Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Arbetet som beskrivs här finansierades av Fina Biosolutions LLC.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees är grundare och ägare av Fina Biosolutions. Han har flera patent relaterade till CDAP-kemi och drar nytta av licensiering av kemi och CDAP-konjugationskännare.

CDAP är ett bekvämt reagens för att derivatera och konjugera polysackarider. I den här artikeln beskrivs den allmänna metoden för att använda CDAP för att härleda polysackarider med hydrazider (PS-ADH) och innehåller nyligen publicerade förbättringar8. För det första betonar tekniken vikten av att upprätthålla mål pH för att styra aktiveringsprocessen. Vi fann att även om många vanliga buffertar stör CDAP-aktiveringsreaktionen, kan DMAP framgångsrikt användas som buffert för att hantera pH8. Dessutom är DMAP redan en reaktionsbiprodukt av CDAP-aktivering. Slutligen underlättar buffring av polysackaridlösningen med DMAP innan CDAP tillsätts exakt inriktning och underhåll av reaktions-pH. Som vi beskriver är det användbart att justera pH-et för den koncentrerade DMAP-stamlösningen så att den vid utspädning når det riktade pH-skat. För det andra saktade utförandet av processen i kylan reaktionstiden, vilket gjorde aktiveringsprocessen mindre frenetisk och mer förlåtande. Lägre temperatur minskade frekvensen av CDAP-hydrolys, och den optimala aktiveringstiden vid pH 9 ökar från ~ 3 min till ~ 15 min. Dessutom krävs mindre CDAP för att uppnå samma aktiveringsnivå som vid rumstemperatur. 
ADH-derivatiserade polysackarider kan konjugeras till proteiner med hjälp av karbodiimider (t.ex. EDAC)7. Till exempel använder flera licensierade Haemophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolfosfat (PRP) derivatized med ADH för att konjugera till stelkramp toxoid med EDAC. CNBr var ursprungligen anställd, men CDAP är ett mycket lättare reagens att använda för detta ändamål. Enligt vår erfarenhet är ett bra målintervall för ADH-derivatisering 10-30 hydrazider per 100 kDa polysackarid eller ~ 1-3% ADH i vikt. 
Samma process kan användas för att härleda polysackarider med primära aminer genom att ersätta ADH för en diamin. Det rekommenderas att använda hexandikamin för att derivatera polysackarider med aminer8. Den aminerade polysackariden (PS-NH2)kan konjugeras med reagenser utvecklade för proteinkonjugation11. Vanligtvis härleds PS-NH2 med en maleimid (t.ex. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), och proteinet är tämjt (t.ex. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kemi är mycket effektiv.
Proteiner kan också kopplas direkt till CDAP-aktiverade polysackarider via aminer på lysiner. Medan aktiveringsprotokollet som används i allmänhet liknar det som beskrivs här, är det nödvändigt att optimera aktiveringsnivån, polysackarid- och proteinkoncentrationen, liksom proteinet: polysackaridförhållandet5,6,8. 
Dextran är en av de enklaste polysackariderna att aktivera med CDAP på grund av dess relativt höga densitet av hydroxylgrupper, men vissa polysackarider, såsom Vi-antigen, kan vara utmanande. Följaktligen finns det inget enda "bästa" protokoll för CDAP-konjugation direkt till proteiner. Vi föreslår först att utveckla ett protokoll för att uppnå lämpliga nivåer av aktivering, som bestäms av omfattningen av hydrazide derivatization, och sedan fortsätta att rikta protein konjugation till CDAP-aktiverade polysackarid.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Konjugatvacciner, såsom de som består av polysackarider som är kovalely kopplade till ett bärarprotein, är bland de anmärkningsvärda framstegen inom vaccinologi1,2. Polysackarider, som T-cellsoberoende antigener, är dåligt immunogena hos spädbarn och inducerar inte minne, klassväxling eller affinitetsmognad av antikroppar3. Dessa brister övervinns i polysackaridkonjugatvacciner4. Eftersom de flesta polysackarider inte har ett bekvämt kemiskt handtag för konjugation måste de först göras reaktiva eller "aktiveras". Den aktiverade polysackariden är sedan kopplad antingen direkt till proteinet (eller modifierat protein) eller är funktionell för ytterligare derivatisering före konjugation4. De flesta licensierade polysackaridkonjugatvacciner använder antingen reduktiv amination eller cyanylering för att aktivera polysackaridhydroxiler. Cyanogenbromid (CNBr), ett reagens som tidigare hade använts för att aktivera kromatografi hartser, användes ursprungligen för polysackaridderivatisering. CNBr kräver dock högt pH, vanligtvis ~ pH 10,5 eller mer, för att delvis avprotonera polysackaridhydroxiler så att de är tillräckligt nukleofila för att attackera cyanogruppen. Det höga pH-talet kan vara skadligt för baslabbila polysackarider, och varken CNBr eller den aktiva cyano-ester som ursprungligen bildades är tillräckligt stabil vid så högt pH.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) introducerades av Lees et al. för användning som cyanylerande medel för aktivering av polysackarider5,6. CDAP, som är kristallint och lätt att hantera, visade sig aktivera polysackarider vid ett lägre pH än CNBr och med färre sidoreaktioner. Till skillnad från CNBr kan CDAP-aktiverade polysackarider konjugeras direkt till proteiner, vilket förenklar syntesprocessen. CDAP-aktiverade polysackarider kan funktionaliseras med en diamin (t.ex. hexandiamin) eller en dihydrazid (t.ex. adipic dihydrazide, ADH) för att göra amino- eller hydrazide-derivatiserade polysackarider. En hög koncentration av homobifunktionellt reagens används för att undertrycka korslänkning av polysackarider. Aminopolysackarider kan sedan konjugeras med någon av de otaliga tekniker som används för proteinkonjugation. Hydrazide-derivatized polysackarider är ofta kopplade till proteiner med hjälp av en karbodiimide reagens (t.ex. 1-etyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimide (EDAC))7. Ytterligare optimering av CDAP polysackarid aktivering har beskrivits av Lees et al.8 och ingår i protokollet beskrivs här.
Översikt över CDAP-konjugation CDAP-protokollet kan konceptualiseras som två faser: (1) aktivering av polysackarid och (2) konjugation av den aktiverade polysackariden med ett protein eller ligand (Figur 2). Målet med det första steget är att effektivt aktivera polysackariden, medan målet med det andra är att effektivt konjugera till den aktiverade polysackariden. Den aktiverade polysackariden binder ihop de två stegen. Denna konceptualisering hjälper till att fokusera på de kritiska elementen i varje steg. Figur 2 expanderar på denna konceptualisering, som visar önskade aktiverings- och kopplingsreaktioner, tillsammans med hydrolysreaktioner och sidoreaktioner.
Under aktiveringsfasen är de tre största problemen CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysackaridhydroxiler och stabiliteten hos den aktiverade polysackariden (figur 3). CDAP-hydrolysen ökar med pH, liksom hydrolysen av den aktiverade polysackariden och sidoreaktionerna. CDAP-reaktionen med polysackarid underlättas dock genom att öka pH-talet. Effektiv aktivering av polysackarider med CDAP kräver en balans mellan 1) polysackaridens reaktivitet och CDAP och 2) hydrolys- och sidoreaktionerna hos både reagenset och den aktiverade polysackariden.
I det ursprungliga CDAP aktivering protokollet beskrivs av Lees et al.5,CDAP aktivering av polysackarider utfördes vid rumstemperatur i obebyggd pH 9 lösning. Aktiveringshastigheten konstaterades vara snabb under detta tillstånd, och aktiveringen skulle vara klar inom 3 minuter. Reaktionen åtföljdes också av snabb hydrolys av CDAP, orsakar en snabb pH droppe av den obyggda reaktionslösningen. Det var utmanande att snabbt höja och behålla reaktions-pH vid målvärdet på så kort tid. I det beskrivna protokollet utfördes aktivering genom att cdap tillsatts från en 100 mg/ml stamlösning till den obebyggda polysackaridlösningen. PH höjdes 30 s senare med "en lika stor volym på 0,2 M trietylamin". Protein som ska konjugeras tillsattes sedan efter 2,5 min till aktiveringsreaktionen. I synnerhet var pH för aktiveringssteget inte välkontrollerat och överskred sannolikt initialt mål-pH. Den snabba reaktionen som krävde snabb pH-justering gjorde aktiveringsprocessen svår att kontrollera och utmanande att skala upp.
I motsats till det ursprungliga protokollet har det ändrade protokollet som beskrivs här två stora förbättringar. För det första är pH-enheten för polysackaridlösningen förjusterad till målaktiverings-pH, med DMAP som buffert, före tillsats av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 och har därmed god buffringseffekt runt pH 9, och till skillnad från många andra buffertar befanns DMAP inte främja CDAP-hydrolys8. Dessutom är DMAP redan en process mellanliggande och lägger därför inte till en ny komponent i reaktionsblandningen. Förjustering av pH-värde innan CDAP tillsätts eliminerar den stora pH-gungan i början av reaktionen och möjliggör ett effektivare underhåll av mål-pH under reaktionen. Den andra förbättringen är att utföra aktiveringsreaktionen vid 0 °C, där frekvensen av CDAP-hydrolys är markant långsammare än vid rumstemperatur. Med den längre reagenshalvtiden vid 0 °C ökas aktiveringstiden från 3 min till 15 min för att kompensera för den långsammare aktiveringshastigheten vid lägre temperatur. Den längre reaktionstiden gör det i sin tur lättare att bibehålla reaktions-pH. Användningen av 0 °C saktar också nedbrytningen av pH-känsliga polysackarider, vilket gör det möjligt att förbereda konjugat av denna typ av polysackarid. Förbättringarna i protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, lättare att kontrollera, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.
Denna artikel beskriver det förbättrade protokollet för att utföra kontrollerad CDAP-aktivering av polysackarid vid 0 °C och vid ett angivet mål pH och utföra efterföljande derivatisering av aktiverade polysackarider med ADH. Också beskrivet är en trinitrobensulfonsyra (TNBS) analys, baserad på metoden Qi et al.9, för bestämning av hydrazid nivå på den modifierade polysackarid. En modifierad analys för hexoser baserad på resorcinol och svavelsyra10 beskrivs också, som kan användas för att bestämma ett bredare spektrum av polysackarider. För mer information om AKTIVERING och konjugation av CDAP hänvisas läsaren till tidigare publikationer5,6,8 av Lees et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Konjugatvacciner är anmärkningsvärda framsteg inom vaccinologi. För beredning av polysackaridkonjugatvacciner kan polysackariderna bekvämt funktionaliseras och kopplas till vaccinbärarproteiner med 1-cyano-4-dimethylaminopyridintefluoreborat (CDAP), ett lätt hantera cyanylerande reagens. CDAP aktiverar polysackarider genom att reagera med kolhydrathydroxidgrupper vid pH 7-9. Cdap:s stabilitet och reaktivitet är mycket pH-beroende. Reaktionens pH minskar också under aktiveringen på grund av hydrolysen av CDAP, vilket gör bra pH-kontroll nyckeln till reproducerbar aktivering. Det ursprungliga CDAP-aktiveringsprotokollet utfördes vid rumstemperatur i obyggda pH 9-lösningar.
På grund av den snabba reaktionen under detta tillstånd (<3 min) och den medföljande snabba pH-droppen från den snabba CDAP-hydrolysen var det utmanande att snabbt justera och bibehålla målreaktions-pH under den korta tidsramen. Det förbättrade protokollet som beskrivs här utförs vid 0 °C, vilket saktar cdap hydrolys och förlänger aktiveringstiden från 3 min till ~15 min. Dimetyllaminopyridin (DMAP) användes också som buffert för att förjustera polysackaridlösningen till målaktiverings-pH innan CDAP-reagenset tillskom. Den längre reaktionstiden, i kombination med den långsammare CDAP-hydrolysen och användningen av DMAP-buffert, gör det lättare att upprätthålla aktiverings-PH under hela aktiveringsprocessen. Det förbättrade protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.

För att illustrera aktivering och derivatization av en polysackarid med hjälp av CDAP kemi aktiverades dextran vid 0,25 och 0,5 mg CDAP/mg dextran. För varje reaktion kyldes en 10 mg/ml dextran lösning i vatten på is och 1/10th volym av en 2,5 M DMAP bestånd (beredd enligt beskrivningen i avsnitt 3) lades till. Den slutliga lösningen kom till pH 9 genom tillägg av 0,1 M NaOH i 10 μL alikvoter. Lösningen kyldes och rördes om, tillade CDAP, och pH-värde vid pH 9 genom att lägga till 10 μL alikvoter på 0, 1 M NaOH i 15 min. Endast 0,25 ml 0,5 M ADH vid pH 9 tillsattes (mindre än det vanliga beloppet) och reaktionen tilläts fortsätta över natten vid 4 °C.
Den märkta dextran var sedan sekventiellt dialyserad mot 1 M NaCl, 0,15 M NaCl och vatten enligt beskrivningen i avsnitt 6. ADH-dextran analyserades sedan för dextran med hjälp av resorcinol/svavelsyraanalys (avsnitt 7. 2). En typisk standardkurva med glukos som sockerstandard visas i figur 4A. Hydrazidhalten fastställdes med hjälp av TNBS-analysen som beskrivs i avsnitt 7.3. En typisk hydrazidstandardkurva med ADH som standard anges i figur 4B.
Representativa beräkningar från aktiveringen av dextran på de två aktiveringsnivåerna visas i figur 4A,B. Uppgifterna presenteras som både hydrazider per 100 kDa dextranpolymer och som en viktprocent av ADH till dextran, enligt beskrivningen i avsnitten 7.9.3.4 respektive 7.9.3.5 i figur 4C. Graden av derivatization fördubblades ungefär som CDAP förhållandet fördubblades.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Figur 1:Cdaps kemiska struktur. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Figur 2:Process för aktivering och konjugation av CDAP. Processen är konceptuellt uppdelad i två faser, med den aktiverade polysackariden gemensam för båda. Under grundläggande förhållanden aktiverar CDAP polysackaridhydroxiler och släpper DMAP (reaktion 1). CDAP hydrolys släpper också DMAP (reaktion 3). Även om en cyano-ester visas, kanske detta inte är den faktiska mellanliggande. Mellanstadiet kallas därför (CDAP) "aktiverad" polysackarid. Under den första aktiveringsfasen kan den aktiverade polysackariden hydrolysera (reaktion 4) eller genomgå sidoreaktioner (reaktion 5). I den andra konjugationsfasen (reaktion 2) reagerar den aktiverade polysackariden med en aminer för att bilda en stabil isoureabindning utöver reaktionerna 4 och 5. Förkortningar: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimethylaminopyridin; R-NH2 = aminer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Bild 3:AKTIVERING och konjugation av CDAP. Processen kräver balansering av CDAP-reaktivitet med polysackariden, cdap-enhetens stabilitet och aktiverad polysackarid, samt reaktiviteten hos den aktiverade polysackariden med amningens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Figur 4: Representativa resultat för CDAP-aktivering av dextran. Typiska standardkurvor för(A)resorcinol/svavelsyra och( B) TNBS-analyser. Analysresultaten för dextran aktiverade med 0, 25 och 0, 5 mg CDAP/mg dextran visas. Glukos användes som standard för resorcinol-analysen. Dextran, i mg/ml, delas med 100 kDa för att ge en molarkoncentration. Hydrazidkoncentrationen bestäms med ADH som standard och resultaten uttryckta som μM Hz. (C) Beräkning av hydrazid: dextranförhållanden. Nivån av derivatization beräknades som hydrazider per 100 kDa dextran för att underlätta jämförelsen mellan polymerer med olika genomsnittliga molekylvikter. Viktförhållandet % för g ADH/g dextran beräknades med en MW på 174 g/mol för ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteiner och aminer som innehåller ligander kan kovalent kopplas till polysackarider som aktiveras av cyanylationsreagenset, 1-cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluorborat (CDAP), för att bilda kovalentprotein (ligand)-polysackaridkonjugater. Denna artikel beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra kontrollerad CDAP aktivering vid 0 °C och varierande pH och utföra efterföljande konjugation av aktiverade polysackarider.

Aktivering och konjugation av lösliga polysackarider med 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polysackarider är dåligt immungena om de inte är kopplade till protein och måste aktiveras för derivatisering eller konjugation till proteiner. I den här metoden används CDAP som sandsleverreagens. CDAP aktiverar polysackaridhydroxiler för derivatisering eller för att kopplas till proteiner för användning i vacciner eller diagnostiska reagenser.CDAP har till stor del ersatt cyanogenbromid som ett polysackaridsandslevermedel. CDAP är enklare att använda, effektivare, och kan användas vid ett lägre pH än cyanogenbromid. Det är ett mycket bättre aktiverande reagens.CDAP kan användas med de flesta polysackarider, till skillnad från reduktiv amination, vilket kräver vicinala hydroxyls. Kemin kan användas för att både direkt och indirekt konjugera till proteiner, och den kan användas för att göra diagnostiska reagenser. CDAP aktivering reaktion, som ursprungligen beskrivits, var mycket snabb och svårt att kontrollera.Protokollet som tillhandahålls här gör kemin mycket lättare att utföra och mycket mer reproducerbar. Innan du påbörjar experimentet, justera pH-värde för polysackaridlösningen till 9 genom att tillsätta 200 mikroliter dimetyllaminopyridinbuljonglösning på ett droppe sätt under omrörning. Håll reaktionen kyld i ett isvattenbad under hela aktiveringsprocessen.Fortsätt med cyano-dimethylaminopyridin-tetrafluorborat eller CDAP-aktivering genom att överföra 100 mikroliter CDAP till polysackaridlösningen under omrörning. Starta timern och övervaka pH-bytet under hela aktiveringen i 15 minuter. Behåll reaktionen vid mål-pH genom att snabbt tillsätta 10 mikrolitersteg på 0, 1 molar natriumhydroxid.När den optimala aktiveringstiden har uppnåtts, tillsätt två milliliter 0,5 molar adipic dihydrazide på en gång till den aktiverade polysackariden. Kontrollera att pH-h:t ligger inom det område som krävs för hydroxifunktionalisering. Efter kontinuerlig omrörning av reaktionsblandningen i minst en timme, överför reaktionsblandningen till fyra grader Celsius.För att minska ADH-koncentrationen från produkten, dialysera den råderivatiserade polysackaridlösningen med hjälp av dialysanordningen. Återställ derivatiserad polysackarid från dialys och bestäm koncentrationen av polysackarider och hydrazid för att beräkna förhållandet mellan hydrazid och polysackarid. Förbered en milligram per milliliter omodifierad polysackaridlösning som ska användas som standard.Förvärm värmeblocket till 140 grader Celsius i minst en timme för att uppnå en stabil jämn temperatur. Använd en skyddsplatta under och runt värmeblocket vid syraspill. Tillsätt olika volymer på ett milligram per milliliter kolhydratstandard till de märkta 13 av 100 borosilikat provrör i triplicater och utgör volymen till 100 mikroliter med vatten för att uppnå önskade standardkoncentrationer.På samma sätt, ställ in provanalyser genom att lägga till en volym som innehåller fem mikrogram av den derivatiserade polysackariden till tre provrör. Tillsätt 100 mikroliter nyberedd sex milligram per milliliter resorcinol till varje rör. Använd en upprepad pipetter, tillsätt 300 mikroliter av den beredda 75%svavelsyran till varje rör, virvel rören kraftigt, peka röret bort, placera sedan alla rör i ett värmeblock i jämn takt i sekventiell ordning och ställ omedelbart timern i tre minuter.Vid tre minuter, ta bort rören i samma ordning och placera dem direkt i ett rack i ett isvattenbad. Ta bort iskalla rör så att de kan balansera till rumstemperatur i fem minuter. Läs absorbansen av alla rör på en UV-Vis-spektrofotometer vid 430 nanometer med en 10 millimeters banlängd cuvette.För att ställa in analysreaktioner, sortera och ordna de märkta standardrören i rörstället i ordning efter ökad koncentration. Använd en kalibrerad mikropipett och tillsätt 100 mikroliter av standarderna till varje motsvarande rör. För nollstandarden använder du 100 mikroliter av provbufferten.På samma sätt bered och ordna provrören. Använd sedan en kalibrerad 1 000 mikrolitermikrpipett, tillsätt 875 mikroliter analysbuffert till alla analysrör. För att starta analysreaktionen, tillsätt 25 mikroliter av 1%trinitrobensulfonsyra till varje analysrör i den förutbestämda ordningen inom fem minuter.Virvel assay rören i två sekunder i hög hastighet, se till att vätskan virvlar till en höjd av en halv tum från röröppningen. Registrera analysens starttid och ställ in timern på två timmar. Placera sedan analysrörsstället i mörkret vid rumstemperatur i två timmar.När tiden är över virkar du rören och fortsätter till datainsamling. ADH dextran analyserades för dextran med hjälp av resorcinol svavelsyra analys. Ett typiskt standardrör med glukos som sockerstandard ritades.Hydrazidhalten i derivatiserad polysackarid eller dextran fastställdes med hjälp av TNBS-analysen. Nivån av derivatization beräknades som hydrider per 100 kilodaltons av dextran för att underlätta jämförelsen mellan polymerer av olika genomsnittliga molekylvikter. Protokollet som beskrivs här kan behöva anpassas för en specifik polysackarid.CDAP-kemi kan användas för att funktionalisera polysackarider för användning med en mängd olika konjugationsreagenser. Det kan till exempel användas för att biotinylera polysackarider för användning i ELISA. Proteiner kan vara direkt kopplade till CDAP-aktiverade polysackarider, men detta kräver vanligtvis viss optimering för en specifik polysackarid.Konjugationsutbytet kan vara över 75%Användningen av CDAP-kemi har möjliggjort billiga konjugatvacciner, som de som till exempel gjorts av Serum Institute of India.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Upptäckt av Neu1 Sialidase aktivitet i regleringen av Toll-like receptor aktivering

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

En cell gratis analyssystem uppskatta neutraliserande förmåga av GM-CSF antikroppar med hjälp av rekombinant Löslig GM-CSF-receptorn

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Basophil Aktivering test för utredning av IgE-medierade mekanismer i Läkemedelsöverkänslighet

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder för kvantitativ detektion av antikroppsinducerad komplementaktivering på röda blodkroppar

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk vidhäftning analys för studier av Grin Aktivering i T-lymfocyter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering och aktivering av murina lymfocyter

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Skapandet av en tät Transposon införande bibliotek med bakteriell konjugation i Enterobacterial stammar som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...