur i fem minutter. Les absorbansen av alle rørene på et UV-Vis spektrofotometer ved 430 nanometer ved hjelp av en 10 millimeters banelengde cuvette.For å sette opp analysereaksjoner, sorter og ordne de merkede standardrørene i rørstativet for å øke konsentrasjonen. Bruk en kalibrert mikropipette, tilsett 100 mikroliter av standardene til hvert tilsvarende rør. For nullstandarden bruker du 100 mikroliter av prøvebufferen.På samme måte, forbered og ordne prøverørene. Deretter bruker du en kalibrert mikropipette med 1000 mikroliter, og tilsetter 875 mikroliter analysebuffer til alle analyserør. For å starte analysereaksjonen, tilsett 25 mikroliter 1% trinitrobenzene sulfonsyre til hvert analyserør i forhåndsbestemt rekkefølge innen fem minutter.Virvel analyserørene i to sekunder ved høy hastighet, og sørg for at væsken virvler til en høyde på en halv tomme fra røråpningen. Registrer starttidspunktet for analysen og sett tidtakeren til to timer. Plasser deretter analyserørstativet i mørket ved romtemperatur i to timer.Når tiden er over, virvel rørene og fortsett til datainnsamling. ADH-dekstranen ble analysert for dekstran ved hjelp av resorcinol svovelsyreanalysen. Et typisk standardrør med glukose som sukkerstandard ble plottet.Hydrazidinnholdet i derivatisert polysakkarid eller dekstran ble bestemt ved hjelp av TNBS-analysen. Nivået av avledning ble beregnet som hydroder per 100 kilodaltonn dextran for å lette sammenligningen mellom polymerer av forskjellige gjennomsnittlige molekylvekter. Protokollen som er beskrevet her, må kanskje tilpasses for et bestemt polysakkarid.CDAP-kjemi kan brukes til å funksjonalisere polysakkarider for bruk med et bredt utvalg av konjugeringsreagenser. Den kan for eksempel brukes til å biotinylatpolysakkarider til bruk i ELISAer. Proteiner kan kobles direkte til CDAP-aktiverte polysakkarider, men dette krever vanligvis litt optimalisering for et bestemt polysakkarid.Konjugeringsutbyttet kan være over 75%Bruken av CDAP-kjemi har muliggjort billige konjugatvaksiner, som de som er laget, for eksempel av Serum Institute of India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder for kvantitativ påvisning av antistoff-indusert komplementaktivering på røde blodlegemer

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk feste analysen for Study of inte Activation i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering og aktivering av lymfocytter Murine

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Etableringen av et tett Transposon innsetting biblioteket bruker bakteriell bøyning i Enterobacterial stammer som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...