Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Работа, описанная здесь, финансировалась компанией Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Эндрю Лис является основателем и владельцем Fina Biosolutions. Он имеет несколько патентов, связанных с химией CDAP, и получает выгоду от лицензирования ноу-хау в области химии и конъюгации CDAP.

CDAP является удобным реагентом для дериватизации и конъюгированных полисахаридов. В этой статье описывается общий метод использования CDAP для дериватизации полисахаридов с гидразидами (PS-ADH) и включены недавно опубликованные улучшения8. Во-первых, методика подчеркивает важность поддержания целевого рН для контроля процесса активации. Мы обнаружили, что, хотя многие распространенные буферы мешают реакции активации CDAP, DMAP может быть успешно использован в качестве буфера для управления pH8. Кроме того, DMAP уже является побочным продуктом реакции активации CDAP. Наконец, буферизация раствора полисахарида с помощью DMAP перед добавлением CDAP облегчает точное нацеливание и поддержание рН реакции. Как мы описываем, полезно регулировать рН концентрированного раствора DMAP таким образом, чтобы при разбавления он достиг целевого рН. Во-вторых, выполнение процесса на холоде замедляло время реакции, делая процесс активации менее неистовым и более снисходительным. Более низкая температура снижает скорость гидролиза CDAP, а оптимальное время активации при рН 9 увеличивается с ~3 мин до ~15 мин. Кроме того, для достижения того же уровня активации требуется меньше CDAP, чем при комнатной температуре. 
ADH-дериватизированные полисахариды могут быть конъюгированы с белками с использованием карбодиимидов (например, EDAC)7. Например, несколько лицензированных вакцин Haemophilus influenzae b (Hib) используют полирибозилрибитолфосфат (PRP), производный с АДГ, для конъюгироваться со столбнячному токсину с использованием EDAC. Первоначально использовался CNBr, но CDAP является гораздо более простым реагентом для этой цели. По нашему опыту, хороший целевой диапазон для дериватизации АДГ составляет 10-30 гидразидов на полисахарид 100 кДа или ~1-3% АДГ по весу. 
Этот же процесс может быть использован для дериватизации полисахаридов первичными аминами путем замены диамина АДГ. Рекомендуется использовать гександиамин для дериватизации полисахаридов с аминами8. Аминированный полисахарид (PS-NH2)может быть конъюгирован с использованием реагентов, разработанных для конъюгации белка11. Как правило,PS-NH2 дериватизируют с помощью малеимида (например, сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) или N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимидного эфира (GMBS)), а белок тиолируют (например, сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатом (SPDP)). Химия тиол-малеимида очень эффективна.
Белки также могут быть напрямую связаны с CDAP-активированными полисахаридами через ɛ-амин на лизинах. Хотя используемый протокол активации в целом аналогичен описанной здесь, необходимо оптимизировать уровень активации, концентрацию полисахарида и белка, а также соотношение белка к полисахариду5,6,8.
Декстран является одним из самых простых полисахаридов для активации с помощью CDAP из-за его относительно высокой плотности гидроксильных групп, но некоторые полисахариды, такие как антиген Vi, могут быть сложными. Следовательно, не существует единого «лучшего» протокола для конъюгации CDAP непосредственно с белками. Мы предлагаем сначала разработать протокол для достижения подходящих уровней активации, определяемых степенью дериватизации гидразида, а затем перейти к прямой конъюгации белка с CDAP-активированным полисахаридом.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Конъюгированные вакцины, такие как те, которые состоят из полисахаридов, ковалентно связанных с белком-носителем, являются одними из замечательных достижений в вакцинологии1,2. Полисахариды, как Т-клеточные независимые антигены, плохо иммуногенны у младенцев и не вызывают памяти, переключения классов или аффинного созревания антител3. Эти недостатки преодолены в полисахаридных конъюгированных вакцинах4. Поскольку большинство полисахаридов не имеют удобной химической ручки для конъюгации, их сначала необходимо сделать реакционноспособными или «активированными». Активированный полисахарид затем связывают либо непосредственно с белком (или модифицированным белком), либо функционализируют для дополнительной дериватизации перед конъюгацией4. Большинство лицензированных полисахаридных конъюгированных вакцин используют либо восстановительное аминирование, либо цианилирование для активации гидроксилов полисахарида. Цианогенбромид (CNBr), реагент, который ранее использовался для активации хроматографических смол, первоначально использовался для дериватизации полисахаридов. Однако CNBr требует высокого рН, обычно ~ рН 10,5 или выше, чтобы частично депротонировать гидроксилы полисахарида, чтобы они были достаточно нуклеофильными для атаки цианогруппы. Высокий рН может быть вредным для базово-лабильных полисахаридов, и ни CNBr, ни первоначально сформированный активный циано-эфир не являются достаточно стабильными при таком высоком рН.
CDAP (1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторборат; Рисунок 1) был введен Lees et al. для использования в качестве цианилирующего агента для активации полисахаридов5,6. Было обнаружено, что CDAP, который является кристаллическим и простым в обращении, активирует полисахариды при более низком рН, чем CNBr, и с меньшим количеством побочных реакций. В отличие от CNBr, CDAP-активированные полисахариды могут быть непосредственно конъюгированы с белками, упрощая процесс синтеза. CDAP-активированные полисахариды могут быть функционализированы диамином (например, гексановым диамином) или дигидразидом (например, адипиковым дигидразидом, АДГ) для получения амино- или гидразид-дериватизированных полисахаридов. Высокая концентрация гомобифункционального реагента используется для подавления сшивания полисахаридов. Затем аминополисахариды могут быть конъюгированы с использованием любого из множества методов, используемых для конъюгации белка. Гидразид-дериватизированные полисахариды часто связаны с белками с использованием карбодиимидного реагента (например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC))7. Дальнейшая оптимизация активации полисахарида CDAP была описана Lees et al.8 и включена в протокол, описанный здесь.
Обзор сопряжения CDAP Протокол CDAP может быть концептуализирован как две фазы: (1) активация полисахарида и (2) конъюгация активированного полисахарида с белком или лигандом(фиг.2). Целью первого шага является эффективная активация полисахарида, в то время как цель второго - эффективное сопряжение с активированным полисахаридом. Активированный полисахарид связывает два этапа вместе. Эта концептуализация помогает сосредоточиться на критических элементах каждого шага. Рисунок 2 расширяет эту концептуализацию, показывая желаемые реакции активации и связи, а также реакции гидролиза и побочные реакции.
Во время фазы активации тремя основными проблемами являются стабильность CDAP, реакция CDAP с гидроксилами полисахарида и стабильность активированного полисахарида(рисунок 3). Гидролиз CDAP увеличивается с рН, как и гидролиз активированного полисахарида и побочные реакции. Однако реакция CDAP с полисахаридом облегчается повышением рН. Эффективная активация полисахаридов с помощью CDAP требует баланса между 1) реакционной способностью полисахарида и CDAP и 2) гидролизом и побочными реакциями как реагента, так и активированного полисахарида.
В оригинальном протоколе активации CDAP, описанном Lees et al.5,CDAP-активацию полисахаридов проводили при комнатной температуре в небуферируемом растворе рН 9. При этом условии было обнаружено, что скорость активации является быстрой, и активация будет завершена в течение 3 минут. Реакция также сопровождалась быстрым гидролизом CDAP, вызывая быстрое падение рН небуферистого реакционного раствора. Было сложно быстро повысить и поддерживать реакционный рН на целевом значении в такие короткие сроки. В описанном протоколе активацию осуществляли путем добавления CDAP из 100 мг/мл запасного раствора к небуферизованным раствором полисахарида. рН был повышен через 30 с при «равном объеме 0,2 М триэтиламина». Затем через 2,5 мин к реакции активации добавляли белок, который нужно было конъюгировать. Примечательно, что рН этапа активации не контролировался хорошо и, скорее всего, первоначально превышал целевой рН. Быстрая реакция, требующая быстрой регулировки pH, затруднял контроль процесса активации и затруднял масштабирование.
В отличие от оригинального протокола, модифицированный протокол, описанный здесь, имеет два основных улучшения. Во-первых, pH раствора полисахарида предварительно настраивается на целевой активационный pH, используя DMAP в качестве буфера, перед добавлением CDAP. DMAP имеет pKa 9,5 и, таким образом, имеет хорошую буферную мощность около pH 9, и в отличие от многих других буферов, DMAP не был обнаружен для содействия гидролизу CDAP8. Кроме того, DMAP уже является промежуточным продуктом процесса и, следовательно, не добавляет новый компонент в реакционную смесь. Предварительная регулировка pH перед добавлением CDAP устраняет большие колебания pH в начале реакции и позволяет более эффективно сохранять целевой pH во время реакции. Второе улучшение заключается в выполнении реакции активации при 0 °C, где скорость гидролиза CDAP заметно медленнее, чем при комнатной температуре. При более длительном периоде полувыполнеки реагента при 0 °C время активации увеличивается с 3 мин до 15 мин, чтобы компенсировать более медленную скорость активации при более низкой температуре. Более длительное время реакции, в свою очередь, облегчает поддержание рН реакции. Применение 0 °C также замедляет деградацию pH-чувствительных полисахаридов, что позволяет готовить конъюгаты этого типа полисахарида. Улучшения в протоколе делают процесс активации менее неистовым, более простым в управлении, более воспроизводимым и более поддающимся масштабированию.
В данной статье описан усовершенствованный протокол для проведения контролируемой CDAP-активации полисахарида при 0 °C и при заданном целевом рН и выполнения последующей дериватизации активированных полисахаридов АДГ. Также описан анализ тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS), основанный на методе Qi et al.9,для определения уровня гидразида на модифицированном полисахариде. Также описан модифицированный анализ гексосов на основе резорцина и серной кислоты10, который может быть использован для определения более широкого спектра полисахаридов. Для получения дополнительной информации об активации и сопряжении CDAP читатель обращается к более ранним публикациям5,6,8 Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Конъюгированные вакцины являются замечательными достижениями в вакцинологии. Для приготовления полисахаридных конъюгированных вакцин полисахариды могут быть удобно функционализированы и связаны с белками-носителями вакцин с использованием 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторбората (CDAP), простого в обращении цианилирующего реагента. CDAP активирует полисахариды, реагируя с гидроксильными группами углеводов при рН 7-9. Стабильность и реакционная способность CDAP сильно зависят от pH. pH реакции также снижается во время активации из-за гидролиза CDAP, что делает хороший контроль pH ключом к воспроизводимой активации. Оригинальный протокол активации CDAP выполняли при комнатной температуре в небуферизованных растворах рН 9.
Из-за быстрой реакции в этом состоянии (<3 мин) и сопровождающего ее быстрого падения рН от быстрого гидролиза CDAP было сложно быстро отрегулировать и поддерживать целевой рН реакции в короткие сроки. Улучшенный протокол, описанный здесь, выполняется при 0 °C, что замедляет гидролиз CDAP и увеличивает время активации с 3 мин до ~15 мин. Диметиламинопиридин (DMAP) также использовали в качестве буфера для предварительной корректировки раствора полисахарида к целевому активации рН перед добавлением реагента CDAP. Более длительное время реакции в сочетании с более медленным гидролизом CDAP и использованием буфера DMAP облегчает поддержание рН активации в течение всего процесса активации. Улучшенный протокол делает процесс активации менее неистовым, более воспроизводимым и более поддающимся масштабированию.

Чтобы проиллюстрировать активацию и дериватизацию полисахарида с использованием химии CDAP, декстран активировали при 0,25 и 0,5 мг CDAP/мг декстрана. Для каждой реакции на льду охлаждали раствор декстрана 10 мг/мл в воде и добавляли1/10-й объем запаса DMAP 2,5 М (приготовленного, как описано в разделе 3). Конечный раствор доводили до рН 9 путем добавления 0,1 М NaOH в 10 мкл аликвот. Раствор охлаждали и перемешивали, добавляли CDAP, а рН поддерживали на уровне рН 9 путем добавления 10 мкл аликвот 0,1 М NaOH в течение 15 мин. Добавляли только 0,25 мл 0,5 М АДГ при рН 9 (меньше обычного количества) и реакцию позволяли продолжать в течение ночи при 4°С.
Затем меченый декстран последовательно диализировали против 1 M NaCl, 0,15 M NaCl и воды, как описано в разделе 6. Затем АДГ-декстран был проана на декстран с использованием анализа резорцина/серной кислоты (раздел 7.2). Типичная стандартная кривая, использующая глюкозу в качестве стандарта сахара, показана на рисунке 4А. Содержание гидразида определяли с помощью анализа TNBS, описанного в разделе 7.3. Типичная гидразидная стандартная кривая, использующая АДГ в качестве стандарта, приведена на рисунке 4B.
Репрезентативные расчеты из активации декстрана на двух уровнях активации показаны на рисунке 4A,B. Данные представлены как в виде гидразидов на 100 кДа декстран-полимера, так и в виде весового процента АДГ к декстрану, как описано в разделах 7.9.3.4 и 7.9.3.5, соответственно, на рисунке 4C. Степень дериватизации приблизительно удвоилась по мере удвоения коэффициента CDAP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Рисунок 1:Химическая структура CDAP. CDAP = 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторборат. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Рисунок 2:Процесс активации и сопряжения CDAP. Процесс концептуально разделен на две фазы, причем активированный полисахарид является общим для обоих. В основных условиях CDAP активирует гидроксилы полисахарида, высвобождая DMAP (реакция 1). Гидролиз CDAP также высвобождает DMAP (реакция 3). Хотя показан циано-эфир, это может не быть фактическим промежуточным продуктом. Промежуточный продукт, таким образом, называется (CDAP) «активированным» полисахаридом. Во время первой фазы активации активированный полисахарид может гидролизоваться (реакция 4) или подвергаться побочным реакциям (реакция 5). Во второй фазе конъюгации (реакция 2) активированный полисахарид реагирует с амином с образованием стабильной связи измощевинения в дополнение к реакциям 4 и 5. Сокращения: CDAP = 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторборат; DMAP = 4-диметиламинопиридин; R-NH2 = амин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Рисунок 3:Активация и сопряжение CDAP. Процесс требует балансировки реакционной способности CDAP с полисахаридом, стабильности CDAP и активированного полисахарида, а также реакционной способности активированного полисахарида с реакцией амина. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Рисунок 4:Репрезентативные результаты для CDAP активации декстрана. Типичные стандартные кривые для анализов(A)резорцина/серной кислоты и(B)TNBS. Показаны результаты анализа декстрана, активированного 0,25 и 0,5 мг CDAP/мг декстрана. Глюкоза использовалась в качестве стандарта для анализа резорцина. Декстран в мг/мл делится на 100 кДа для получения молярной концентрации. Концентрацию гидразида определяют с использованием АДГ в качестве стандарта, а результаты выражают в виде мкМ Гц.(C)Расчет соотношения гидразида: декстрана. Уровень дериватизации рассчитывали как гидразиды на 100 кДа декстрана для облегчения сравнения полимеров с различной средней молекулярной массой. Весовое соотношение г АДГ/г декстрана было рассчитано с использованием МВт 174 г/моль для АДГ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Белки и аминосодержащие лиганды могут быть ковалентно связаны с полисахаридами, активированными реагентом цианирования, 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторборатом (CDAP), с образованием ковалентного белка (лиганда)-полисахаридных конъюгатов. В данной статье описан усовершенствованный протокол для проведения контролируемой активации CDAP при 0 °C и изменении рН и выполнения последующей конъюгации активированных полисахаридов.

Активация и конъюгация растворимых полисахаридов с использованием 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторбората (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Полисахариды плохо иммуногенны, если они не связаны с белком и должны быть активированы для дериватизации или конъюгации с белками. В этом методе CDAP используется в качестве песчаного коносаментного реагента. CDAP активирует гидроксилы полисахарида для дериватизации или для связывания с белками для использования в вакцинах или диагностических реагентах.CDAP в значительной степени заменил цианобромид в качестве полисахаридного песчаного реагента. CDAP проще в использовании, более эффективен и может использоваться при более низком рН, чем бромид циана. Это гораздо лучший активирующий реагент.CDAP можно использовать с большинством полисахаридов, в отличие, скажем, от восстановительного аминирования, которое требует вицинальных гидроксилов. Химия может быть использована как для прямого, так и косвенного конъюгировать с белками, и она может быть использована для изготовления диагностических реагентов. Реакция активации CDAP, как первоначально описано, была очень быстрой и трудной для контроля.Протокол, представленный здесь, делает химию намного проще в выполнении и гораздо более воспроизводимой. Перед началом эксперимента отрегулируйте рН раствора полисахарида до 9, добавив 200 микролитров раствора диметиламинопиридина по каплям при перемешивании. Держите реакцию охлажденной на ледяной водяной бане в течение всего процесса активации.Продолжают с активацией циано-диметиламинопиридина-тетрафторбората или CDAP путем переноса 100 микролитров CDAP в раствор полисахарида при перемешивании. Запустите таймер и следите за изменением pH в течение всей активации в течение 15 минут. Поддерживают реакцию при целевом рН путем быстрого добавления 10 микролитровых приращений 0,1 молярного гидроксида натрия.Когда оптимальное время активации достигнуто, добавьте два миллилитра 0,5 молярного адигидразида одновременно к активированному полисахариду. Убедитесь, что рН находится в требуемом диапазоне для функционализации гидроксида. После непрерывного перемешивания реакционной смеси в течение, по меньшей мере, одного часа, перенесите реакционную смесь до четырех градусов Цельсия.Чтобы снизить концентрацию АДГ в продукте, диализуйте сырой производный раствор полисахарида с помощью диализного устройства. Извлеките производный полисахарид из диализа и определите концентрацию полисахаридов и гидразида для расчета соотношения гидразида к полисахариду. Готовят один миллиграмм на миллилитр немодифицированного раствора полисахарида для использования в качестве стандарта.Разогрейте нагревательный блок до 140 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа для достижения стабильной равномерной температуры. Используйте защитную прокладку под и вокруг нагревательного блока в случае разливов кислоты. Добавьте различные объемы в один миллиграмм на миллилитр стандартного углевода к маркированным пробиркам 13 на 100 боросиликатов в трехличных и составьте объем до 100 микролитров с водой для достижения желаемых стандартных концентраций.Аналогичным образом, настройте пробные анализы, добавив объем, содержащий пять микрограммов дериватизированного полисахарида, в три пробирки для образцов. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленных шести миллиграммов на миллилитр резорцина в каждый тюбик. Используя повторную трубку, добавьте 300 микролитров приготовленной 75% серной кислоты в каждую трубку, энергично вихрьте трубки, направив трубку в сторону, затем поместите все трубки в блок нагревателя в устойчивом темпе в последовательном порядке и немедленно установите таймер на три минуты.Через три минуты снимите трубки в том же порядке и поместите их непосредственно в стойку на водяной бане. Снимите ледяные трубки, чтобы они уравновешивали до комнатной температуры в течение пяти минут. Считывание поглощения всех трубок на спектрофотометре UV-Vis на 430 нанометров с использованием кюветы длиной 10 миллиметров.Чтобы настроить реакции анализа, отсортируйте и расположите помеченные стандартные трубки в трубной стойке в порядке увеличения концентрации. Используя калиброванную микропипетку, добавьте 100 микролитров эталонов в каждую соответствующую трубку. Для нулевого стандарта используйте 100 микролитров буфера образца.Аналогичным образом, подготовьте и расположите пробирки для образцов. Затем, используя калиброванную микропипетку 1000 микролитров, добавьте 875 микролитров буфера анализа во все пробирки. Чтобы начать реакцию анализа, в течение пяти минут добавляют 25 микролитров 1% тринитробензоловой сульфоновой кислоты в каждую пробирную трубку в заданном порядке.Вращайтесь в пробирных трубках в течение двух секунд на высокой скорости, следя за тем, чтобы жидкость закручивалась на высоту полдюйма от отверстия трубки. Запишите время начала анализа и установите таймер на два часа. Затем поместите стойку для пробирки в темное время суток при комнатной температуре на два часа.Когда время закончится, вихрь трубок и приступайте к сбору данных. Декстран АДГ был проана на декстран с использованием анализа серной кислоты резорцинола. Была построена типичная стандартная трубка, использующая глюкозу в качестве стандарта сахара.Содержание гидразида в дериватизированном полисахариде или декстране определяли с помощью анализа TNBS. Уровень дериватизации рассчитывали как гидриды на 100 килодалтон декстрана для облегчения сравнения полимеров с различной средней молекулярной массой. Протокол, описанный здесь, возможно, потребуется адаптировать для конкретного полисахарида.Химия CDAP может быть использована для функционализации полисахаридов для использования с широким спектром конъюгационных реагентов. Его можно использовать, например, для биотинилата полисахаридов для использования в ИФА. Белки могут быть напрямую связаны с CDAP-активированными полисахаридами, но это обычно требует некоторой оптимизации для конкретного полисахарида.Выход конъюгации может составлять более 75% Использование химии CDAP позволило создать недорогие конъюгированные вакцины, подобные тем, которые производятся, например, Институтом сыворотки Индии.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Обнаружение Neu1 сиалидазы активность в регулировании Toll-подобных рецепторов активации

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Бесклеточной системе Пробирной Оценка нейтрализующей способности ГМ-КСФ антител с использованием рекомбинантных растворимых ГМ-КСФ рецептор

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Активация базофилов Тест для исследования IgE-опосредованной механизмов в наркотиках Гиперчувствительность

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Выделение и активация мышиных лимфоцитах

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...