Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

El trabajo descrito aquí fue financiado por Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees es fundador y propietario de Fina Biosolutions. Posee varias patentes relacionadas con la química CDAP y se beneficia de la licencia de los conocimientos de química y conjugación CDAP.

CDAP es un reactivo conveniente para derivar y conjugar polisacáridos. Este artículo describe el método general para utilizar CDAP para derivar los polisacáridos con hidrazidas (PS-ADH) e incorpora mejoras publicadas recientemente8. En primer lugar, la técnica enfatiza la importancia de mantener el pH objetivo para controlar el proceso de activación. Encontramos que si bien muchos búferes comunes interfieren con la reacción de activación de CDAP, DMAP podría usarse con éxito como búfer para administrar el pH8. Además, DMAP ya es un subproducto de reacción de la activación de CDAP. Finalmente, el almacenamiento en búfer de la solución de polisacáridos con DMAP antes de agregar el CDAP facilita la orientación precisa y el mantenimiento del pH de reacción. Como describimos, es útil ajustar el pH de la solución de stock DMAP concentrada de tal manera que cuando se diluya, alcance el pH objetivo. En segundo lugar, realizar el proceso en frío ralentizó el tiempo de reacción, haciendo que el proceso de activación fuera menos frenético y más indulgente. La temperatura más baja disminuyó la tasa de hidrólisis de CDAP, y el tiempo óptimo de activación a pH 9 aumenta de ~ 3 min a ~ 15 min. Además, se requiere menos CDAP para lograr el mismo nivel de activación que cuando se realiza a temperatura ambiente. 
Los polisacáridos derivados de ADH se pueden conjugar con proteínas utilizando carbodiimidas (por ejemplo, EDAC)7. Por ejemplo, varias vacunas autorizadas contra Haemophilus influenzae b (Hib) utilizan el polirribosilribitolfosfato (PRP) derivado con ADH para conjugar con toxoide tetánico utilizando EDAC. CNBr se empleó inicialmente, pero CDAP es un reactivo mucho más fácil de usar para este propósito. En nuestra experiencia, un buen rango objetivo para la derivatización de ADH es 10-30 hidrazidas por polisacárido de 100 kDa o ~ 1-3% de ADH en peso. 
El mismo proceso se puede utilizar para derivar polisacáridos con aminas primarias sustituyendo la ADH por una diamina. Se recomienda utilizar hexano diamina para derivar polisacáridos con aminas8. El polisacárido nominado (PS-NH2)puede ser conjugado utilizando reactivos desarrollados para la conjugación de proteínas11. Típicamente, el PS-NH2 se deriva con una maleimida (por ejemplo, succinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) o N-γ-maleimidobutiril-éster de oxisuccinimida (GMBS)), y la proteína es tiolada (por ejemplo, con succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP)). La química tiol-maleimida es muy eficiente.
Las proteínas también se pueden acoplar directamente a los polisacáridos activados por CDAP a través de la ɛ-amina en las lisinas. Si bien el protocolo de activación utilizado es generalmente similar al descrito aquí, es necesario optimizar el nivel de activación, la concentración de polisacáridos y proteínas, así como la relación proteína:polisacárido5,6,8.
El dextrano es uno de los polisacáridos más fáciles de activar con CDAP debido a su densidad relativamente alta de grupos hidroxilo, pero algunos polisacáridos, como el antígeno Vi, pueden ser un desafío. En consecuencia, no existe un único "mejor" protocolo para la conjugación cdAP directamente a las proteínas. Sugerimos primero desarrollar un protocolo para lograr niveles adecuados de activación, según lo determinado por el grado de derivatización de la hidrazida, y luego proceder a la conjugación directa de proteínas al polisacárido activado por CDAP.

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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Las vacunas conjugadas, como las que consisten en polisacáridos unidos covalentemente a una proteína portadora, se encuentran entre los notables avances en vacunología1,2. Los polisacáridos, como antígenos independientes de las células T, son poco inmunogénicos en los lactantes y no inducen memoria, cambio de clase o maduración de afinidad de anticuerpos3. Estas deficiencias se superan en las vacunas conjugadas con polisacáridos4. Como la mayoría de los polisacáridos no tienen un mango químico conveniente para la conjugación, primero deben hacerse reactivos o "activados". El polisacárido activado se une directamente con la proteína (o proteína modificada) o se funcionaliza para una derivatización adicional antes de la conjugación4. La mayoría de las vacunas conjugadas con polisacáridos autorizadas utilizan aminación reductora o cianilación para activar los hidroxilos polisacáridos. El bromuro de cianógeno (CNBr), un reactivo que se había utilizado previamente para activar resinas de cromatografía, se utilizó inicialmente para la derivatización de polisacáridos. Sin embargo, CNBr requiere un pH alto, típicamente ~ pH 10.5 o mayor, para desprotonar parcialmente los hidroxilos polisacáridos para que sean lo suficientemente nucleófilos como para atacar al grupo ciano. El pH alto puede ser perjudicial para los polisacáridos lábiles de base, y ni el CNBr ni el cianoéster activo formado inicialmente son lo suficientemente estables a un pH tan alto.
CDAP (1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato; Figura 1) fue introducido por Lees et al. para su uso como agente cianilante para la activación de polisacáridos5,6. Se encontró que CDAP, que es cristalino y fácil de manejar, activa los polisacáridos a un pH más bajo que el CNBr y con menos reacciones secundarias. A diferencia de CNBr, los polisacáridos activados por CDAP se pueden conjugar directamente con proteínas, simplificando el proceso de síntesis. Los polisacáridos activados por CDAP se pueden funcionalizar con una diamina (por ejemplo, diamina hexano) o una dihidrazida (por ejemplo, dihidrazida adípica, ADH) para fabricar polisacáridos derivados de aminoácidos o hidrazidas. Se utiliza una alta concentración del reactivo homobifuncional para suprimir la reticulación de polisacáridos. Los polisacáridos amino se pueden conjugar utilizando cualquiera de las innumerables técnicas utilizadas para la conjugación de proteínas. Los polisacáridos derivados de hidrazidas a menudo se acoplan a proteínas utilizando un reactivo de carbodiimida (por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC))7. La optimización adicional de la activación de polisacáridos CDAP ha sido descrita por Lees et al.8 y se incorpora al protocolo descrito aquí.
Descripción general de la conjugación CDAP El protocolo CDAP se puede conceptualizar como dos fases: (1) la activación del polisacárido y (2) la conjugación del polisacárido activado con una proteína o ligando (Figura 2). El objetivo del primer paso es activar eficientemente el polisacárido, mientras que el objetivo del segundo es conjugar eficientemente con el polisacárido activado. El polisacárido activado une los dos pasos. Esta conceptualización ayuda a centrarse en los elementos críticos de cada paso. La Figura 2 amplía esta conceptualización, mostrando las reacciones de activación y acoplamiento deseadas, junto con las reacciones de hidrólisis y las reacciones secundarias.
Durante la fase de activación, las tres principales preocupaciones son la estabilidad del CDAP, la reacción del CDAP con los hidroxilos polisacáridos y la estabilidad del polisacárido activado(Figura 3). La hidrólisis cdAP aumenta con el pH, al igual que la hidrólisis del polisacárido activado y las reacciones secundarias. Sin embargo, la reacción CDAP con el polisacárido se facilita al aumentar el pH. La activación eficiente de polisacáridos con CDAP requiere un equilibrio entre 1) la reactividad del polisacárido y CDAP y 2) la hidrólisis y las reacciones secundarias tanto del reactivo como del polisacárido activado.
En el protocolo de activación cdAP original descrito por Lees et al.5,la activación CDAP de polisacáridos se llevó a cabo a temperatura ambiente en solución de pH 9 sin búfer. Se encontró que la tasa de activación era rápida bajo esta condición, y la activación se completaría en 3 minutos. La reacción también se acompañó de una hidrólisis rápida de CDAP, causando una rápida caída del pH de la solución de reacción sin búfer. Fue un desafío elevar rápidamente y mantener el pH de reacción en el valor objetivo en un período de tiempo tan corto. En el protocolo descrito, la activación se realizó mediante la adición de CDAP de una solución de stock de 100 mg/ml a la solución de polisacáridos sin búfer. El pH se elevó 30 s más tarde con "un volumen igual de 0,2 M de trietilamina". La proteína a conjugar se agregó después de 2,5 min a la reacción de activación. En particular, el pH del paso de activación no estaba bien controlado y lo más probable es que inicialmente excediera el pH objetivo. La reacción rápida que requería un ajuste rápido del pH hizo que el proceso de activación fuera difícil de controlar y difícil de escalar.
A diferencia del protocolo original, el protocolo modificado descrito aquí tiene dos mejoras importantes. En primer lugar, el pH de la solución de polisacáridos se ajusta previamente al pH de activación objetivo, utilizando DMAP como tampón, antes de la adición de CDAP. DMAP tiene un pKa de 9.5 y, por lo tanto, tiene un buen poder de amortiguación alrededor del pH 9, y a diferencia de muchos otros tampones, no se encontró que DMAP promueva la hidrólisis cdAP8. Además, DMAP ya es un proceso intermedio y, por lo tanto, no agrega un nuevo componente a la mezcla de reacción. El ajuste previo del pH antes de agregar CDAP elimina la gran oscilación del pH al comienzo de la reacción y permite un mantenimiento más eficiente del pH objetivo durante la reacción. La segunda mejora es realizar la reacción de activación a 0 °C, donde la tasa de hidrólisis cdAP es marcadamente más lenta que la de temperatura ambiente. Con la vida media del reactivo más larga a 0 °C, el tiempo de activación se incrementa de 3 min a 15 min para compensar la tasa de activación más lenta a la temperatura más baja. El mayor tiempo de reacción, a su vez, hace que sea más fácil mantener el pH de reacción. El uso de 0 °C también ralentiza la degradación de los polisacáridos sensibles al pH, lo que permite preparar conjugados de este tipo de polisacáridos. Las mejoras en el protocolo hacen que el proceso de activación sea menos frenético, más fácil de controlar, más reproducible y más susceptible de escalar.
Este artículo describe el protocolo mejorado para llevar a cabo la activación controlada cdAP del polisacárido a 0 °C y a un pH objetivo especificado y realizar la derivatización posterior de los polisacáridos activados con ADH. También se describe un ensayo de ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS), basado en el método de Qi et al.9,para la determinación del nivel de hidrazida en el polisacárido modificado. También se describe un ensayo modificado para hexosas basado en resorcinol y ácido sulfúrico10, que se puede utilizar para determinar una gama más amplia de polisacáridos. Para obtener más información sobre la activación y conjugación de CDAP, se remite al lector a las publicaciones anteriores5,6,8 de Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Las vacunas conjugadas son avances notables en vacunología. Para la preparación de vacunas conjugadas de polisacáridos, los polisacáridos se pueden funcionalizar convenientemente y vincularse a proteínas portadoras de vacunas utilizando tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP), un reactivo cianilante fácil de manejar. CDAP activa los polisacáridos reaccionando con los grupos hidroxilo de carbohidratos a pH 7-9. La estabilidad y la reactividad de CDAP son altamente dependientes del pH. El pH de la reacción también disminuye durante la activación debido a la hidrólisis de CDAP, lo que hace que un buen control del pH sea la clave para la activación reproducible. El protocolo de activación original de CDAP se realizó a temperatura ambiente en soluciones de pH 9 sin búfer.
Debido a la rápida reacción bajo esta condición (<3 min) y la rápida caída de pH que la acompaña de la hidrólisis rápida de CDAP, fue difícil ajustar y mantener rápidamente el pH de reacción objetivo en el corto período de tiempo. El protocolo mejorado descrito aquí se realiza a 0 °C, lo que ralentiza la hidrólisis de CDAP y extiende el tiempo de activación de 3 min a ~15 min. La dimetilaminopiridina (DMAP) también se utilizó como tampón para preajustar la solución de polisacáridos al pH de activación objetivo antes de agregar el reactivo CDAP. El mayor tiempo de reacción, junto con la hidrólisis CDAP más lenta y el uso de tampón DMAP, facilita el mantenimiento del pH de activación durante todo el proceso de activación. El protocolo mejorado hace que el proceso de activación sea menos frenético, más reproducible y más susceptible de ampliación.

Para ilustrar la activación y derivatización de un polisacárido utilizando la química CDAP, el dextrano se activó a 0,25 y 0,5 mg cdAP/mg de dextrano. Para cada reacción, se enfrió una solución de dextrano de 10 mg/ml en agua sobre hielo, y se añadió1/10 º volumen de una culata DMAP de 2,5 M (preparada como se describe en la sección 3). La solución final se llevó a pH 9 mediante la adición de 0,1 M de NaOH en alícuotas de 10 μL. La solución se enfrió y se agitó, se agregó CDAP y se mantuvo el pH a pH 9 agregando alícuotas de 10 μL de 0,1 M de NaOH durante 15 min. Solo se agregaron 0,25 mL de 0,5 M de ADH a pH 9 (menos de la cantidad habitual) y se permitió que la reacción continuara durante la noche a 4 °C.
El dextrano etiquetado se dializó secuencialmente contra 1 M NaCl, 0,15 M NaCl y agua como se describe en la sección 6. A continuación, se ensayó el ADH-dextrano para el dextrano mediante el ensayo de resorcinol/ácido sulfúrico (sección 7.2). Una curva estándar típica que utiliza la glucosa como el estándar de azúcar se muestra en la Figura 4A. El contenido de hidrazida se determinó mediante el ensayo TNBS descrito en la sección 7.3. Una curva estándar típica de hidrazida usando ADH como estándar se da en la Figura 4B.
Los cálculos representativos de la activación del dextrano en los dos niveles de activación se muestran en la Figura 4A,B. Los datos se presentan como hidrazidas por 100 kDa de polímero de dextrano y como porcentaje en peso de ADH a dextrano, como se describe en las secciones 7.9.3.4 y 7.9.3.5, respectivamente, en la Figura 4C. El grado de derivatización se duplicó aproximadamente a medida que se duplicó la relación CDAP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figura 1: Estructura química del CDAP. CDAP = 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figura 2: Proceso de activación y conjugación de CDAP. El proceso se divide conceptualmente en dos fases, con el polisacárido activado común a ambas. En condiciones básicas, CDAP activa hidroxilos polisacáridos, liberando DMAP (reacción 1). La hidrólisis CDAP también libera DMAP (reacción 3). Aunque se muestra un ciano-éster, este puede no ser el intermediario real. El intermedio se conoce, por lo tanto, como polisacárido "activado" (CDAP). Durante la primera fase de activación, el polisacárido activado puede hidrolizarse (reacción 4) o sufrir reacciones secundarias (reacción 5). En la segunda fase de conjugación (reacción 2), el polisacárido activado reacciona con una amina para formar un enlace isourea estable además de las reacciones 4 y 5. Abreviaturas: CDAP = 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato; DMAP = 4-dimetilaminopiridina; R-NH2 = amina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Figura 3: Activación y conjugación de CDAP. El proceso requiere equilibrar la reactividad del CDAP con el polisacárido, la estabilidad del CDAP y el polisacárido activado, así como la reactividad del polisacárido activado con la de la amina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para la activación CDAP de dextrano. Curvas estándar típicas para los ensayos (A) resorcinol/ácido sulfúrico y (B) TNBS. Se muestran los resultados del ensayo para el dextrano activado con 0,25 y 0,5 mg de CDAP/mg de dextrano. La glucosa se utilizó como estándar para el ensayo de resorcinol. El dextrano, en mg/ml, se divide por 100 kDa para dar una concentración molar. La concentración de hidrazida se determina utilizando ADH como estándar y los resultados expresados como μM Hz. (C) Cálculo de hidrazida: proporciones de dextrano. El nivel de derivatización se calculó como hidrazidas por 100 kDa de dextrano para facilitar la comparación entre polímeros de diferentes pesos moleculares medios. La relación % en peso de g ADH/g dextrano se calculó utilizando un MW de 174 g/mol para ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Las proteínas y los ligandos que contienen aminas pueden unrse covalentemente a polisacáridos activados por el reactivo de cianilación, 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato (CDAP), para formar conjugados de proteína covalente (ligando)-polisacárido. Este artículo describe un protocolo mejorado para llevar a cabo la activación controlada de CDAP a 0 °C y variando el pH y realizar la posterior conjugación de los polisacáridos activados.

Activación y conjugación de polisacáridos solubles utilizando 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Los polisacáridos son poco inmunogénicos a menos que estén vinculados a proteínas y necesitan ser activados para la derivatización o conjugación a proteínas. En este método, CDAP se utiliza como reactivo de embarque de arena. El CDAP activa los hidroxilos polisacáridos para la derivatización o para ser vinculados a proteínas para su uso en vacunas o reactivos de diagnóstico.CDAP ha reemplazado en gran medida el bromuro de cianógeno como un reactivo de polisacárido de sand lading. CDAP es más fácil de usar, más eficiente y se puede usar a un pH más bajo que el bromuro de cianógeno. Es un reactivo de activación mucho mejor.CDAP se puede utilizar con la mayoría de los polisacáridos, a diferencia de la aminación reductiva, que requiere hidroxilos vicinales. La química se puede utilizar para conjugar directa e indirectamente con proteínas, y se puede utilizar para hacer reactivos de diagnóstico. La reacción de activación de CDAP, como se describió originalmente, fue muy rápida y difícil de controlar.El protocolo proporcionado aquí hace que la química sea mucho más fácil de realizar y mucho más reproducible. Antes de comenzar el experimento, ajuste el pH de la solución de polisacáridos a 9 agregando 200 microlitros de solución de stock de dimetilaminopiridina de manera gradual mientras se agita. Mantenga la reacción fría en un baño de agua helada durante todo el proceso de activación.Proceda con la activación de ciano-dimetilaminopiridina-tetrafluoroborato o CDAP transfiriendo 100 microlitros de CDAP a la solución de polisacárido mientras se agita. Inicie el temporizador y controle el cambio de pH durante toda la activación durante 15 minutos. Mantenga la reacción en el pH objetivo agregando rápidamente incrementos de 10 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.1.Cuando se alcance el tiempo óptimo de activación, agregue dos mililitros de dihidrazida adípica molar de 0,5 a la vez al polisacárido activado. Verifique que el pH esté en el rango requerido para la funcionalización del hidróxido. Después de agitar continuamente la mezcla de reacción durante al menos una hora, transfiera la mezcla de reacción a cuatro grados centígrados.Para reducir la concentración de ADH del producto, dializar la solución de polisacárido derivatizado crudo utilizando el dispositivo de diálisis. Recupere el polisacárido derivatizado de la diálisis y determine la concentración de los polisacáridos e hidrazidas para calcular la relación hidrazida a polisacárido. Prepare un miligramo por mililitro de solución de polisacárido sin modificar para ser utilizado como estándar.Precaliente el bloque de calentamiento a 140 grados Celsius durante un mínimo de una hora para lograr una temperatura uniforme estable. Use una almohadilla protectora debajo y alrededor del bloque calefactor en caso de derrames de ácido. Agregue volúmenes variables de un miligramo por mililitro de carbohidratos estándar a los tubos de ensayo etiquetados de 13 por 100 borosilicatos en triplicatos y haga el volumen a 100 microlitros con agua para lograr las concentraciones estándar deseadas.Del mismo modo, configure ensayos de muestra agregando un volumen que contenga cinco microgramos del polisacárido derivatizado a tres tubos de muestra. Agregue 100 microlitros de seis miligramos por mililitro de resorcinol recién preparado a cada tubo. Usando un pipeteador repetido, agregue 300 microlitros del ácido sulfúrico 75% preparado a cada tubo, vórtice los tubos vigorosamente, apuntando el tubo, luego coloque todos los tubos en un bloque de calentador a un ritmo constante en orden secuencial e inmediatamente configure el temporizador durante tres minutos.A los tres minutos, retire los tubos en el mismo orden y colóquelos directamente en una rejilla en un baño de agua helada. Retire los tubos helados para que se equilibre a temperatura ambiente durante cinco minutos. Lea la absorbancia de todos los tubos en un espectrofotómetro UV-Vis a 430 nanómetros utilizando una cubeta de 10 milímetros de longitud de trayectoria.Para configurar las reacciones de ensayo, clastre y organice los tubos estándar etiquetados en el bastidor de tubos en orden de concentración creciente. Usando una micropipeta calibrada, agregue 100 microlitros de los estándares a cada tubo correspondiente. Para el estándar cero, utilice 100 microlitros del búfer de muestra.Del mismo modo, prepare y organice los tubos de muestra. Luego, utilizando una micropipeta calibrada de 1, 000 microlitros, agregue 875 microlitros de tampón de ensayo a todos los tubos de ensayo. Para comenzar la reacción del ensayo, agregue 25 microlitros de ácido trinitrobenceno sulfónico al 1% a cada tubo de ensayo en el orden predeterminado dentro de los cinco minutos.Vórtice los tubos de ensayo durante dos segundos a alta velocidad, asegurándose de que el líquido se arremolina a una altura de media pulgada desde la abertura del tubo. Registre la hora de inicio del ensayo y establezca el temporizador en dos horas. Luego coloque el estante del tubo de ensayo en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas.Cuando termine el tiempo, vórtice los tubos y proceda a la recopilación de datos. El dextrano ADH se ensayó para dextrano utilizando el ensayo de ácido sulfúrico resorcinol. Se trazó un tubo estándar típico que usaba glucosa como el estándar de azúcar.El contenido de hidrazida en polisacáridos o dextranos derivatizados se determinó mediante el ensayo TNBS. El nivel de derivatización se calculó como hidruros por 100 kilodaltons de dextrano para facilitar la comparación entre polímeros de diferentes pesos moleculares medios. Es posible que sea necesario adaptar el protocolo descrito aquí para un polisacárido específico.La química CDAP se puede utilizar para funcionalizar polisacáridos para su uso con una amplia variedad de reactivos de conjugación. Se puede utilizar, por ejemplo, para biotinilar polisacáridos para su uso en ELISA. Las proteínas pueden estar directamente relacionadas con los polisacáridos activados por CDAP, pero esto generalmente requiere cierta optimización para un polisacárido específico.El rendimiento de conjugación puede ser de más del 75% El uso de la química CDAP ha permitido vacunas conjugadas de bajo costo, como las fabricadas, por ejemplo, por el Instituto Serum de la India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Un sistema de células de ensayo gratis Estimación de la capacidad de neutralización de GM-CSF recombinante soluble de anticuerpos con GM-CSF receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Test de activación de basófilos para la investigación de mecanismos IgE mediados de Hipersensibilidad a las Drogas

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...