Name: activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Burada açıklanan çalışma Fina Biosolutions LLC tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , (1994).</li><li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins.">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li><li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+independent+antigens.">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li><li>Cruse, J. M., Lewis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conjugate Vaccines. 10, (1989).</li><li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li><li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li><li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates.">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li><li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+(CDAP)+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation.">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777 (2020).</li><li>Qi, X. -. Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+hydrazine,+hydrazides,+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid.">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li><li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod.">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , (2013).</li></ol>

Andrew Lees, Fina Biosolutions'un kurucusu ve sahibidir. CDAP kimyası ile ilgili çeşitli patentlere sahiptir ve kimya ve CDAP konjugasyon know-how'ının lisanslanmasıyla yararlanır.

CDAP, polisakkaritleri türetmek ve konjuge etmek için uygun bir reaktiftir. Bu makalede, hidrazitlerle (PS-ADH) polisakkaritleri türetmek için CDAP'yi kullanmanın genel yöntemi açıklanmaktadır ve yakın zamanda yayınlanan iyileştirmeleri içerir8. İlk olarak, teknik aktivasyon sürecini kontrol etmek için hedef pH'ı korumanın önemini vurgular. Birçok yaygın arabellek CDAP aktivasyon reaksiyonunu müdahale ederken, DMAP'ın pH8'i yönetmek için arabellek olarak başarıyla kullanılabileceğini bulduk. Ayrıca, DMAP zaten CDAP etkinleştirmesinin bir reaksiyon yan ürünüdür. Son olarak, CDAP'yi eklemeden önce polisakkarit çözeltisinin DMAP ile tamponlaştırılması, reaksiyon pH'ının hassas bir şekilde hedeflenerek bakımını kolaylaştırır. Tarif ettiğimiz gibi, konsantre DMAP stok çözeltisinin pH'ını seyreltildiğinde hedeflenen pH'a ulaşacak şekilde ayarlamak yararlıdır. İkincisi, işlemi soğukta gerçekleştirmek reaksiyon süresini yavaşlattı, aktivasyon sürecini daha az çılgın ve daha bağışlayıcı hale getirdi. Daha düşük sıcaklık CDAP hidroliz oranını azalttı ve pH 9'daki optimum aktivasyon süresi ~3 dakikadan ~15 dakikaya yükseldi. Ek olarak, aynı aktivasyon seviyesini elde etmek için oda sıcaklığında yapılandan daha az CDAP gereklidir. 
ADH türevli polisakkaritler karbodiimidler (örneğin, EDAC)7kullanılarak proteinlere eşlenebilir. Örneğin, birkaç lisanslı Hemofili influenzae b (Hib) aşısı, EDAC kullanarak tetanoz toksoidine eşlenerek ADH ile türetilen poliribosylribitolphosphate 'yi (PRP) kullanır. CNBr başlangıçta kullanıldı, ancak CDAP bu amaç için kullanımı çok daha kolay bir reaktiftir. Deneyimlerimize göre, ADH derivatizasyonu için iyi bir hedef aralığı, 100 kDa polisakkarit başına 10-30 hidrazit veya ağırlıkça ~% 1-3 ADH'dir. 
Aynı işlem, ADH'yi bir diamin için ikame larak birincil aminlere sahip polisakkaritleri türetmek için de kullanılabilir. Polisakkaritleri amin8ile türetmek için heksan diamin kullanılması önerilir. Amine polisakkarit (PS-NH2),protein konjugasyonu11için geliştirilen reaktifler kullanılarak eşlenebilir. Tipik olarak, PS-NH2 bir maleimid ile türetilir (örn. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-karboksilat (SMCC) veya N-γ-maleimidobutyryl -oxysuccinimide ester (GMBS)) ve protein tiyoz edilir (örneğin, süksinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propiyonat (SP ile)DP)). Tiyol-maleimid kimyası çok etkilidir.
Proteinler ayrıca lizinler üzerindeki ɛ-amin yoluyla CDAP ile aktive polisakkaritlerle doğrudan birleşebilir. Kullanılan aktivasyon protokolü genellikle burada açıklanana benzer olsa da, aktivasyon seviyesini, polisakkarit ve protein konsantrasyonunu ve protein:polisakkarit oranı5, 6,8'ioptimize etmek gerekir.
Dektran, nispeten yüksek hidroksil grubu yoğunluğu nedeniyle CDAP ile aktive edilmesi en kolay polisakkaritlerden biridir, ancak Vi antijeni gibi bazı polisakkaritler zor olabilir. Sonuç olarak, CDAP konjugasyonu için doğrudan proteinlere tek bir "en iyi" protokol yoktur. Öncelikle hidrazür türetme kapsamına göre belirlenen uygun aktivasyon seviyelerine ulaşmak için bir protokol geliştirmeyi ve daha sonra protein konjugasyonunu CDAP ile aktive edilmiş polisakkaride yönlendirmeyi öneriyoruz.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" /> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as &#181;M Hz.&#160;(C)&#160;Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Bir taşıyıcı proteine aktif olarak bağlı polisakkaritlerden oluşanlar gibi konjuge aşılar, vaccinology1,2'deki dikkat çekici gelişmeler arasındadır. Polisakkaritler, T hücreden bağımsız antijenler olarak, bebeklerde zayıf immünojeniktir ve antikorların hafızasını, sınıf değiştirmesini veya benzeşim olgunlaşmasını teşvik etmez3. Polisakkarit konjuge aşılarda bu eksiklikler aşılanır4. Çoğu polisakkarit konjugasyon için uygun bir kimyasal tutamağa sahip olmadığı için, önce reaktif veya "aktive" edilmelidir. Aktif polisakkarit daha sonra doğrudan protein (veya değiştirilmiş protein) ile bağlanır veya konjugasyondan önce ek türetme için işlevsel hale getirilir4. Çoğu lisanslı polisakkarit konjuge aşıları, polisakkarit hidroksilleri etkinleştirmek için indirgeyici aminasyon veya siyanilasyon kullanır. Daha önce kromatografi reçinelerini aktive etmek için kullanılan bir reaktif olan siyanojen bromür (CNBr), başlangıçta polisakkarit derivatizasyonu için kullanılmıştır. Bununla birlikte, CNBr, polisakkarit hidroksilleri cyano grubuna saldırmak için yeterince nükleofilik olacak şekilde kısmen deprotone etmek için genellikle ~ pH 10.5 veya daha büyük yüksek pH gerektirir. Yüksek pH baz-labile polisakkaritler için zararlı olabilir ve ne CNBr ne de başlangıçta oluşturulan aktif cyano-ester bu kadar yüksek pH'da yeterince kararlı değildir.
CDAP (1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate; Şekil 1) polisakkaritlerin aktivasyonu için siyansilat maddesi olarak kullanılmak üzereLeesve ark. Kristal ve kullanımı kolay olan CDAP'nin, polisakkaritleri CNBr'den daha düşük bir pH'da ve daha az yan reaksiyonla aktive ettiği bulunmuştur. CNBr'nin aksine, CDAP ile aktive edilen polisakkaritler doğrudan proteinlere eşlenebilir ve sentez sürecini basitleştirebilir. CDAP ile aktive edilen polisakkaritler, amino veya hidrazit türetilmiş polisakkaritler yapmak için bir diamin (örneğin, heksan diamin) veya bir dihidrazit (örneğin, adipik dihidrazit, ADH) ile işlevsel hale getirilebilir. Polisakkaritlerin çapraz bağını bastırmak için yüksek konsantrasyonda homobiyfunctional reaktif kullanılır. Amino polisakkaritler daha sonra protein konjugasyonu için kullanılan sayısız tekniklerden herhangi biri kullanılarak konjuge edilebilir. Hidrazür türetilmiş polisakkaritler genellikle karbodiimid reaktifi (örneğin, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDAC))kullanılarakproteinlerle birleştirilir. CDAP polisakkarit aktivasyonunun daha da optimizasyonu Lees ve ark.8 tarafından tanımlanmıştır ve burada açıklanan protokole dahil edilmiştir.
CDAP konjugasyonuna genel bakış CDAP protokolü iki aşama olarak kavramsallaştırılabilir: (1) polisakkaritin aktivasyonu ve (2) aktif polisakkaritin bir protein veya ligand ile konjugasyonu (Şekil 2). İlk adımın amacı polisakkaritleri verimli bir şekilde etkinleştirmek, ikinci adımın amacı ise aktif polisakkaride verimli bir şekilde konjuge etmektir. Aktif polisakkarit iki adımı birbirine bağlar. Bu kavramsallaştırma, her adımın kritik öğelerine odaklanmaya yardımcı olur. Şekil 2, hidroliz reaksiyonları ve yan reaksiyonlarla birlikte istenen aktivasyon ve kavramsal reaksiyonları göstererek bu kavramsallaştırmayı genişletir.
Aktivasyon aşamasında, üç ana endişe CDAP stabilitesi, polisakkarit hidroksillerle CDAP reaksiyoni ve aktif polisakkarit stabilitesidir (Şekil 3). CDAP hidrolizi, aktif polisakkarit ve yan reaksiyonların hidrolizi gibi pH ile artar. Bununla birlikte, polisakkarit ile CDAP reaksiyonı pH artırılır. Cdap ile polisakkaritlerin verimli bir şekilde etkinleştirilmesi, 1) polisakkarit ve CDAP'nin reaktivitesi ve 2) hem reaktifin hem de aktif polisakkaritin hidrolizi ve yan reaksiyonları arasında bir denge gerektirir.
Lees ve ark.5tarafından açıklanan orijinal CDAP aktivasyon protokolünde, polisakkaritlerin CDAP aktivasyonu oda sıcaklığında unbuffered pH 9 çözeltisinde gerçekleştirildi. Etkinleştirme oranının bu durum altında hızlı olduğu ve etkinleştirmenin 3 dakika içinde tamamlanmış olacağı bulunmuştur. Reaksiyona cdap'in hızlı hidrolizi de eşlik etti ve bu da etkilenmemiş reaksiyon çözeltisinin hızlı bir pH düşmesine neden oldu. Bu kadar kısa bir zaman diliminde reaksiyon pH'ını hedef değerde hızlı bir şekilde yükseltmek ve korumak zordu. Açıklanan protokolde, 100 mg/mL stok çözeltisinden unbuffered polisakkarit çözeltisine CDAP eklenerek aktivasyon gerçekleştirildi. pH daha sonra "0.2 M trietilamin eşit hacim" ile 30 s yükseltildi. Konjuge edilecek protein daha sonra aktivasyon reaksiyona 2,5 dk sonra eklendi. Özellikle, aktivasyon adımının pH'ı iyi kontrol edildi ve büyük olasılıkla başlangıçta hedef pH'ı aştı. Hızlı pH ayarı gerektiren hızlı reaksiyon, etkinleştirme işlemini kontrol etmeyi zorlaştırdı ve ölçeklendirmeyi zorlaştırdı.
Özgün protokolün aksine, burada açıklanan değiştirilmiş protokolün iki büyük geliştirmesi vardır. İlk olarak, polisakkarit çözeltisinin pH'ı, CDAP eklenmeden önce arabellek olarak DMAP kullanılarak hedef aktivasyon pH'ına önceden ayarlanır. DMAP 9.5 pKa'ya sahiptir ve bu nedenle pH 9 etrafında iyi tamponlama gücüne sahiptir ve diğer birçok tamponun aksine, DMAP'ın CDAP hidrolizi8'iteşvik ettiği tespit edildi. Ayrıca, DMAP zaten bir proses aradır ve bu nedenle reaksiyon karışımına yeni bir bileşen eklemez. CDAP eklemeden önce pH'ı önceden ayarlamak, reaksiyonun başındaki büyük pH salınımını ortadan kaldırır ve reaksiyon sırasında hedef pH'ın daha verimli bir şekilde korunmasını sağlar. İkinci gelişme, CDAP hidroliz oranının oda sıcaklığındakinden belirgin şekilde daha yavaş olduğu 0 °C'de aktivasyon reaksiyonunu gerçekleştirmektir. 0 °C'de daha uzun reaktif yarı ömrü ile, daha düşük sıcaklıkta daha yavaş aktivasyon oranını telafi etmek için aktivasyon süresi 3 dakikadan 15 dakikaya çıkarılır. Daha uzun reaksiyon süresi, tepki pH'ını korumayı kolaylaştırır. 0 °C kullanımı ayrıca pH'a duyarlı polisakkaritlerin bozulmasını yavaşlatır ve bu da bu tür polisakkarit konjugelerinin hazırlanmasını mümkün hale getirir. Protokoldeki iyileştirmeler, etkinleştirme işlemini daha az çılgın, kontrol etmesi daha kolay, daha tekrarlanabilir ve ölçeklendirmeye daha uygun hale getirir.
Bu makalede, polisakkaritin 0 °C'de ve belirli bir hedef pH'da kontrollü CDAP aktivasyonunun gerçekleştirilmesi ve ADH ile etkinleştirilen polisakkaritlerin daha sonra türetilmesi için geliştirilmiş protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, modifiye polisakkarit üzerinde hidrazit seviyesinin belirlenmesi için Qi ve ark.9yöntemine dayanan bir trinitrobenzen sülfik asit (TNBS) tahlildir. Resorcinol ve sülfürik asit10'a dayanan hexozlar için değiştirilmiş bir tahlil de açıklanmıştır, bu da daha geniş bir polisakkarit aralığını belirlemek için kullanılabilir. CDAP aktivasyonu ve konjugasyonu hakkında daha fazla bilgi için okuyucu, Lees ve arkadaşları tarafından öncekiyayınlar 5,6,8'e atıfta bulunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic acid dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autotitrator or electronic pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker&#160; 2-4 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDAP</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>RES1458C</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107700</td>
			<td>MW 122.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flake ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 1 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76001-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube (for CDAP)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1099130001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 10 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0607N-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>55510-22</td>
			<td>6 mm x 110 mm Epoxy single junction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH temperature probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets &#38; tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline or PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small beaker 5-20 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-696</td>
			<td>A 10 mL beaker allows room for pH probe &#38; pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Spectra/Por 6-8kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>142150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>398047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugar standard</td>
			<td></td>
			<td>As appropriate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sulfuric acid 75%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BT126355-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipic dihydrazide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0638</td>
			<td>MW 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilcate test tubes 12 x 75</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borate, 0.5 M pH 9</td>
			<td>Boston Biologicals</td>
			<td>BB-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS 5% w/v</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2297</td>
			<td>MW 293.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and conjugation of soluble polysaccharides using 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (cdap)

Konjuge aşılar aşılarda vaksinolojide dikkate değer gelişmeler vardır. Polisakkarit konjuge aşıların hazırlanması için, polisakkaritler rahatça işlevsel hale getirilebilir ve kullanımı kolay bir siyantüre reaktif olan 1-siyano-4-dimetilamopyridine tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak aşı taşıyıcı proteinlere bağlanabilir. CDAP, pH 7-9'da karbonhidrat hidroksil grupları ile reaksiyona geçerek polisakkaritleri aktive eder. CDAP'nin stabilitesi ve reaktivitesi yüksek oranda pH'a bağlıdır. Reaksiyonun pH'ı, CDAP'nin hidrolizi nedeniyle aktivasyon sırasında da azalır, bu da iyi pH kontrolünü tekrarlanabilir aktivasyonun anahtarı haline getirir. Orijinal CDAP aktivasyon protokolü, oda sıcaklığında unbuffered pH 9 çözeltilerinde gerçekleştirildi.
Bu durumdaki hızlı reaksiyon (<3 dk) ve hızlı CDAP hidrolizinden gelen hızlı pH düşüşü nedeniyle, hedef reaksiyon pH'ını kısa zaman diliminde hızlı bir şekilde ayarlamak ve korumak zordu. Burada açıklanan geliştirilmiş protokol, CDAP hidrolizini yavaşlatan ve aktivasyon süresini 3 dakikadan ~15 dakikaya uzatan 0 °C'de gerçekleştirilir. Dimetilamitropyridin (DMAP), CDAP reaktifini eklemeden önce polisakkarit çözeltisini hedef aktivasyon pH'ına önceden ayarlamak için tampon olarak da kullanılmıştır. Daha uzun reaksiyon süresi, daha yavaş CDAP hidrolizi ve DMAP tamponunun kullanımı ile birleştiğinde, aktivasyon pH'ının aktivasyon işleminin tüm süresi boyunca korunmasını kolaylaştırır. Geliştirilmiş protokol, etkinleştirme işlemini daha az çılgın, daha tekrarlanabilir ve ölçeklendirmeye daha uygun hale getirir.

CDAP kimyası kullanılarak bir polisakkaritin aktivasyonunu ve türetilmesini göstermek için, dektran 0.25 ve 0.5 mg CDAP/ mg dektranda aktive edildi. Her reaksiyon için, sudaki 10 mg/mL dektran çözeltisi buz üzerinde soğutuldu ve 2,5 M DMAP stoğunun 1/10'uncu hacmi (bölüm 3'te açıklandığı gibi hazırlandı) eklendi. Nihai çözelti, 10 μL aliquots'ta 0,1 M NaOH ilavesi ile pH 9'a getirildi. Çözelti soğutuldu ve karıştırıldı, CDAP eklendi ve pH 9'da 15 dakika boyunca 0,1 M NaOH'luk 10 μL aliquots eklenerek muhafaza edildi.
Etiketli dektran daha sonra bölüm 6'da açıklandığı gibi 1 M NaCl, 0.15 M NaCl ve suya karşı sırayla çaprazlandı. Daha sonra resorcinol/sülfürik asit tahlili kullanılarak dektran için ADH-dektran test edildi (bölüm 7.2). Şeker standardı olarak glikoz kullanan tipik bir standart eğri Şekil 4A'dagösterilmiştir. Hidrazit içeriği bölüm 7.3'te açıklanan TNBS tahlili kullanılarak belirlenmiştir. Standart olarak ADH kullanan tipik bir hidrazit standart eğrisi Şekil 4B'de verilmiştir.
Dektranın iki aktivasyon düzeyinde aktivasyonundan elde edilen temsili hesaplamalar Şekil 4A,B'de gösterilmiştir. Veriler, Şekil 4C'desırasıyla 7.9.3.4 ve 7.9.3.5 bölümlerinde açıklandığı gibi, 100 kDa dektran polimer başına hem hidrazitler hem de dextran'a ADH'nin ağırlık yüzdesi olarak sunulmaktadır. CDAP oranı iki katına çıktıkça türetme derecesi yaklaşık iki katına çıktı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg"> Şekil 1: CDAP'ın kimyasal yapısı. CDAP = 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg"> Şekil 2: CDAP aktivasyon ve konjugasyon süreci. İşlem kavramsal olarak iki aşamaya ayrılır ve aktif polisakkarit her ikisinde de ortaktır. Temel koşullar altında CDAP, polisakkarit hidroksilleri aktive ederek DMAP'ı serbest bırakır (reaksiyon 1). CDAP hidrolizi ayrıca DMAP salgılar (reaksiyon 3). Bir cyano-ester gösterilse de, bu gerçek ara olmayabilir. Bu nedenle ara, (CDAP) "aktif" polisakkarit olarak adlandırılır. İlk aktivasyon aşamasında, aktif polisakkarit hidrolize (reaksiyon 4) veya yan reaksiyonlara maruz (reaksiyon 5) olabilir. İkinci konjugasyon aşamasında (reaksiyon 2), aktif polisakkarit, reaksiyon 4 ve 5'e ek olarak kararlı bir isourea bağı oluşturmak için bir amin ile reaksiyona girer. Kısaltmalar: CDAP = 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimetilamiminopyridin; R-NH2 = amin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg"> Şekil 3: CDAP aktivasyonu ve konjugasyonu. İşlem, CDAP reaktivitesinin polisakkarit ile dengelenmesini, CDAP'nin ve aktif polisakkaritin stabilitesinin yanı sıra aktif polisakkaritin amin ile reaktivitesini gerektirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg"> Şekil 4: Dektranın CDAP aktivasyonu için temsili sonuçlar. (A) resorcinol/ sülfürik asit ve (B) TNBS tahlilleri için tipik standart eğriler. 0.25 ve 0.5 mg CDAP/mg dektran ile aktive edilen dektran için tahlil sonuçları gösterilmiştir. Glikoz resorcinol tahlil için standart olarak kullanılmıştır. Dektran, mg / mL olarak, azı dişi konsantrasyonu vermek için 100 kDa'ya bölünür. Hidrazit konsantrasyonu standart olarak ADH kullanılarak belirlenir ve sonuçlar μM Hz. (C) Hidrazit hesaplaması olarak ifade edilir: dektran oranları. Derivatizasyon seviyesi, farklı ortalama moleküler ağırlıklardaki polimerler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için 100 kDa dektran başına hidrazitler olarak hesaplandı. g ADH/g dektran%ının ağırlık oranı, ADH için 174 g/mole MW kullanılarak hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP at JoVE.com

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate CDAP

Proteinler ve amin içeren ligandlar, ssiyansiyon reaktifi, 1-cyano-4-dimetilamiopyridine tetrafluoroborate (CDAP) tarafından aktive edilen polisakkaritlere, kurvalent protein (ligand)-polisakkarit konjugeleri oluşturmak için koaktif olarak bağlanabilir. Bu makalede, 0 °C'de kontrollü CDAP aktivasyonu ve değişen pH'da gerçekleştirme ve aktif polisakkaritlerin sonraki konjugasyonunu gerçekleştirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

1-Cyano-4-Dimetilamiopyridine Tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak Çözünür Polisakkaritlerin Aktivasyonu ve Konjugasyonu

Conjugate vaccines are remarkable advances in vaccinology. For the preparation of polysaccharide conjugate vaccines, the polysaccharides can be ...

Polisakkaritler proteine bağlı olmadıkça zayıf immünojeniktir ve proteinlere türetme veya konjugasyon için aktive edilmesi gerekir. Bu yöntemde CDAP kumlama reaktifi olarak kullanılır. CDAP, polisakkarit hidroksilleri türetmek veya aşılarda veya tanısal reaktiflerde kullanılmak üzere proteinlere bağlanmak üzere aktive eder.CDAP büyük ölçüde siyanojen bromürün yerini polisakkarit kumlama reaktifi olarak almıştır. CDAP kullanımı daha basit, daha verimlidir ve siyanojen bromürden daha düşük bir pH'da kullanılabilir. Reaktifi aktive etmek çok daha iyi.CDAP, vicinal hidroksil gerektiren indirgeyici aminasyonun aksine, çoğu polisakkaritle kullanılabilir. Kimya, proteinlere hem doğrudan hem de dolaylı olarak konjuge etmek için kullanılabilir ve tanısal reaktifler yapmak için kullanılabilir. CDAP aktivasyon reaksiyoni, başlangıçta açıklandığı gibi, çok hızlı ve kontrol etmek zordu.Burada sağlanan protokol, kimyanın gerçekleştirilmesini çok daha kolay ve çok daha tekrarlanabilir hale getirir. Deneye başlamadan önce, karıştırırken damla yönünde 200 mikrolitre dimetilaminopyridin stok çözeltisi ekleyerek polisakkarit çözeltisinin pH'ını 9'a ayarlayın. Aktivasyonun tüm süreci boyunca reaksiyonun buzlu su banyosunda soğutulmasına devam edin.Karıştırırken 100 mikrolitre CDAP'yi polisakkarit çözeltisine aktararak cyano-dimetilaminopyridine-tetrafluoroborate veya CDAP aktivasyonu ile devam edin. Zamanlayıcıyı başlatın ve tüm etkinleştirme sırasında pH değişimini 15 dakika boyunca izleyin. 0,1 molar sodyum hidroksitten oluşan 10 mikroliter artışı ekleyerek hedef pH'daki reaksiyonun korunmasını sağlayın.En uygun aktivasyon süresine ulaşıldığında, aktif polisakkaride aynı anda iki mililitre 0,5 molar adipic dihidrazit ekleyin. pH'ın hidroksit fonksiyonelleştirme için gerekli aralıkta olup olmadığını kontrol edin. Reaksiyon karışımının en az bir saat boyunca sürekli karıştırılmasının ardından, reaksiyon karışımını dört santigrat dereceye aktarın.Üründen ADH konsantrasyonu azaltmak için, diyaliz cihazını kullanarak ham türetilmiş polisakkarit çözeltisini dialyze edin. Türetilmiş polisakkaritleri diyalizden kurtarın ve hidrazürü polisakkarit oranına hesaplamak için polisakkaritlerin ve hidrazürün konsantrasyonunu belirleyin. Standart olarak kullanılmak üzere mililitre değiştirilmemiş polisakkarit çözeltisi başına bir miligram hazırlayın.Isıtma bloğunu, sabit bir homojen sıcaklığa ulaşmak için en az bir saat boyunca 140 santigrat dereceye ısıtın. Asit dökülmesi durumunda ısıtma bloğunun altında ve çevresinde koruyucu bir ped kullanın. Üç taraflı olarak etiketli 13'e 100 borosilikat test tüpüne mililitre karbonhidrat standardı başına bir miligramlık değişen hacimler ekleyin ve istenen standart konsantrasyonları elde etmek için hacmi su ile 100 mikrolitreye kadar yapın.Benzer şekilde, üç örnek tüpe beş mikrogram türetilmiş polisakkarit içeren bir hacim ekleyerek numune tahlilleri ayarlayın. Her tüpe mililitre resorcinol başına 100 mikrolitre taze hazırlanmış altı miligram ekleyin. Tekrar bir pipetter kullanarak, her tüpe hazırlanan% 75 sülfürik asitin 300 mikrolitresini ekleyin, tüpleri kuvvetli bir şekilde girdaplayın, tüpü uzağa yönlendirin, ardından tüm tüpleri sıralı olarak sabit bir hızda bir ısıtıcı bloğuna yerleştirin ve hemen zamanlayıcıyı üç dakika ayarlayın.Üç dakika içinde tüpleri aynı sırayla çıkarın ve doğrudan buzlu su banyosundaki bir rafa yerleştirin. Buz gibi tüpleri çıkararak oda sıcaklığına beş dakika boyunca dengede olmalarını bekleyin. 10 milimetre yol uzunluğunda bir cuvette kullanarak 430 nanometrede UV-Vis spektrofotometreslerindeki tüm tüplerin emiciliğini okuyun.Test reaksiyonları ayarlamak için, etiketli standart tüpleri artan konsantrasyon sırasına göre tüp rafında sıralayın ve düzenleyin. Kalibre edilmiş bir mikropipette kullanarak, ilgili her tüpe 100 mikrolitre standart ekleyin. Sıfır standart için, numune tamponunun 100 mikrolitresini kullanın.Benzer şekilde, numune tüplerini hazırlayın ve düzenleyin. Daha sonra kalibre edilmiş 1.000 mikrolitre mikropipette kullanarak, tüm test tüplerine 875 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Test reaksiyonuna başlamak için, beş dakika içinde önceden belirlenmiş sırada her test tüpüne 25 mikrolitre%1 trinitrobenzen sülfikonik asit ekleyin.Test tüplerini yüksek hızda iki saniye boyunca vorteks edin, sıvının tüp açıklığından yarım inç yüksekliğe kadar döndüğünden emin olun. Test başlangıç saatini kaydedin ve zamanlayıcıyı iki saat olarak ayarlayın. Daha sonra test tüpü rafını iki saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin.Zaman bittiğinde, tüpleri girdap ve veri toplamaya devam edin. ADH dektranı resorcinol sülfürik asit tahlili kullanılarak dektran için test edildi. Şeker standardı olarak glikoz kullanan tipik bir standart tüp çizildi.Türetilmiş polisakkarit veya dektrandaki hidrazit içeriği TNBS tahlili kullanılarak belirlendi. Derivatizasyon seviyesi, farklı ortalama moleküler ağırlıklardaki polimerler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için 100 kilodalton dektran başına hidrit olarak hesaplandı. Burada açıklanan protokolün belirli bir polisakkarit için uyarlanmış olması gerekebilir.CDAP kimyası, çok çeşitli konjugasyon reaktifleri ile kullanılmak üzere polisakkaritleri işlevselleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, ELISA'larda kullanılmak üzere polisakkaritleri biyotinillatlamak için kullanılabilir. Proteinler doğrudan CDAP ile aktive polisakkaritlere bağlanabilir, ancak bu genellikle belirli bir polisakkarit için biraz optimizasyon gerektirir.Konjugasyon verimi% 75'in üzerinde olabilir CDAP kimyasının kullanımı, örneğin Hindistan Serum Enstitüsü tarafından yapılanlar gibi düşük maliyetli konjuge aşıları etkinleştirdi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...