Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

تستند هذه المادة إلى العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم 1942418 الممنوحة ل A.S. وزمالة أبحاث الدراسات العليا التي تمنحها المؤسسة الوطنية للعلوم إلى C.M.B.H. بموجب المنحة رقم 1644760. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم. يشكر المؤلفون الدكتور نويل فيرا غونزاليس على اكتساب بيانات توصيف الحويكل الدهني. يشكر المؤلفون البروفيسور روبرت هيرت (جامعة براون) على استخدام زيتايزر. يشكر المؤلفون مرفق قياس الطيف الكتلي في جامعة براون، وعلى وجه الخصوص، الدكتور تون لي شين للمساعدة في تحديد تركيبة الدهون كميا.

1. تطوير حويصلات أحادية الدهون
<ol><li>طريقة ترطيب رقيقة<ol>
<li>إعداد وتخزين حلول مخزون الدهون ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تستخدم الكلوروفورم في غطاء الدخان الكيميائي. الكلوروفورم يجب أن يكون دائما pipetted باستخدام المذيبات آمنة ألياف الكربون ماصة نصائح. يجب دائما تخزين المحاليل التي ت?...

يسمح هذا البروتوكول بتشكيل الحويصلات الدهنية ، والبيلايات الدهنية المدعومة ، والبيلايات الدهنية المعلقة. هنا، يتم تقديم خطوات هامة لتشكيل كل من هذه الهياكل. عند تشكيل الحويصلات الدهنية ، من المهم أن تبرز فوق درجة حرارة الانتقال من الدهون39. عندما تحت درجة حرارة الانتقال ، تكو...

غشاء الخلية، وتتألف أساسا من الفوسفوليبيدات والكوليسترول والبروتينات، هو عنصر حاسم في جميع الخلايا الحية1. مع تنظيم مدفوعة amphiphilicity الدهون، غشاء الخلية يعمل كحاجز وقائي وينظم كيفية تفاعل الخلية مع البيئة المحيطة بها2. تعتمد العديد من العمليات الخلوية على تكوين الدهون والبروتين للغشاء1،2. على سبيل المثال ، تعد تفاعلات غشاء الخلية مهمة لتسليم الدواء الفعال3. يمكن أن تؤثر المستحضرات الصيدلانية والبيولوجية والمواد النانوية والسموم البيولوجية والمواد السامة البيئية على سلامة غشاء الخلية ، مما يؤثر على الوظيفة الخلوية4. بناء الخلايا المختبرية تحاكي نماذج الأغشية على أساس تكوين الدهون من أغشية الخلايا لديه القدرة على توفير أدوات سهلة لتعزيز كبير في دراسة التأثير المحتمل لهذه المواد على الخلايا.
وتشمل طبقة ثنائية الدهون النموذجية الحويصلات الدهنية، والبيدات ثنائية الدهون المدعومة، والبيدات ثنائية الدهون المعلقة. ثنائيات الدهون المدعومة هي نموذج لغشاء الخلية الفوسفولبيد شائع الاستخدام في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية حيث تمزق الحويصلات الدهنية على مادة ركيزة معتمدة5،6،7،8،9. تقنية واحدة شائعة تستخدم لرصد تشكيل ثنائي الطبقات هو الكوارتز الكريستال microbalance مع رصد تبديد (QCM-D)، الذي يدرس الامتزاز من الحويصلات بالمقارنة مع الخصائص السائلة السائبة في الموقع8،10،11،12،13،14 . سابقا, وقد استخدمت QCM-D لإثبات أنه في ظل ظروف التدفق, مرة واحدة في الحويصلات الحرجة تغطية فوسفاتيديلكولين (PC) يتحقق الحويصلات الدهنية على السطح, أنها تمزق تلقائيا إلى طبقات الدهون جامدة15. وقد حققت العمل السابق أيضا دعم تشكيل ثنائي الطبقة الدهون مع التراكيب الدهنية متفاوتة16, دمج البروتينات الدهنية17,18,19, واستخدام وسائد البوليمر 20 , تسفر عن ثنائيات الدهون المدعومة قادرة على محاكاة جوانب مختلفة منوظيفة غشاءالخلية.
وقد استخدمت ثنائيات الدهون لمحاكاة الحواجز البيولوجية المختلفة من مستويات شبه الخلوية إلى الجهاز بما في ذلك الميتوشوندريون، خلايا الدم الحمراء، وأغشية خلايا الكبد عن طريق تغيير الفوسفوليبيد والكوليسترول ومكونات الجليكوليبيد21. قد تتطلب هذه الحويصلات متعددة الدهون الأكثر تعقيدا طرقا إضافية لتحقيق تمزق الحويصلات ، اعتمادا على تكوين الدهون. على سبيل المثال، استخدمت الدراسات السابقة الببتيد α-helical (AH) المستمدة من البروتين غير الهيكلي لفيروس التهاب الكبد C 5A للحث على تشكيل طبقة ثنائية عن طريق زعزعة استقرار الحويصلات الدهنية الممتزة22،23. باستخدام هذا الببتيد AH، وقد شكلت سابقا ثنائيات الدهون المدعومة تحاكي خلايا المشيمة24. وقد أظهرت إمكانات كبيرة من bilayers الدهون المدعومة للتطبيقات الطبية الحيوية مع التحقيقات التي تمتد الجزيئية والجسيمات النانوية النقل25،26، التفاعلات البيئية السامة27، تجميع البروتين وظيفة17،18،19، ترتيب الببتيد وإدراج28،29، فحص المخدرات30، ومنصات microfluidic31.
وقد استخدمت ثنائيات الدهون المعلقة لدراسات الفحص الصيدلاني عن طريق فحص نفاذية الغشاء الاصطناعي الموازي (PAMPA) حيث يتم تعليق طبقة ثنائية الدهون عبر إدراج مسعورمسامية 32،33،34،35. وقد وضعت نماذج الدهون PAMPA لواجهات بيولوجية مختلفة بما في ذلك الدم الدماغ, buccal, الأمعاء, وواجهات عبر الجلد36. من خلال الجمع بين كل من ثنائي الطبقة الدهون المعتمدة وتقنيات PAMPA، يمكن دراسة الامتزاز، نفاذية، وتضمين المركبات داخل مكونات الدهون من الأنسجة المطلوبة أو نوع الخلية بدقة.
يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق نماذج ثنائية الطبقة الدهنية في غشاء الخلية المختبرية للتحقيق في العديد من التفاعلات الجزيئية. إعداد كل من أحادي الدهون ومتعددة الدهون أيد وعلقت ثنائيات الدهون مفصلة. لتشكيل طبقة ثنائية الدهون المدعومة ، يتم تطوير الحويصلات الدهنية لأول مرة باستخدام طرق الترطيب والقذف الرقيقة تليها التوصيف الفيزيائي الكيميائي. يتم مناقشة تشكيل ثنائي الدهون معتمد باستخدام مراقبة QCM-D وتصنيع الأغشية الدهنية المعلقة للاستخدام في PAMPA. وأخيرا، يتم فحص الحويصلات متعددة الدهون لتطوير أغشية محاكاة الخلايا الأكثر تعقيدا. باستخدام كلا النوعين من الأغشية الدهنية المصنعة ، يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام هذه الأداة لدراسة التفاعلات الجزيئية. وعموما، فإن هذه التقنية يبني الخلية تحاكي ثنائيات الدهون مع استنساخ عالية وبراعة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

أغشية الخلايا النموذجية هي أداة فحص مفيدة مع تطبيقات تتراوح بين اكتشاف الأدوية المبكرة ودراسات السمية. غشاء الخلية هو حاجز وقائي حاسم لجميع أنواع الخلايا ، وفصل المكونات الخلوية الداخلية عن البيئة خارج الخلية. وتتكون هذه الأغشية إلى حد كبير من طبقة ثنائية الدهون، والتي تحتوي على مجموعات الرأس المائية الخارجية ومجموعات الذيل الكاره للماء الداخلية، جنبا إلى جنب مع مختلف البروتينات والكوليسترول. يلعب تكوين وبنية الدهون نفسها دورا حاسما في تنظيم الوظيفة البيولوجية ، بما في ذلك التفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة الخلوية ، والتي قد تحتوي على المستحضرات الصيدلانية والسموم البيولوجية والمواد السامة البيئية. في هذه الدراسة، يتم وصف طرق لصياغة أحادي الدهون ومتعددة الدهون المدعومة والموقوفة الخلية تحاكي الطبقات ثنائية الدهون. في السابق ، تم تطوير طبقات ثنائية الدهون أحادية الدهون (PC) وكذلك ثنائيات الدهون المستوحاة من المشيمة متعددة الدهون المستوحاة من الدهون لاستخدامها في فهم التفاعلات الجزيئية. هنا، سيتم تقديم طرق لتحقيق كلا النوعين من نماذج ثنائية الطبقات. بالنسبة للخلايا التي تحاكي الطبقات الثنائية متعددة الدهون ، يتم تحديد تكوين الدهون المطلوب أولا عن طريق استخراج الدهون من الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا تليها قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل (LC-MS). باستخدام هذا التكوين ، يتم تصنيع الحويصلات الدهنية باستخدام طريقة ترطيب وبث رقيقة وتتميز قطرها الهيدروديناميكي وإمكانات زيتا. ويمكن بعد ذلك تشكيل طبقات ثنائية الدهون المدعومة والموقوفة باستخدام ميكروبالانس الكريستال الكوارتز مع رصد التبدد (QCM-D) وعلى غشاء مسامي للاستخدام في مقايسة نفاذية الغشاء الاصطناعي الموازي (PAMPA) على التوالي. النتائج التمثيلية تسليط الضوء على استنساخ وبراعة في غشاء الخلية المختبرية نماذج ثنائي الطبقة الدهون. يمكن أن تساعد الأساليب المقدمة في التقييم السريع والسهل لآليات التفاعل ، مثل النفاذ ، الامتزاز ، وتضمين جزيئات والجزيئات الكلية المختلفة مع غشاء الخلية ، مما يساعد في فحص المرشحين للأدوية والتنبؤ بالسمية الخلوية المحتملة.

هذا البروتوكول تفاصيل أساليب لتشكيل معتمدة وعلقت ثنائيات الدهون(الشكل 1). الخطوة الأولى لتشكيل ثنائي الدهون المدعومة هو تطوير الحويصلات الدهنية. يسمح الطارد المصغر بإعداد كميات صغيرة من الحويصلات الدهنية (1 مل أو أقل) ، في حين يسمح البثق الكبير بإعداد 5-50 مل من الحويصلات الد...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

يصف هذا البروتوكول تكوين خلايا تحاكي الحويصلات أحادية الدهون والدهون المتعددة، والبيلايات الدهنية المدعومة، والبيلايات الدهنية المعلقة. يمكن تكييف هذه النماذج في المختبر لدمج مجموعة متنوعة من أنواع الدهون ويمكن استخدامها للتحقيق في مختلف التفاعلات جزيء والجزيئات الكبيرة.

تجميع نماذج محاكاة الخلايا المدعومة والموقوفة ثنائية الطبقات لدراسة التفاعلات الجزيئية

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

يمكن استخدام بناء أغشية ثنائية الطبقة الدهنية الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على معلومات حاسمة حول تفاعلات الأغشية مع العوامل الصيدلانية والمواد السامة البيئية وحتى المركبات البيولوجية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصنيع أغشية متفاوتة التعقيد السائل ، وتقييم نفاذية المركب ، والامتصاص ، والتضمين داخل الأغشية. للبدء، إضافة الحجم المناسب من محلول مخزون الدهون في الزجاج النظيف الخسيس لتحقيق تركيز الحويكل النهائي من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر بعد الإماهة.إزالة الكلوروفورم من محلول الدهون، وذلك باستخدام تيار من غاز النيتروجين. لضمان إزالة الكلوروفورم بالكامل، قم بتوصيل فيلم الدهون المجفف بالفراغ لمدة أربع ساعات على الأقل. إعادة ترطيب فيلم الدهون المجففة مع حجم المطلوبة من مخزن كلوريد الصوديوم تريس لتسفر عن تركيز الحويكل النهائي من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر، ودوامة لمدة 15 إلى 30 ثانية تقريبا.نقل تعليق الحويكل في وعاء مع الثلج الجاف حتى المجمدة لمدة 30 دقيقة تقريبا. بعد أن يتم تجميد العينة تماما، إذابة التعليق في حمام مائي 30 إلى 40 درجة مئوية. دوامة تعليق الحويكل المذاب.لجعل ملليلتر واحد أو أقل من الحويصلات، والحصول على مقذوف مصغرة. قبل الرطب دعم مرشح مع المياه النقية جدا، ثم وضعه على سطح دعم الغشاء داخل حلقة O. كرر لدعم الغشاء الداخلي الثاني.وضع واحد دعم الغشاء الداخلي في الغلاف الخارجي مقذوف. ضع غشاء بولي كربونات واحد 100 نانومتر على دعم الغشاء الداخلي مباشرة عبر دعم الفلتر. ضع دعم الغشاء الداخلي الثاني في الغلاف الخارجي الخارجي للطارد مع حلقة O وجانب دعم التصفية المواجه لغشاء البولي.إرفاق البوليتيترافلوروإيثيلين تحمل في عقدة التجنيب والمسمار إغلاقه مع غلاف الخارجي مقذوف. قص البثق في كتلة التدفئة. تحميل تعليق الحويكل الدهني في واحدة من المحاقن ووضع المحاقن في كتلة الحرارة البثق، وإدراج الإبرة تماما في نهاية واحدة من البثق.أدخل الحقنة الفارغة الثانية في الجانب الآخر واقفل كلا الحقنتين باستخدام مقاطع الذراع على كتلة الحرارة. ادفع تعليق الحويصلة ببطء إلى الحقنة الفارغة ثم عد إلى الحقنة الأصلية. كرر 20 مرة أخرى لما مجموعه 21 يمر عبر غشاء البولي.نقل الحويصلات الدهنية في كوب نظيف حقير للتخزين. لقذف خمسة إلى 50 ملليلتر من الحويصلات، وتجميع البثق كبيرة عن طريق وضع دعم شاشة ثقب كبير، القرص تركزت، وأقراص استنزاف، وغشاء البولي في الفضاء في دعم أقل البثق. توصيل البثق العلوي والسفلي يدعم باستخدام مسامير الأربعة وتشديد.إرفاق وحدة البثق إلى اسطوانة عينة عن طريق تنقية إلى أسفل وتشديد مع وجع لتأمين. ملء اسطوانة عينة مع المياه فائقة البور وبث الماء من خلال وحدة البثق قبل إضافة العينة في اسطوانة العينة. إضافة تعليق الحويكل الدهون في اسطوانة عينة والمسمار أعلى مغلقة.زيادة الضغط ببطء حتى تبدأ العينة بالتنقيط من وحدة البثق بمعدل ما يقرب من 2-3 قطرات في الثانية في خسيس الزجاج النظيف. مرة واحدة وقد تم قذف جميع العينة، إيقاف إمدادات النيتروجين والإفراج عن الضغط في اسطوانة العينة عن طريق فتح صمام تخفيف الضغط ببطء. صب الحويصلات الدهنية مرة أخرى في اسطوانة العينة وتكرار الخطوة السابقة تسع مرات أخرى لما مجموعه 10 البثق.تحميل تعليق الحويكل في cuvette المناسبة، وإدراجها في أداة تشتت الضوء الديناميكي، وإدخال تفاصيل العينة، وإجراء القياس باستخدام البرامج المرتبطة بها. ضع خلية زيتا في غرفة العينة، وتأكد من اتصال الأقطاب الكهربائية، واغلق غطاء حامل العينة. في البرنامج المرتبط، أدخل تفاصيل العينة وجمع القياسات.أدخل مستشعر كريستال الكوارتز المرمز بالسيليكا في وحدة التدفق، مما يضمن محاذاة شكل T على البلورة مع شكل T على الوحدة ومسمار وحدة التدفق المغلقة. في الأدوات ذات الغرف المتعددة، يمكن تشكيل طبقات ثنائية إضافية بالتوازي. قم بتوصيل مدخل ومنفذ الأنابيب إلى وحدة تدفق ومضخة.ضع الأنابيب في الحراس القابضة واغلق غطاء نظام المحلل. ضع حاوية نفايات في منفذ المضخة لجمع الحلول المستهلكة. لإجراء التنظيف، قم بتشغيل المضخة أولا وحدد سرعة التدفق إلى 400 ميكرولتر في الدقيقة.أدخل أنابيب المدخل في مياه نقية للغاية وانسياب من خمسة إلى عشرة ملليلترات عبر الوحدة. قم بتبديل الأنابيب إلى SDS وانسياب من خمسة إلى 10 ملليلترات من خلال الوحدة. قم بتبديل الأنابيب مرة أخرى إلى مياه نقية للغاية وتدفق 10 إلى 20 ملليلتر من خلال الوحدة.وأخيرا، تدفق الهواء من خلال وحدة حتى يتم جمع أي حل المتبقية. قم بإزالة المستشعر من وحدة التدفق وشطف المستشعر بالماء النقي للغاية. محرك أجهزة الاستشعار ووحدة تدفق مع تيار غاز النيتروجين، والتأكد من أن القطب يبقى دائما خالية من أي سائل.في غطاء الدخان الكيميائي، أدخل مستشعر كريستال الكوارتز المغلف بالسيليكا في أداة تنظيف الأشعة فوق البنفسجية أو الأوزون. قم بتشغيل الجهاز واترك العلاج لمدة دقيقتين على الأقل. إزالة أجهزة الاستشعار بعناية وإعادتها إلى وحدة التدفق.تشغيل أداة محلل لربط البرامج المرتبطة بها وتعيين درجة الحرارة إلى القيمة المطلوبة لتشكيل ثنائي الدهون داعمة. السماح لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار في الإدخال المطلوب. تكوين القياس والعثور على جميع ترددات الرنين الاستشعار، وتبديد لنغمات ثلاثة وخمسة وسبعة وتسعة و11 و13 قبل بدء القياس.السماح لكلوريد الصوديوم Tris بالتدفق عبر الوحدة لمدة خمس إلى عشر دقائق، مما يضمن بقاء تغيير تردد خط الأساس أو تغيير Delta F والتبد أو قيم Delta D في السائل مستقرة. وقف المضخة، وإزالة مدخل أنابيب من محلول كلوريد الصوديوم تريس، وإدراجه بعناية في محلول الحويكل الدهون. التدفق الخلفي لمدة خمس ثوان لإزالة أي فقاعات الهواء من أنابيب مدخل، ومن ثم مواصلة تدفق إلى الأمام.أعد تشغيل القياس في البرنامج إلى صفر خط الأساس. تدفق الحويصلات الدهنية حتى يتم ملاحظة تشكيل طبقة ثنائية في الوقت الحقيقي في برنامج الحصول على البيانات. ثم كرر هذه الخطوة لتغيير أنابيب مدخل من الحويصلات الدهنية مرة أخرى إلى مخزن كلوريد الصوديوم تريس.إضافة خمسة ميكرولترات من محلول الدهون إلى مقصورة المانحة، وهو ثنائي فلوريد البولي فينيلدين مسامية 96 لوحة مرشح متعددة الشاشات بشكل جيد مع حجم المسام متر 0.45 صغيرة. غمر لوحة التصفية فورا في مقصورة المقبول، وهي لوحة استقبال نقل تحتوي على 300 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات. إضافة 200 ميكرولتر من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا إلى مقصورة المانحة النقل.اتبع الخطوات السابقة لوقف المضخة وتغيير أنابيب مدخل إلى حل الحويكل الدهون ومراقبة تشكيل ثنائي الطبقات، ثم تغيير أنابيب مدخل في حل الببتيد ألفا حل الهليكال أو AH. أدخل الحل في وحدة التدفق حتى يتم ملاحظة تغيير التردد وتبديد التغيير من إضافة الحل الجديد. وقف المضخة والسماح للببتيد AH لاحتضان مع الحويصلات لمدة 10 دقائق.تبديل مدخل الأنابيب إلى كلوريد الصوديوم تريس، وبدء تدفق لإزالة الببتيد AH من الحويصلات تمزق، مما يؤدي إلى تشكيل ناجح من طبقة ثنائية الدهون. أولا، تدفق المذيبات جزيء، ثم، تبديل أنابيب مدخل في الحل الذي يحتوي على جزيء من الفائدة وتدفق لمدة خمس دقائق على الأقل. إذا رغبت في ذلك، وقف تدفق والسماح للسائل الذي يحتوي على جزيء المطلوب لاحتضان مع طبقة ثنائية.تغيير مدخل أنابيب العودة إلى المذيب جزيء وحدها. تدفق لمدة خمس دقائق على الأقل، ثم تبديل أنابيب مدخل إلى كلوريد الصوديوم تريس، وتدفق لمدة خمس دقائق على الأقل. في البرنامج، أوقف القياس، واحفظ الملف، وتوقف المضخة.مباشرة بعد الخطوات السابقة لثنائي أحادي الدهون المعلقة أو لثنائية متعددة الدهون مع وقف التنفيذ، وإزالة برنامج تلفزيوني من مقصورة لوحة مرشح المانحة واستبدالها مع 200 ميكرولتر من حل الاختبار. غمر فورا في لوحة استقبال النقل الجديدة مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الحضانة مع هزاز لطيف لمدة ساعتين في 25 درجة مئوية، وجمع 150 ميكرولتر من الحل من مقصورات المانحة والمقبلي.قياس تركيز الجزيء في كلتا العينتين باستخدام طريقة مناسبة على أساس خصائص هذا الجزيء. تمت مقارنة الحجم والتعددية وإمكانات زيتا من حويصلات PC البيض أحادي الدهون ، واثنين من مؤلفات الحويصلات الدهنية المتعددة. وكان توزيع حجم الحويصلات PC البيض والدهون متعددة الحويصلات واحد متطابقة تقريبا.واتهم كل من البيض والكمبيوتر متعدد الدهون حويصلات واحدة سلبا، في حين تم شحنها بشكل إيجابي متعدد الدهون اثنين من الحويصلات. أحادي الدهون البيض PC vesicles امتصاصها بسهولة إلى السطح، كما هو مبين من خلال انخفاض في تغيير التردد، وزيادة في تغيير تبديد، تليها تمزق عفوية. حويصلات متعددة الدهون يمتص إلى السطح، ولكن تتطلب إضافة الببتيد AH لتمزق الحويصلات، مما أدى إلى تشكيل ثنائي الطبقة الدهون.مع ثنائيات الدهون المدعومة ، يمكن تحليل تغيير التردد وتبديد التغيير قبل وبعد إدخال مركب من الفائدة. فعلى سبيل المثال، تم التحقيق في تفاعلات DEHP وسمية بيئية مع uni المدعومة وطبقات متعددة الطبقات. ولوحظت مستويات مماثلة من امتصاص DEHP لكلا النوعين من طبقة الدهون.ومع ذلك ، لوحظت اختلافات في تغيير التبدد بين الطبقات الثنائية مع تغيير تبديد أكبر شوهد لبيضة PC bilayer مقارنة بالدهون المتعددة ذات الطبقة الثنائية. ولوحظ وجود القليل من التغلغل لكل من أحادي ومتعددة الدهون واحدة من الطبقات الثنائية. بعد هذا الإجراء، يمكن تطوير مجموعة متنوعة من الخلايا التي تحاكي الطبقات ثنائية الدهون لتمكين الفحص الخالي من الخلايا للتفاعلات الجزيئية مع مركبات تتراوح بين المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

التوليف ، والجمعية ، وتوصيف أحادي الطبقة المحمية الجسيمات النانوية الذهبية للأفلام كهربية البروتين أحادي الطبقة

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

منظمة حلزونية من الدم التخثر عامل الثامن على الدهون الأنابيب النانومترية

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...