Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No. 1942418 toegekend aan AS, en een National Science Foundation Graduate Research Fellowship toegekend aan C.M.B.H., onder Grant No. 1644760. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation. De auteurs bedanken Dr. Noel Vera-González voor lipide vesikel karakterisering data acquisitie. De auteurs bedanken professor Robert Hurt (Brown University) voor het gebruik van zijn Zetasizer. De auteurs bedanken de Brown University Mass Spectrometry Facility, in het bijzonder Dr. Tun-Li Shen voor hulp bij het kwantificeren van de lipidensamenstelling.

1. Het ontwikkelen van uni-lipide blaasjes
<ol><li>Dunnefilmhydratatiemethode<ol>
<li>Bereiding en opslag van lipidenbestandsoplossingen OPMERKING: Alle stappen met chloroform moeten worden uitgevoerd in een chemische zuurkast. Chloroform moet altijd worden gepipetteerd met behulp van oplosmiddelveilige koolstofvezelpipetpunten. Oplossingen die chloroform bevatten, moeten altijd in glazen injectieflacons worden bewaard.<ol>
<li>Bereid een lipidenbouillonoplossing van 10 mg/ml door het juiste volume chloroform toe te...

Dit protocol zorgt voor de vorming van lipideblaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd om elk van deze structuren te vormen. Bij het vormen van lipideblaasjes is het belangrijk om boven de overgangstemperatuur van het lipide uit te extruderen39. Wanneer het onder de overgangstemperatuur ligt, is het lipide fysiek aanwezig in de geordende gelfase39. In deze geordende fase zijn de koolwaterstoflipidens...

Het celmembraan, voornamelijk samengesteld uit fosfolipiden, cholesterol en eiwitten, is een cruciaal onderdeel van alle levende cellen1. Met organisatie gedreven door lipide amfififilie, functioneert het celmembraan als een beschermende barrière en reguleert het hoe de cel interageert met zijn omgeving2. Verschillende cellulaire processen zijn afhankelijk van de lipide- en eiwitsamenstelling van hetmembraan 1,2. Celmembraaninteracties zijn bijvoorbeeld belangrijk voor effectieve medicijnafgifte3. Farmaceutische producten, biologische geneesmiddelen, nanomaterialen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen de integriteit van een celmembraan beïnvloeden, waardoor de cellulaire functie wordt beïnvloed4. De constructie van in vitro cel nabootsende membraanmodellen op basis van de lipidesamenstelling van celmembranen heeft het potentieel om gemakkelijke hulpmiddelen te bieden om de studie van de potentiële impact van deze materialen op cellen aanzienlijk te verbeteren.
Model lipide bilayers omvatten lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers, en gesuspendeerde lipide bilayers. Ondersteunde lipide bilayers zijn een model van het fosfolipide celmembraan dat vaak wordt gebruikt in biotechnologische toepassingen waarbij lipideblaasjes worden gescheurd op een ondersteund substraatmateriaal5,6,7,8,9. Een veelgebruikte techniek om de vorming van twee lagen te monitoren is kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D), die de adsorptie van blaasjes onderzoekt in vergelijking met de bulkvloeistofeigenschappen in situ8,10,11,12,13,14 . Eerder is QCM-D gebruikt om aan te tonen dat onder stroomomstandigheden, zodra een kritische blaasjesdekking van fosfatidylcholine (PC) lipideblaasjes op het oppervlak wordt bereikt, ze spontaan scheuren in stijve lipide bilayers15. Eerder werk heeft ook de vorming van ondersteunde lipide bilayer onderzocht met verschillende lipidesamenstellingen16, opname van lipide-eiwitten17,18,19en het gebruik van polymeerkussens20, wat ondersteunde lipide bilayers oplevert die in staat zijn om verschillende aspecten van de celmembraanfunctie na te bootsen.
Lipide bilayers zijn gebruikt om verschillende biologische barrières na te bootsen van subcellulaire tot orgaanniveaus, waaronder mitochondrion, rode bloedcel en levercelmembranen door de fosfolipide-, cholesterol- en glycolipidecomponenten te veranderen21. Deze complexere multi-lipide blaasjes kunnen aanvullende methoden vereisen om vesikelruptuur te bereiken, afhankelijk van de lipidesamenstelling. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld een α-spiraalvormig (AH) peptide gebruikt dat is afgeleid van het niet-structurele eiwit 5A van het hepatitis C-virus om dubbellaagse vorming te induceren door de geadsorbeerde lipidenblaasjes te destabiliseren22,23. Met behulp van dit AH-peptide zijn eerder ondersteunde lipide bilayers gevormd die placentacellen nabootsen24. Het grote potentieel van ondersteunde lipide bilayers voor biomedische toepassingen is aangetoond met onderzoeken die moleculair en nanodeeltjestransportomvatten 25,26,omgevingstoxische interacties27,eiwitassemblage en -functie17,18,19,peptide-arrangement en insertie28,29,medicijnscreening30en microfluïdische platforms31.
Gesuspendeerde lipide bilayers zijn gebruikt voor farmaceutische screeningstudies via een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA) waarbij een lipide bilayer wordt gesuspendeerd over een poreuze hydrofobe insert32,33,34,35. PAMPA lipide modellen zijn ontwikkeld voor verschillende biologische interfaces, waaronder de bloed-hersenen, buccale, intestinale en transdermale interfaces36. Door zowel de ondersteunde lipide bilayer als PAMPA technieken te combineren, kunnen adsorptie, permeabiliteit en inbedding van verbindingen in lipidecomponenten van een gewenst weefsel- of celtype grondig worden bestudeerd.
Dit protocol beschrijft de fabricage en toepassing van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen om verschillende moleculaire interacties te onderzoeken. Voorbereiding van zowel uni-lipide als multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers is gedetailleerd. Om een ondersteunde lipide bilayer te vormen, worden lipideblaasjes eerst ontwikkeld met behulp van dunne-film hydratatie- en extrusiemethoden gevolgd door fysisch-chemische karakterisering. Vorming van een ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D monitoring en fabricage van gesuspendeerde lipidembranen voor gebruik in PAMPA wordt besproken. Ten slotte worden multi-lipide blaasjes voor de ontwikkeling van complexere celnabootsende membranen onderzocht. Met behulp van beide soorten gefabriceerde lipidemembranen laat dit protocol zien hoe deze tool kan worden gebruikt om moleculaire interacties te bestuderen. Over het algemeen construeert deze techniek cel nabootsende lipide bilayers met een hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Modelcelmembranen zijn een nuttig screeningsinstrument met toepassingen variërend van vroege ontdekking van geneesmiddelen tot toxiciteitsstudies. Het celmembraan is een cruciale beschermende barrière voor alle celtypen, die de interne cellulaire componenten scheidt van de extracellulaire omgeving. Deze membranen bestaan grotendeels uit een lipide bilayer, die buitenste hydrofiele kopgroepen en binnenste hydrofobe staartgroepen bevat, samen met verschillende eiwitten en cholesterol. De samenstelling en structuur van de lipiden zelf spelen een cruciale rol bij het reguleren van de biologische functie, inclusief interacties tussen cellen en de cellulaire micro-omgeving, die geneesmiddelen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen bevatten. In deze studie worden methoden beschreven om uni-lipide en multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde cel nabootsende lipide bilayers te formuleren. Eerder werden uni-lipide fosfatidylcholine (PC) lipide bilayers en multi-lipid placentale trophoblast-geïnspireerde lipide bilayers ontwikkeld voor gebruik bij het begrijpen van moleculaire interacties. Hier zullen methoden voor het bereiken van beide soorten tweelaagse modellen worden gepresenteerd. Voor celimitoren met meerdere lipiden wordt de gewenste lipidesamenstelling eerst bepaald via lipide-extractie uit primaire cellen of cellijnen, gevolgd door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Met behulp van deze samenstelling worden lipideblaasjes vervaardigd met behulp van een dunne film hydratatie- en extrusiemethode en hun hydrodynamische diameter en zeta-potentieel worden gekarakteriseerd. Ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers kunnen vervolgens worden gevormd met behulp van kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D) en op een poreus membraan voor gebruik in een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA), respectievelijk. De representatieve resultaten benadrukken de reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen. De gepresenteerde methoden kunnen helpen bij een snelle, gemakkelijke beoordeling van de interactiemechanismen, zoals permeatie, adsorptie en inbedding, van verschillende moleculen en macromoleculen met een celmembraan, wat helpt bij de screening van kandidaat-geneesmiddelen en voorspelling van potentiële cellulaire toxiciteit.

Dit protocol beschrijft methoden voor het vormen van ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers (Figuur 1). De eerste stap naar het vormen van een ondersteunde lipide bilayer is het ontwikkelen van lipideblaasjes. Met de mini-extruder kunnen kleine volumes lipideblaasjes worden bereid (1 ml of minder), terwijl de grote extruder het mogelijk maakt om 5-50 ml lipideblaasjes in één batch te bereiden. Grootteverdelingen van uni-lipide blaasjes gevormd door de mini- of grote extruder worden...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

De constructie van lipide dubbellaagse membranen beschreven in dit protocol kan worden gebruikt om cruciale informatie te verkrijgen over membraaninteracties met farmaceutische agentia, milieutoxische stoffen en zelfs biologische verbindingen. Deze technieken kunnen worden gebruikt om membranen van verschillende vloeistofcomplexiteit te fabriceren en om de permeabiliteit, absorptie en inbedding van verbindingen in membranen te beoordelen. Voeg om te beginnen het juiste volume lipidenbouillonoplossing toe aan een schoon glas vile om een uiteindelijke blaasjesconcentratie van 2,5 milligram per milliliter na rehydratatie te bereiken.Verwijder chloroform uit lipide-oplossing met behulp van een stroom stikstofgas. Om ervoor te zorgen dat chloroform volledig wordt verwijderd, sluit u de gedroogde lipidefilm gedurende ten minste vier uur aan op het vacuüm. Rehydrateer de gedroogde lipidefilm met een vereist volume Tris natriumchloridebuffer om de uiteindelijke blaasjesconcentratie van 2,5 milligram per milliliter en vortex gedurende ongeveer 15 tot 30 seconden te verkrijgen.Breng de suspensie van het blaasje over in een container met droogijs totdat het ongeveer 30 minuten bevroren is. Nadat het monster volledig is ingevroren, ontdooit u de suspensie in een waterbad van 30 tot 40 graden Celsius. Vortex de ontdooide blaasjessuspensie.Om een milliliter of minder blaasjes te maken, krijgt u een mini-extruder. Maak een filtersteun voor met ultrazuiver water en plaats deze vervolgens op het membraansteunoppervlak in de O-ring. Herhaal dit voor de tweede interne membraanondersteuning.Plaats één interne membraansteun in de buitenbehuizing van de extruder. Plaats één polycarbonaatmembraan van 100 nanometer op de interne membraansteun direct boven de filtersteun. Plaats de tweede interne membraansteun in de buitenbehuizing van de extruder met de O-ring en filtersteunzijde naar het polycarbonaatmembraan gericht.Bevestig het polytetrafluorethyleenlager in de retainerknoop en schroef het dicht met de buitenbehuizing van de extruder. Klem de extruder in het verwarmingsblok. Laad de lipidenblaasjessuspensie in een van de spuiten en plaats de spuit in het warmteblok van de extruder, waarbij de naald volledig in het ene uiteinde van de extruder wordt ingebracht.Steek de tweede lege spuit in de andere kant en vergrendel beide spuiten met behulp van de armclips op het warmteblok. Duw de blaasjessuspensie langzaam in de lege spuit en vervolgens terug in de originele spuit. Herhaal nog 20 keer voor een totaal van 21 passages door het polycarbonaatmembraan.Breng de lipideblaasjes over in een schoon glas voor opslag. Om vijf tot 50 milliliter blaasjes te extruderen, monteert u de grote extruder door de grote gatschermsteun, gecentreerde schijf, afvoerschijven en polycarbonaatmembraan in de ruimte in de onderste ondersteuning van de extruder te plaatsen. Sluit de bovenste en onderste steunen van de extruder aan met behulp van de vier schroeven en draai deze vast.Bevestig de extrudereenheid aan de monstercilinder door deze aan de onderkant te schrobben en vast te draaien met een moersleutel om vast te zetten. Vul de monstercilinder met ultrapuur water en extrudeer het water door de extrudereenheid voordat u het monster in de monstercilinder toevoegt. Voeg de lipidenblaasjessuspensie toe aan de monstercilinder en schroef de bovenkant dicht.Verhoog langzaam de druk totdat het monster met een snelheid van ongeveer twee tot drie druppels per seconde uit de extrudereenheid in een schoon glas begint te druppelen. Zodra al het monster is geëxtrudeerd, schakelt u de stikstoftoevoer uit en laat u de druk in de monstercilinder los door de overdrukklep langzaam te openen. Giet de lipidenblaasjes terug in de monstercilinder en herhaal de vorige stap nog negen keer voor een totaal van 10 extrusies.Laad de vesikelsuspensie in de juiste cuvette en plaats deze in het dynamische lichtverstrooiingsinstrument, voer de monsterdetails in en voer de meting uit met behulp van de bijbehorende software. Plaats de zetacel in de monsterkamer, zorg ervoor dat de elektroden in contact komen en sluit het deksel van de monsterhouder. Voer in de bijbehorende software de monstergegevens in en verzamel metingen.Plaats de silicagecodeerde kwartskristalsensor in de stroommodule, zorg ervoor dat de T-vorm op het kristal overeenkomt met de T-vorm op de module en schroef de stroommodule dicht. In instrumenten met meerdere kamers kunnen parallel extra dubbellagen worden gevormd. Sluit de inlaat- en uitlaatbuizen aan op de debietmodule en de pomp.Plaats de slang in de beschermers en sluit het deksel van het analysesysteem. Plaats een afvalcontainer aan de uitlaat van de pomp om gebruikte oplossingen op te halen. Om de reiniging uit te voeren, zet u eerst de pomp aan en stelt u de stroomsnelheid in op 400 microliter per minuut.Plaats de inlaatbuis in ultrazuiver water en stroom vijf tot 10 milliliter door de module. Schakel de slang over naar SDS en stroom vijf tot 10 milliliter door de module. Schakel de buizen terug in ultrazuiver water en stroom 10 tot 20 milliliter door de module.Laat ten slotte lucht door de module stromen totdat er geen resterende oplossing is verzameld. Verwijder de sensor uit de stromingsmodule en spoel de sensor af met ultrazuiver water. Bedien de sensor en de stromingsmodule met een stikstofgasstroom en zorg ervoor dat de elektrode altijd vrij blijft van vloeistof.Plaats in een chemische zuurkast de met silica gecoate kwartskristalsensor in een ultraviolet of ozonreinigingsinstrument. Zet het instrument aan en laat de behandeling minstens twee minuten toe. Verwijder de sensoren voorzichtig en breng ze terug in de flowmodule.Schakel het analyse-instrument in om de bijbehorende software aan te sluiten en de temperatuur in te stellen op de gewenste waarde voor het vormen van de ondersteunende lipide bilayer. Laat de temperatuur stabiliseren tot de gewenste ingang. Configureer de meting en zoek alle sensorresonantiefrequenties en dissipatie voor boventonen drie, vijf, zeven, negen, 11 en 13 voordat u met de meting begint.Laat Tris-natriumchloride gedurende vijf tot 10 minuten door de module stromen en zorg ervoor dat de basisfrequentieverandering of Delta F- en dissipatieverandering of Delta D-waarden in vloeistof stabiel blijven. Stop de pomp, verwijder de inlaatslang uit de Tris natriumchlorideoplossing en breng deze voorzichtig in de lipidenblaasoplossing. Terugstroom gedurende vijf seconden om eventuele luchtbellen uit de inlaatbuis te verwijderen en vervolgens de voorwaartse stroom voort te zetten.Start de meting opnieuw in de software om de basislijn op nul te zetten. Stroming lipide blaasjes tot dubbellaagse vorming wordt waargenomen in real time in de data-acquisitie software. Herhaal vervolgens deze stap om de inlaatbuis van lipideblaasjes terug te veranderen in Tris natriumchloridebuffer.Voeg vijf microliter van de lipide-oplossing toe aan het donorcompartiment, een poreuze polyvinylideendifluoride 96 goed multi-screen filterplaat met een poriegrootte van 0,45 micrometer. Dompel de filterplaat onmiddellijk onder in het acceptorcompartiment, een transportontvangerplaat met 300 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing. Voeg 200 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing toe aan het transportdonorcompartiment.Volg eerdere stappen van het stoppen van de pomp en het veranderen van de inlaatbuis in lipideblaasoplossing en het observeren van dubbellaagse vorming, en verander vervolgens de inlaatbuis in de alfa-spiraalvormige of AH-peptide-oplossing. Introduceer de oplossing in de stroommodule totdat frequentieverandering en dissipatieverandering worden waargenomen door de nieuwe oplossingstoevoeging. Stop de pomp en laat het AH-peptide gedurende 10 minuten incuberen met de blaasjes.Schakel de inlaatbuis in Tris-natriumchloride en start de stroom om het AH-peptide uit de gescheurde blaasjes te verwijderen, wat leidt tot een succesvolle vorming van een lipide bilayer. Laat eerst het molecuulopoplot stromen, schakel vervolgens de inlaatbuis in de oplossing met het molecuul van belang en stroom gedurende ten minste vijf minuten. Stop desgewenst de stroom en laat de vloeistof met het gewenste molecuul incuberen met de dubbellaag.Verander de inlaatslang terug naar het molecuuloplosmiddel alleen. Stroom gedurende ten minste vijf minuten, schakel vervolgens de inlaatbuis in Tris-natriumchloride en stroom gedurende ten minste vijf minuten. Stop in de software de meting, sla het bestand op en stop de pomp.Verwijder onmiddellijk na eerdere stappen voor een uni-lipide gesuspendeerde bilaag of voor een multi-lipide gesuspendeerde bilayer PBS uit het donorfilterplaatcompartiment en vervang door 200 microliter van de testoplossing. Dompel onmiddellijk onder in een nieuwe transportontvangerplaat met 300 microliter PBS. Na incubatie met zacht schommelen gedurende twee uur bij 25 graden Celsius, verzamel 150 microliter van de oplossing uit de donor- en acceptorcompartimenten.Meet de molecuulconcentratie in beide monsters met behulp van een geschikte methode op basis van de eigenschappen van dit molecuul. Grootte, polydispersiteit en Zeta-potentieel van Uni-lipide ei PC-blaasjes en twee multi-lipide blaasjessamenstellingen werden vergeleken. De grootteverdeling van de ei-pc-blaasjes en multi-lipide één blaasjes waren bijna identiek.Zowel ei als PC multi-lipide één blaasjes waren negatief geladen, terwijl multi-lipide twee blaasjes positief geladen waren. Uni-lipide ei-pc-blaasjes gemakkelijk geabsorbeerd naar het oppervlak, zoals blijkt uit de afname van de frequentieverandering en de toename van de dissipatieverandering, gevolgd door spontane breuk. Multi-lipide blaasjes geabsorbeerd naar het oppervlak, maar vereisen de toevoeging van AH-peptide om de blaasjes te scheuren, wat resulteert in lipide bilayer vorming.Met ondersteunde lipide bilayers kunnen frequentieverandering en dissipatieverandering worden geanalyseerd voor en na introductie van een samengestelde stof van belang. Zo werden interacties van DEHP en omgevingstoxische stof met ondersteunde uni- en meerlagige lagen onderzocht. Vergelijkbare niveaus van DEHP-absorptie werden waargenomen voor beide lipide bilayer types.Er werden echter verschillen in dissipatieverandering waargenomen tussen de bilayers met een grotere dissipatieverandering die werd waargenomen voor de egg PC bilayer in vergelijking met de multi lipid one bilayer. Er werd weinig permeatie waargenomen voor zowel uni- als multi-lipide één-dubbellagen. Na deze procedure kan een verscheidenheid aan celimitoren voor lipide bilayers worden ontwikkeld om celvrije screening van moleculaire interacties met verbindingen, variërend van farmaceutische tot milieutoxische stoffen, mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...