Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Dette materiale er baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation under Grant No. 1942418 tildelt A.S., og en National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildelt C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundation's synspunkter. Forfatterne takker Dr. Noel Vera-González for lipid vesicle karakterisering dataindsamling. Forfatterne takker professor Robert Hurt (Brown University) for brugen af hans Zetasizer. Forfatterne takker Brown University Mass Spectrometry Facility, især Dr. Tun-Li Shen for hjælp til kvantificering lipid sammensætning.

1. Udvikling af uni-lipid vesikler
<ol><li>Tyndfilmshydreringsmetode<ol>
<li>Forberedelse og opbevaring af lipid lagerløsninger BEMÆRK: Alle trin ved hjælp af kloroform skal udføres i en kemisk røghætte. Kloroform bør altid pipetteres ved hjælp af opløsningsmiddelsikre kulfiberpipettespidser. Opløsninger, der indeholder kloroform, bør altid opbevares i glasglas.<ol>
<li>Forbered en 10 mg/mL lipid lageropløsning ved at tilføje den passende mængde kloroform i hætteglasset indeholder lipid pulver og blan...

Denne protokol giver mulighed for dannelse af lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Her præsenteres kritiske trin for at danne hver af disse strukturer. Når der dannes lipid vesikler, er det vigtigt at ekstrudere over overgangstemperaturen på lipid39. Når under overgangstemperaturen, lipid er fysisk til stede i sin bestilte gel fase39. I denne bestilte fase kulbrinte lipid haler er fuldt udvidet giver mulighed for tæt pakning, hvilket...

Cellemembranen, der primært består af fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en afgørende komponent i alle levende celler1. Med organisation drevet af lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer, hvordan cellen interagerer med det omgivende miljø2. Flere cellulære processer er afhængige af lipid- og proteinsammensætningen af membranen1,2. For eksempel er cellemembraninteraktioner vigtige for effektiv lægemiddellevering3. Lægemidler, biologics, nanomaterialer, biologiske toksiner og miljømæssige toksiksmidler kan påvirke integriteten af en cellemembran og derved påvirke cellulær funktion4. Konstruktionen af in vitro-celle efterligne membran modeller baseret på lipid sammensætning af cellemembraner har potentiale til at give letkøbte værktøjer til i høj grad at forbedre undersøgelsen af den potentielle indvirkning af disse materialer på celler.
Model lipid bilayers omfatter lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Understøttede lipid-bilayere er en model af den fosfolipidcellemembran , der almindeligvis anvendes i bioteknologiske applikationer , hvor lipid vesikler er bristet på et understøttet substratmateriale5,6,7,8,9. En almindelig teknik, der anvendes til at overvåge bilayer dannelse er kvarts krystal mikrobalance med spredning overvågning (QCM-D), som undersøger adsorption af vesikler i forhold til bulk flydende egenskaber in situ8,10,11,12,13,14 . Tidligere har QCM-D været brugt til at påvise, at under flowforhold, når en kritisk vesikel dækning af fosphatidylcholin (PC) lipid vesikler er opnået på overfladen, de spontant brister i stive lipid bilayers15. Tidligere arbejde har også undersøgt understøttet lipid bilayer dannelse med varierende lipid kompositioner16, inkorporering af lipid proteiner17,18,19, og udnytte polymer puder20, giver understøttede lipid bilayers i stand til at efterligne forskellige aspekter af cellemembran funktion.
Lipid bilayers er blevet brugt til at efterligne forskellige biologiske barrierer fra sub-cellulære til organniveauer, herunder mitokondrie, røde blodlegemer, og levercellemembraner ved at ændre fosfolipid, kolesterol, og glycolipid komponenter21. Disse mere komplekse multi-lipid vesikler kan kræve yderligere metoder til at opnå vesikel brud, afhængigt af lipid sammensætning. For eksempel har tidligere undersøgelser udnyttet en α-spiralformet (AH) peptid stammer fra hepatitis C virus's nonstructural protein 5A at fremkalde bilayer dannelse ved at destabilisere adsorber lipid vesikler22,23. Ved hjælp af denne AH peptid, støttede lipid bilayers efterligne placenta celler er tidligere blevet dannet24. Det store potentiale af understøttede lipid-bilayers til biomedicinske anvendelser er blevet påvist medundersøgelser,der spænder over molekylær og nanopartikler transport25,26, miljømæssige toksikantinteraktioner27, proteinsamling og funktion17,18,19, peptidarrangement og indsættelse28,29, lægemiddelscreening30og mikrofluidiske platforme31.
Suspenderet lipid bilayers er blevet brugt til farmaceutiske screening undersøgelser via en parallel kunstig membran permeabilitet assay (PAMPA), hvor en lipid bilayer er suspenderet på tværs af en porøs hydrofob skær32,33,34,35. PAMPA lipid modeller er blevet udviklet til forskellige biologiske grænseflader, herunder blod-hjerne, buccal, tarm, og depotgrænseflader36. Ved at kombinere både de understøttede lipid bilayer og PAMPA teknikker, adsorption, permeabilitet, og indlejring af forbindelser i lipid komponenter af en ønsket væv eller celletype kan grundigt studeres.
Denne protokol beskriver fremstilling og anvendelse af in vitro celle membran lipid bilayer modeller til at undersøge flere molekylære interaktioner. Forberedelse af både uni-lipid og multi-lipid understøttet og suspenderet lipid bilayers er detaljeret. For at danne en understøttet lipid bilayer, lipid vesikler er først udviklet ved hjælp af tyndfilm hydrering og ekstrudering metoder efterfulgt af fysisk-kemisk karakterisering. Dannelse af en understøttet lipid bilayer ved hjælp af QCM-D overvågning og fremstilling af suspenderede lipid membraner til brug i PAMPA diskuteres. Endelig undersøges multi-lipid vesikler til udvikling af mere komplekse cellemitkende membraner. Ved hjælp af begge typer af fabrikerede lipidmembraner viser denne protokol, hvordan dette værktøj kan bruges til at studere molekylære interaktioner. Samlet set denne teknik konstruerer celle efterligne lipid bilayers med høj reproducerbarhed og alsidighed.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Modelcellemembraner er et nyttigt screeningsværktøj med applikationer lige fra tidlig lægemiddelopdagelse til toksicitetsundersøgelser. Cellemembranen er en afgørende beskyttende barriere for alle celletyper, der adskiller de interne cellulære komponenter fra det ekstracellulære miljø. Disse membraner består i vid udstrækning af en lipid bilayer, som indeholder ydre hydrofile hovedgrupper og indre hydrofobiske halegrupper sammen med forskellige proteiner og kolesterol. Sammensætningen og strukturen af lipiderne selv spiller en afgørende rolle i reguleringen af biologisk funktion, herunder interaktioner mellem celler og det cellulære mikromiljø, som kan indeholde lægemidler, biologiske toksiner og miljømæssige toksiksmidler. I denne undersøgelse, metoder til at formulere uni-lipid og multi-lipid understøttet og suspenderet celle efterligne lipid bilayers er beskrevet. Tidligere, uni-lipid fosfatylcholin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trofoblast-inspirerede lipid bilayers blev udviklet til brug i forståelsen af molekylære interaktioner. Her vil metoder til at opnå begge typer bilayer modeller blive præsenteret. For celle efterligne multi-lipid bilayers bestemmes den ønskede lipidsammensætning først via lipidudvinding fra primære celler eller cellelinjer efterfulgt af flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjælp af denne sammensætning fremstilles lipid vesikler ved hjælp af en tyndfilmshydrering og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotentiale er karakteriseret. Understøttede og suspenderede lipid bilayers kan derefter dannes ved hjælp af kvartskrystal mikrobalance med spredning overvågning (QCM-D) og på en porøs membran til brug i en parallel kunstig membran permeabilitet assay (PAMPA), henholdsvis. De repræsentative resultater fremhæver reproducerbarhed og alsidighed af in vitro celle membran lipid bilayer modeller. De præsenterede metoder kan støtte i hurtig, let vurdering af interaktionsmekanismerne, såsom permeation, adsorption og indlejring, af forskellige molekyler og makromolekyler med en cellemembran, der hjælper med screening af lægemiddelkandidater og forudsigelse af potentiel cellulær toksicitet.

Denne protokol beskriver metoder til dannelse af understøttede og suspenderede lipid-bilayere (figur 1). Det første skridt til at danne en understøttet lipid bilayer er at udvikle lipid vesikler. Mini ekstruder giver mulighed for små mængder lipid vesikler, der skal fremstilles (1 mL eller mindre), mens den store ekstruder giver mulighed for 5-50 mL lipid vesikler, der skal fremstilles i et parti. Størrelsesfordelinger af uni-lipid vesikler dannet af enten mini eller stor ekstruder er ...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Denne protokol beskriver dannelsen af celle efterligne uni-lipid og multi-lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Disse in vitro-modeller kan tilpasses til at inkorporere en række lipidtyper og kan bruges til at undersøge forskellige molekyle- og makromolekyleinteraktioner.

Samling af cell mimicking Understøttet og suspenderet Lipid Bilayer Modeller for studiet af molekylære interaktioner

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Opførelsen af lipid bilayer membraner beskrevet i denne protokol kan bruges til at opnå vigtige oplysninger om membran interaktioner med farmaceutiske agenser, miljømæssige toksiksmidler, og endda biologiske forbindelser. Disse teknikker kan bruges til at fremstille membraner af varierende flydende kompleksitet, og til at vurdere sammensatte permeabilitet, absorption, og indlejring i membraner. Til at begynde med skal du tilføje den passende mængde lipidlageropløsning i en ren glas modbydelig for at opnå en endelig vesikelkoncentration på 2,5 milligram pr. Milliliter efter rehydrering.Fjern kloroform fra lipidopløsning ved hjælp af en strøm af nitrogengas. For at sikre fuld fjernelse af kloroform skal den tørrede lipidfilm forbindes med vakuumet i mindst fire timer. Rehydrere den tørrede lipid film med et påkrævet volumen af Tris natriumchlorid buffer til at give den endelige vesikel koncentration af 2,5 milligram per milliliter, og vortex i ca 15 til 30 sekunder.Vesikelaffjedringen overføres til en beholder med tøris, indtil den er frosset i ca. 30 minutter. Når prøven er helt frosset, optø suspensionen i en 30 til 40 grader Celsius vandbad. Hvirvles den optøede vesikel suspension.For at gøre en milliliter eller mindre af vesikler, få en mini ekstruder. Forbehandlet filterstøtte med ultra rent vand, og placer den derefter på membranens støtteflade inde i O-ringen. Gentag for den anden interne membranstøtte.Placer en intern membranstøtte i ekstruderens yderhus. Placer en 100 nanometer polycarbonatmembran på den interne membranstøtte direkte over filterstøtten. Placer den anden interne membranstøtte i ekstruderens yderhus med O-ringen, og filterstøttesiden vender mod polycarbonatmembranen.Fastgør polytetrafluoroethylenlejet i holderknuden, og skru det lukket med ekstruderens yderhus. Klip ekstruderen ind i varmeblokken. Læg lipid vesikelaffjedringen i en af sprøjterne, og placer sprøjten i ekstruderens varmeblok, og lad nålen sættes helt ind i den ene ende af ekstruderen.Sæt den anden tomme sprøjte i den modsatte side og lås begge sprøjter ved hjælp af armclipsene på varmeblokken. Skub langsomt vesikelaffjedringen ind i den tomme sprøjte og derefter tilbage i den oprindelige sprøjte. Gentag 20 gange mere for i alt 21 passerer gennem polycarbonatmembranen.Overfør lipid vesikler i en ren glas modbydelig til opbevaring. For at ekstrudere fem til 50 milliliter vesikler skal du samle den store ekstruder ved at placere den store hulskærmstøtte, centreret disk, drænskiver og polycarbonatmembran i rummet i ekstruderens nedre støtte. Tilslut ekstruder øvre og nedre støtter ved hjælp af de fire skruer og stramme.Sæt ekstruderenheden fast på prøvecylinderen ved at skrubbe den til bunden og stramme den med en skruenøgle for at sikre den. Prøvecylinderen fyldes med ultrapurt vand, og ekstruder vandet ud gennem ekstruderenheden, inden prøven tilsættes. Tilsæt lipid vesikelaffjedringen i prøvecylinderen og skru toppen lukket.Forøg langsomt trykket, indtil prøven begynder at dryppe fra ekstruderenheden med en hastighed på ca. to til tre dråber i sekundet til en ren glasrude. Når alle prøver er ekstruderet, skal du slukke for nitrogenforsyningen og frigøre trykket i prøvecylinderen ved at åbne trykaflastningsventilen langsomt. Hæld lipid vesikler tilbage i prøven cylinder og gentag tidligere trin ni gange mere for i alt 10 ekstrudering.Indlæs vesikelaffjedringen i den relevante cuvette, og sæt den i det dynamiske lysspredningsinstrument, indtast prøvedetaljerne, og udfør målingen ved hjælp af den tilhørende software. Anbring zetacellen i prøvekammeret, så elektroderne er i kontakt, og luk prøveholderlåget. I den tilhørende software skal du indtaste prøveoplysningerne og indsamle målinger.Sæt silicakodet kvartskrystalsensor i flowmodulet, så T-formen på krystallen flugter med T-formen på modulet og skru flowmodulet lukket. I instrumenter med flere kamre kan yderligere bilayers dannes parallelt. Tilslut indløbs- og udløbsrør til flowmodulet og pumpen.Placer slangen i holderne og luk låget på analysatorsystemet. Placer en affaldsbeholder ved pumpens udløb for at indsamle brugte løsninger. For at udføre rengøringen skal du først tænde for pumpen og indstille strømningshastigheden til 400 mikroliter i minuttet.Sæt indløbsslangen i ultra rent vand og flow fem til 10 milliliter gennem modulet. Skift slanger til SDS og flow fem til 10 milliliter gennem modulet. Skift slange tilbage til ultra rent vand og flow 10 til 20 milliliter gennem modulet.Til sidst strømmer luft gennem modulet, indtil der ikke er indsamlet nogen resterende løsning. Fjern sensoren fra flowmodulet, og skyl sensoren med ultra rent vand. Kør sensoren og flowmodulet med en nitrogengasstrøm, og sørg for, at elektroden altid forbliver fri for væske.I en kemisk røghætte skal du indsætte den silicabelagte kvartskrystalsensor i et ultraviolet eller ozonrensningsinstrument. Tænd instrumentet og lad behandlingen være i mindst to minutter. Fjern sensorerne forsigtigt, og sæt dem tilbage i flowmodulet.Tænd analysatorinstrumentet for at forbinde den tilknyttede software og indstille temperaturen til den ønskede værdi for at danne den støttende lipid bilayer. Lad temperaturen stabilisere sig til den ønskede indgang. Konfigurer målingen, og find alle sensorretroensfrekvenser, og forsvind for overtoner tre, fem, syv, ni, 11 og 13, før målingen startes.Lad Tris natriumchlorid strømme gennem modulet i fem til 10 minutter, hvilket sikrer, at baselinefrekvensen ændres eller Delta F og spredes eller Delta D-værdierne i væske forbliver stabile. Stop pumpen, fjern indløbsslangen fra Tris natriumchloridopløsningen, og sæt den forsigtigt i lipid vesikelopløsningen. Tilbagestrømning i fem sekunder for at fjerne eventuelle luftbobler fra indløbsslangen og derefter fortsætte fremadstrømmen.Genstart målingen i softwaren for at nulstille grundlinjen. Flow lipid vesikler indtil bilayer dannelse er observeret i realtid i dataindsamling software. Gentag derefter dette trin for at ændre indløbsrør fra lipid vesikler tilbage til Tris natriumchlorid buffer.Tilsæt fem mikroliter af lipidopløsningen til donorrummet, som er en porøs polyvinyliden difluoride 96 godt multiskærmsfilterplade med 0,45 mikrometer porestørrelse. Dyk straks filterpladen ned i acceptorrummet, som er en transportmodtagerplade, der indeholder 300 mikroliter fosfatbufferet saltvand. Tilsæt 200 mikroliter fosfatbufferet saltvand til transportdonorrummet.Følg tidligere trin for at stoppe pumpen og ændre indløbsrør til lipid vesikelopløsning og observere bilayerdannelse, og skift derefter indløbsrørene til alfa-spiral- eller AH-peptidopløsningen. Indfør opløsningen i flowmodulet, indtil frekvensændringen og spredningsændringen observeres fra den nye løsningstilsætning. Stop pumpen og lad AH peptid inkubere med vesiklerne i 10 minutter.Skift indløbsrørene til Tris natriumchlorid, og start strømmen for at fjerne AH-peptid fra de bristede vesikler, hvilket fører til vellykket dannelse af en lipid-bilayer. Først skal du flyde molekylet solvent, derefter skifte indløb slangen i opløsningen, der indeholder molekylet af interesse og flow i mindst fem minutter. Hvis det ønskes, stop strømmen og lad væsken indeholdende det ønskede molekyle inkubere med bilayeren.Skift indløbsrøret tilbage til molekyleopløsningsmidlet alene. Flow i mindst fem minutter, derefter skifte indløb slanger i Tris natriumchlorid, og flow i mindst fem minutter. Stop målingen i softwaren, gem filen, og stop pumpen.Umiddelbart efter tidligere trin for en uni-lipid suspenderet bilayer eller for en multi-lipid suspenderet bilayer, fjerne PBS fra donor filterplade rum og erstatte med 200 mikroliter af testopløsningen. Umiddelbart nedsænkes i en ny transportmodtagerplade med 300 mikroliter PBS. Efter inkubation med blid vuggen i to timer ved 25 grader Celsius, opsamle 150 mikroliter af opløsningen fra donoren og acceptor rum.Mål molekylekoncentrationen i begge prøver ved hjælp af en passende metode baseret på egenskaberne af dette molekyle. Størrelse, polydispersitet, og Zeta potentiale Uni-lipid æg PC vesikler, og to multi lipid vesikel kompositioner blev sammenlignet. Størrelsen fordeling af æg pc vesikler og multi lipid en vesikler var næsten identiske.Både æg og PC multi-lipid en vesikler blev negativt opladet, mens multi-lipid to vesikler blev positivt opladet. Uni-lipid æg PC vesikler let absorberes til overfladen, som det fremgår af faldet i frekvensændring, og stigning i spredning forandring, efterfulgt af spontane brud. Multi-lipid vesikler absorberes til overfladen, men kræver tilsætning af AH peptid til briste vesikler, hvilket resulterer i lipid bilayer dannelse.Med understøttede lipid bilayers, frekvensændring og spredning ændring kan analyseres før og efter indførelsen af en renteforbindelse. For eksempel blev interaktioner mellem DEHP og miljøtoksisk middel med understøttet uni og flerlags af lag undersøgt. Lignende niveauer af DEHP absorption blev observeret for begge lipid bilayer typer.Men, forskelle i spredning ændring blev observeret mellem bilayers med en større spredning ændring set for æg PC bilayer i forhold til multi lipid en bilayer. Lidt permeation blev observeret for både uni-og multi-lipid en bilayers. Efter denne procedure, en række celle efterligne lipid bilayers kan udvikles for at muliggøre cellefri screening af molekylære interaktioner med forbindelser lige fra lægemidler til miljømæssige toksiksmidler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Vedhæftning Frekvens Assay for In Situ Kinetics Analyse af Cross-Junctional molekylære interaktioner i celle-celle-grænseflade

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Tandhjulsgear Organization of Blood koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Udarbejdelse af Mica Understøttet lipiddobbeltlagenes for High Resolution optisk mikroskopi Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Udarbejdelse af 3D Kollagen Gels og mikrokanalerne for Studiet af 3D Interactions<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatiseret lipiddobbeltlagsmembranen Formation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...