Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

O trabalho aqui descrito foi financiado pela Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees é fundador e proprietário da Fina Biosolutions. Ele detém várias patentes relacionadas à química do CDAP e se beneficia do licenciamento do know-how de química e conjugação do CDAP.

CDAP é um reagente conveniente para derivatizar e conjugar polissacarídeos. Este artigo descreve o método geral de uso do CDAP para derivatizar polissacarídeos com hidrazidas (PS-ADH) e incorpora melhorias publicadas recentemente8. Em primeiro lugar, a técnica enfatiza a importância de manter o pH alvo para controlar o processo de ativação. Descobrimos que, embora muitos buffers comuns interfiram na reação de ativação do CDAP, o DMAP poderia ser usado com sucesso como buffer para gerenciar o pH8. Além disso, o DMAP já é um subproduto de reação da ativação do CDAP. Finalmente, tamponar a solução de polissacarídeo com DMAP antes de adicionar o CDAP facilita a segmentação e manutenção precisas do pH de reação. Como descrevemos, é útil ajustar o pH da solução concentrada de estoque DMAP de tal forma que, quando diluído, atinge o pH alvo. Em segundo lugar, realizar o processo no frio diminuiu o tempo de reação, tornando o processo de ativação menos frenético e mais indulgente. A temperatura mais baixa diminuiu a taxa de hidrólise CDAP, e o tempo ideal de ativação no pH 9 aumenta de ~3 min para ~15 min. Além disso, menos CDAP é necessário para alcançar o mesmo nível de ativação do que quando realizado à temperatura ambiente. 
Polissacarídeos derivados do TDAH podem ser conjugados a proteínas usando carbodimídeos (por exemplo, EDAC)7. Por exemplo, várias vacinas licenciadas de Haemophilus influenzae b (Hib) usam o poliribosylribitolphosphate (PRP) derivado com ADH para conjugar ao toxóide tétano usando EDAC. A CNBr foi inicialmente empregada, mas o CDAP é um reagente muito mais fácil de usar para esse fim. Em nossa experiência, uma boa faixa-alvo para derivatização de ADH é de 10-30 hidrazidas por polissacarídeo de 100 kDa ou ~1-3% ADH em peso. 
O mesmo processo pode ser usado para derivatizar polissacarídeos com aminas primárias substituindo o ADH por uma diamina. Recomenda-se o uso de diamina de hexano para derivatizar polissacarídeos com aminas8. O polissacarídeo aminado (PS-NH2) pode ser conjugado utilizando reagentes desenvolvidos para conjugação proteica11. Normalmente, o PS-NH2 é derivatizado com um maleimida (por exemplo, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxilato (SMCC) ou N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), e a proteína é tialada (por exemplo, com succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionato (SPDP)). A química thiol-maleimida é muito eficiente.
As proteínas também podem ser diretamente acopladas a polissacarídeos ativados pelo CDAP através da ɛ-amina em lisesinas. Embora o protocolo de ativação utilizado seja geralmente semelhante ao descrito aqui, é necessário otimizar o nível de ativação, polissacarídeo e concentração de proteínas, bem como a relação proteína:polissacarídeo5,6,8.
O Dextran é um dos polissacarídeos mais fáceis de ativar com CDAP devido à sua densidade relativamente alta de grupos hidroxil, mas alguns polissacarídeos, como o antígeno Vi, podem ser desafiadores. Consequentemente, não há um único protocolo "melhor" para a conjugação do CDAP diretamente às proteínas. Sugerimos primeiro desenvolver um protocolo para alcançar níveis adequados de ativação, determinados pela extensão da derivação de hidrazida, e depois proceder à conjugação direta de proteínas ao polissacarídeo ativado pelo CDAP.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

As vacinas conjugadas, como as constituídas por polissacarídeos covalentemente ligados a uma proteína portadora, estão entre os avanços notáveis na vacinação1,2. Polissacarídeos, como antígenos independentes de células T, são pouco imunogênicos em bebês e não induzem memória, troca de classe ou maturação de afinidade de anticorpos3. Essas deficiências são superadas nas vacinas conjugadas de polissacarídeos4. Como a maioria dos polissacarídeos não tem uma alça química conveniente para conjugação, eles devem primeiro ser reativados ou "ativados". O polissacarídeo ativado é então ligado diretamente à proteína (ou proteína modificada) ou é funcionalizado para derivação adicional antes da conjugação4. A maioria das vacinas conjugadas de polissacarídeo licenciados usa aminação redutiva ou cianelação para ativar hidróxils de polissacarídeo. Brometo de cianogênio (CNBr), um reagente que já havia sido usado para ativar resinas cromatografias, foi inicialmente utilizado para derivação de polissacarídeo. No entanto, o CNBr requer alto pH, tipicamente ~ pH 10,5 ou superior, para desprotolar parcialmente hidróxia polisacarídeos de modo que eles são suficientemente nucleofílicos para atacar o grupo ciano. O pH alto pode ser prejudicial para polissacarídeos de laboratório base, e nem o CNBr nem o ciano-éster ativo inicialmente formado é suficientemente estável a um pH tão alto.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyrite tetrafluoroborate; Figura 1) foi introduzido por Lees et al. para uso como um agente de cianolato para a ativação de polissacarídeos5,6. CDAP, que é cristalino e fácil de manusear, foi encontrado para ativar polissacarídeos a um pH mais baixo que o CNBr e com menos reações laterais. Ao contrário do CNBr, polissacarídeos ativados pelo CDAP podem ser diretamente conjugados às proteínas, simplificando o processo de síntese. Polissacarídeos ativados pelo CDAP podem ser funcionalizados com uma diamina (por exemplo, diamina de hexano) ou um dihidrazida (por exemplo, dihidrazida adipica, ADH) para fazer polissacarídeos derivados de amino ou hidrazida. Uma alta concentração do reagente homobifuncional é usada para suprimir o crosslinking de polissacarídeos. Os polissacarídeos amino podem então ser conjugados usando qualquer uma das inúmeras técnicas utilizadas para a conjugação de proteínas. Polissacarídeos derivados de hidrazida são frequentemente acoplados a proteínas usando um reagente de carbodimídeo (por exemplo, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimida (EDAC))7. A otimização adicional da ativação de polissacarídeo CDAP foi descrita por Lees et al.8 e está incorporada ao protocolo descrito aqui.
Visão geral da conjugação CDAP O protocolo CDAP pode ser conceituado como duas fases: (1) a ativação do polissacarídeo e (2) conjugação do polissacarídeo ativado com proteína ou ligante(Figura 2). O objetivo do primeiro passo é ativar eficientemente o polissacarídeo, enquanto o objetivo do segundo é conjugar eficientemente ao polissacarídeo ativado. O polissacarídeo ativado une os dois passos. Essa conceituação ajuda a focar nos elementos críticos de cada passo. A Figura 2 expande-se nessa conceituação, mostrando as reações desejadas de ativação e acoplamento, juntamente com as reações da hidrólise e reações laterais.
Durante a fase de ativação, as três principais preocupações são a estabilidade do CDAP, a reação CDAP com os hidroxis de polissacarídeo e a estabilidade do polissacarídeo ativado(Figura 3). A hidrólise CDAP aumenta com pH, assim como a hidrólise do polissacarídeo ativado e as reações laterais. No entanto, a reação cdap com o polissacarídeo é facilitada pelo aumento do pH. Ativação eficiente de polissacarídeos com CDAP requer um equilíbrio entre 1) a reatividade do polissacarídeo e CDAP e 2) a hidrólise e as reações laterais tanto do reagente quanto do polissacarídeo ativado.
No protocolo original de ativação do CDAP descrito por Lees et al.5, a ativação cdap de polissacarídeos foi realizada à temperatura ambiente em solução pH 9 não oferecida. A taxa de ativação foi considerada rápida nesta condição, e a ativação seria completa em 3 minutos. A reação também foi acompanhada pela hidrólise rápida do CDAP, causando uma rápida queda de pH da solução de reação não oferecida. Foi desafiador aumentar rapidamente e manter a reação pH no valor-alvo em um período de tempo tão curto. No protocolo descrito, a ativação foi realizada adicionando CDAP a partir de uma solução de estoque de 100 mg/mL à solução de polissacarídeo não agregada. O pH foi levantado 30 s depois com "um volume igual de trietilamina de 0,2 M". A proteína a ser conjugada foi então adicionada após 2,5 minutos à reação de ativação. Notavelmente, o pH da etapa de ativação não foi bem controlado e provavelmente excedeu inicialmente o pH alvo. A reação rápida que exigia ajuste rápido de pH dificultou o controle do processo de ativação e desafiou a escala.
Em contraste com o protocolo original, o protocolo modificado aqui descrito tem duas grandes melhorias. Primeiro, o pH da solução de polissacarídeo é pré-ajustado para o pH de ativação de alvo, usando DMAP como tampão, antes da adição do CDAP. O DMAP possui um pKa de 9.5 e, portanto, tem boa potência de buffer em torno do pH 9, e ao contrário de muitos outros buffers, o DMAP não foi encontrado para promover a hidrólise CDAP8. Além disso, o DMAP já é um processo intermediário e, portanto, não adiciona um novo componente à mistura de reação. O pré-ajuste do pH antes de adicionar CDAP elimina o grande balanço de pH no início da reação e permite uma manutenção mais eficiente do pH alvo durante a reação. A segunda melhora é realizar a reação de ativação a 0 °C, onde a taxa de hidrólise CDAP é marcadamente mais lenta do que a temperatura ambiente. Com a meia-vida do reagente mais longa a 0 °C, o tempo de ativação é aumentado de 3 min para 15 min para compensar a taxa de ativação mais lenta na temperatura mais baixa. O tempo de reação mais longo, por sua vez, facilita a manutenção do pH de reação. O uso de 0 °C também retarda a degradação de polissacarídeos sensíveis ao pH, possibilitando o preparo de conjugados deste tipo de polissacarídeo. As melhorias no protocolo tornam o processo de ativação menos frenético, mais fácil de controlar, mais reproduzível e mais agradável de escalar.
Este artigo descreve o protocolo aprimorado para a realização da ativação cdap controlada de polissacarídeo a 0 °C e em um pH alvo especificado e a realização de derivatização subsequente dos polissacarídeos ativados com ADH. Também é descrito um ensaio de ácido sulfônico trinitrobenzene (TNBS), baseado no método de Qi et al.9, para a determinação do nível de hidrazida no polissacarídeo modificado. Também é descrito um ensaio modificado para hexoses à base de ácido resorcinol e sulfúrico10, que pode ser usado para determinar uma gama mais ampla de polissacarídeos. Para obter mais informações sobre ativação e conjugação do CDAP, o leitor é encaminhado para publicações anteriores5,6,8 por Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Vacinas conjugais são avanços notáveis na vacinação. Para a preparação de vacinas conjugadas de polissacarídeos, os polissacarídeos podem ser convenientemente funcionais e ligados a proteínas portadoras de vacinas usando tetrafluoroborate de 1-ciano-4-dimetilaminopyridina (CDAP), um reagente de cianeto fácil de lidar. O CDAP ativa polissacarídeos reagindo com grupos de hidroxil de carboidratos no pH 7-9. A estabilidade e a reatividade do CDAP são altamente dependentes do pH. O pH da reação também diminui durante a ativação devido à hidrólise do CDAP, o que faz do bom controle de pH a chave para a ativação reprodutível. O protocolo original de ativação do CDAP foi realizado à temperatura ambiente em soluções de pH 9 não oferecidas.
Devido à reação rápida sob esta condição (<3 min) e à queda rápida de pH da hidrólise rápida do CDAP, foi desafiador ajustar-se rapidamente e manter o pH de reação alvo no curto espaço de tempo. O protocolo aprimorado descrito aqui é realizado a 0 °C, o que retarda a hidrólise cdap e amplia o tempo de ativação de 3 min para ~15 min. Dimethylaminopyridina (DMAP) também foi usado como um tampão para pré-ajustar a solução de polissacarídeo ao pH de ativação de destino antes de adicionar o reagente CDAP. O maior tempo de reação, juntamente com a hidrólise CDAP mais lenta e o uso do buffer DMAP, facilita a manutenção do pH de ativação durante toda a duração do processo de ativação. O protocolo melhorado torna o processo de ativação menos frenético, mais reproduzível e mais agradável de escalar.

Para ilustrar a ativação e derivação de um polissacarídeo utilizando química CDAP, o Dextran foi ativado em 0,25 e 0,5 mg CDAP/mg dextran. Para cada reação, foi adicionada uma solução de dextran de 10 mg/mL em água no gelo e adicionado 1/10 de volume de um estoque DMAP de 2,5 M (preparado conforme descrito na seção 3). A solução final foi trazida ao pH 9 pela adição de 0,1 M NaOH em alíquotas de 10 μL. A solução foi refrigerada e agitada, acrescentou o CDAP, e o pH mantido no pH 9 adicionando alíquotas de 10 μL de 0,1 M NaOH por 15 min. Apenas 0,25 mL de 0,5 M ADH no pH 9 foi adicionado (menos do que a quantidade habitual) e a reação permitiu proceder durante a noite a 4 °C.
O dextran rotulado foi então sequencialmente dialisado contra 1 M NaCl, 0,15 M NaCl, e água como descrito na seção 6. O ADH-dextran foi então testado para dextran utilizando o ensaio de ácido resorcinol/sulfúrico (seção 7.2). Uma curva padrão típica usando glicose como padrão de açúcar é mostrada na Figura 4A. O teor de hidrazida foi determinado utilizando-se o ensaio TNBS descrito na seção 7.3. Uma curva padrão típica de hidrazida usando ADH como padrão é dada na Figura 4B.
Cálculos representativos da ativação do Dextran nos dois níveis de ativação são mostrados na Figura 4A,B. Os dados são apresentados tanto como hidrazidas por 100 kDa de polímero dextran quanto como percentual de peso de ADH para dextran, conforme descrito nas seções 7.9.3.4 e 7.9.3.5, respectivamente, na Figura 4C. O grau de derivatização aproximadamente dobrou à medida que a razão CDAP foi dobrada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figura 1: Estrutura química do CDAP. CDAP = 1-ciano-4-dimethylaminopyridina tetrafluoroborate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figura 2: Processo de ativação e conjugação do CDAP. O processo é conceitualmente dividido em duas fases, com o polissacarídeo ativado comum a ambos. Em condições básicas, o CDAP ativa hidróxils de polissacarídeo, liberando DMAP (reação 1). A hidrólise CDAP também libera DMAP (reação 3). Embora um ciano-éster seja mostrado, este pode não ser o intermediário real. O intermediário é, portanto, referido como (CDAP) polissacarídeo "ativado". Durante a primeira fase de ativação, o polissacarídeo ativado pode hidratura (reação 4) ou sofrer reações laterais (reação 5). Na segunda fase de conjugação (reação 2), o polissacarídeo ativado reage com uma amina para formar uma ligação isourea estável, além das reações 4 e 5. Abreviaturas: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimethylaminopyridina; R-NH2 = amina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figura 3: Ativação e conjugação do CDAP. O processo requer o equilíbrio da reatividade do CDAP com o polissacarídeo, a estabilidade do CDAP e o polissacarídeo ativado, bem como a reatividade do polissacarídeo ativado com o da amina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para ativação do CDAP do Dextran. Curvas padrão típicas para o(A) ácido resorcinol/sulfúrico e(B) ensaios TNBS. Os resultados do ensaio para o Dextran ativado com 0,25 e 0,5 mg cdap/mg dextran são mostrados. A glicose foi utilizada como padrão para o ensaio resorcinol. O Dextran, em mg/mL, é dividido por 100 kDa para dar uma concentração molar. A concentração de hidrazida é determinada utilizando a TDAH como padrão e os resultados expressos como μM Hz. (C) Cálculo do hidrazida: razões dextran. O nível de derivatização foi calculado como hidrazídeos por 100 kDa de dextran para facilitar a comparação entre polímeros de diferentes pesos moleculares médios. A razão de peso de g ADH/g dextran foi calculada utilizando-se um MW de 174 g/mole para ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteínas e ligantes contendo amina podem ser covalentemente ligados a polissacarídeos ativados pelo reagente de cianeto, 1-ciano-4-dimethylaminopyrite tetrafluoroborate (CDAP), para formar proteína covalente (ligante)-conjugados de polissacarídeos. Este artigo descreve um protocolo aprimorado para a realização da ativação de CDAP controlado a 0 °C e pH variado e a realização da subsequente conjugação dos polissacarídeos ativados.

Ativação e Conjugação de Polissacarídeos Solúveis usando 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polissacarídeos são pouco imunogênicos, a menos que estejam ligados à proteína e precisem ser ativados para derivação ou conjugação de proteínas. Neste método, o CDAP é usado como reagente de embarque de areia. O CDAP ativa hidróxia de polissacarídeo para derivação ou para ser ligado a proteínas para uso em vacinas ou reagentes diagnósticos.CDAP substituiu em grande parte o brometo de cianogênio como um reagente de polissacarídeo e de embarque. CDAP é mais simples de usar, mais eficiente, e pode ser usado em um pH mais baixo do que brometo de cianogênio. É muito melhor ativar reagente.O CDAP pode ser usado com a maioria dos polissacarídeos, ao contrário do que diz a aminação redutiva, que requer hidroxíxils vicinais. A química pode ser usada para conjugar direta e indiretamente proteínas, e pode ser usada para fazer reagentes diagnósticos. A reação de ativação do CDAP, como descrito originalmente, foi muito rápida e difícil de controlar.O protocolo aqui fornecido torna a química muito mais fácil de executar e muito mais reproduzível. Antes de iniciar o experimento, ajuste o pH da solução de polissacarídeo para 9 adicionando 200 microliters de solução de estoque de dimetilaaminopyridina de forma dropwise enquanto mexe. Mantenha a reação resfriada em um banho de água gelada durante todo o processo de ativação.Prossiga com a ativação ciano-dimetilaminopyridina-tetrafluoroborate ou CDAP transferindo 100 microliters de CDAP para a solução de polissacarídeo durante a agitação. Inicie o temporizador e monitore a troca de pH durante toda a ativação por 15 minutos. Mantenha a reação no pH alvo adicionando prontamente incrementos de 10 microliteres de hidróxido de sódio molar de 0,1 molar.Quando o tempo ideal de ativação for atingido, adicione dois mililitros de dihidrazida álpica molar de 0,5 de uma só vez ao polissacarídeo ativado. Verifique se o pH está na faixa necessária para a funcionalização do hidróxido. Após a agitação contínua da mistura de reação por pelo menos uma hora, transfira a mistura de reação para quatro graus Celsius.Para reduzir a concentração de ADH do produto, dilize a solução de polissacarídeo derivatizado bruto usando o dispositivo de diálise. Recupere o polissacarídeo derivatizado da diálise e determine a concentração dos polissacarídeos e hidrazida para calcular a razão hidrazida e polissacarida. Prepare uma solução de polissacarídeo não modificada por mililitro para ser usada como padrão.Pré-aqueça o bloco de aquecimento a 140 graus Celsius por um mínimo de uma hora para alcançar uma temperatura uniforme estável. Use uma almofada protetora por baixo e ao redor do bloco de aquecimento em caso de derramamento de ácido. Adicione volumes variados de um miligrama por mililitro padrão de carboidratos ao rotulado 13 por 100 tubos de ensaio borossilicato em triplicados e compense o volume de 100 microlitres com água para alcançar as concentrações padrão desejadas.Da mesma forma, configure ensaios amostrais adicionando um volume contendo cinco microgramas do polissacarídeo derivatizado a três tubos de amostra. Adicione 100 microliters de seis miligramas recém-preparados por resorcinol mililitro em cada tubo. Usando uma pipeta repetição, adicione 300 microliters do ácido 75% sulfúrico preparado a cada tubo, vórtice dos tubos vigorosamente, apontando o tubo para longe, em seguida, coloque todos os tubos em um bloco de aquecedor em um ritmo constante em ordem sequencial e imediatamente defina o temporizador por três minutos.Em três minutos, remova os tubos na mesma ordem e coloque-os diretamente em um rack em um banho de água gelada. Remova os tubos frios de gelo para permitir que eles se equilibrem à temperatura ambiente por cinco minutos. Leia a absorvência de todos os tubos em um espectrofotômetro UV-Vis a 430 nanômetros usando um cuvette de comprimento de caminho de 10 milímetros.Para configurar as reações de ensaio, classifique e organize os tubos padrão rotulados no rack do tubo, em ordem de maior concentração. Usando uma micropipette calibrada, adicione 100 microliters dos padrões a cada tubo correspondente. Para o padrão zero, use 100 microliters do buffer amostral.Da mesma forma, prepare e organize os tubos de amostra. Em seguida, usando um micropipette calibrado de 1.000 microliter, adicione 875 microliters de tampão de ensaio a todos os tubos de ensaio. Para iniciar a reação do ensaio, adicione 25 microliters de ácido sulfônico de 1%trinitrobenzene a cada tubo de ensaio na ordem pré-determinada dentro de cinco minutos.Vórtice os tubos de ensaio por dois segundos em alta velocidade, certificando-se de que o líquido gira a uma altura de meia polegada de abertura do tubo. Regisso tempo de início do ensaio e defina o temporizador para duas horas. Em seguida, coloque o rack do tubo de ensaio no escuro à temperatura ambiente por duas horas.Quando o tempo acabar, vórtice os tubos e proceder à coleta de dados. O dextran ADH foi testado para dextran utilizando o ensaio de ácido sulfúrico resorcinol. Um tubo padrão típico usando glicose como padrão de açúcar foi plotado.O teor de hidrazida em polissacarídeo ou dextran derivatizado foi determinado utilizando o ensaio TNBS. O nível de derivatização foi calculado como hidretos por 100 kilodaltons de dextran para facilitar a comparação entre polímeros de diferentes pesos moleculares médios. O protocolo descrito aqui pode precisar ser adaptado para um polissacarídeo específico.A química CDAP pode ser usada para funcionalizar polissacarídeos para uso com uma grande variedade de reagentes de conjugação. Pode ser usado, por exemplo, para biotinilar polissacarídeos para uso em ELISAs. As proteínas podem estar diretamente ligadas a polissacarídeos ativados pelo CDAP, mas isso geralmente requer alguma otimização para um polissacarídeo específico.O rendimento da conjugação pode ser superior a 75% O uso da química CDAP permitiu vacinas conjugadas de baixo custo, como as feitas, por exemplo, pelo Instituto Soro da Índia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...