Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
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Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n ° 1942418 attribuée à A.S., et une bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation décernée à C.M.B.H., sous la subvention n ° 1644760. Toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation. Les auteurs remercient le Dr Noel Vera-González pour l’acquisition de données sur la caractérisation des vésicules lipidiques. Les auteurs remercient le professeur Robert Hurt (Brown University) pour l’utilisation de son Zetasizer. Les auteurs remercient le Centre de spectrométrie de masse de l’Université Brown, en particulier le Dr Tun-Li Shen pour son aide à quantifier la composition lipidique.

1. Développer des vésicules unilipidiques
<ol><li>Méthode d’hydratation en couche mince<ol>
<li>Préparation et stockage de solutions mères lipidiques REMARQUE: Toutes les étapes d’utilisation du chloroforme doivent être effectuées dans une hotte chimique. Le chloroforme doit toujours être pipeté à l’aide d’embouts de pipette en fibre de carbone sans danger pour les solvants. Les solutions contenant du chloroforme doivent toujours être stockées dans des flacons en verre.<ol>
<li>Préparer une sol...

Ce protocole permet la formation de vésicules lipidiques, de bicouches lipidiques soutenues et de bicouches lipidiques en suspension. Ici, des étapes critiques sont présentées pour former chacune de ces structures. Lors de la formation de vésicules lipidiques, il est important d’extruder au-dessus de la température de transition du lipide39. Lorsqu’il est en dessous de la température de transition, le lipide est physiquement présent dans sa phase de gel ordonnée39</s...

La membrane cellulaire, composée principalement de phospholipides, de cholestérol et de protéines, est un composant crucial de toutes les cellules vivantes1. Avec une organisation guidée par l’amphiphilie lipidique, la membrane cellulaire fonctionne comme une barrière protectrice et régule la façon dont la cellule interagit avec son environnementenvironnant 2. Plusieurs processus cellulaires dépendent de la composition lipidique et protéique de la membrane1,2. Par exemple, les interactions de la membrane cellulaire sont importantes pour une administration efficace des médicaments3. Les produits pharmaceutiques, les produits biologiques, les nanomatériaux, les toxines biologiques et les toxiques environnementaux peuvent avoir un impact sur l’intégrité d’une membrane cellulaire, affectant ainsi la fonction cellulaire4. La construction de modèles membranaires imitant les cellules in vitro basés sur la composition lipidique des membranes cellulaires a le potentiel de fournir des outils faciles pour améliorer considérablement l’étude de l’impact potentiel de ces matériaux sur les cellules.
Les bicouches lipidiques modèles comprennent les vésicules lipidiques, les bicouches lipidiques supportées et les bicouches lipidiques en suspension. Les bicouches lipidiques supportées sont un modèle de la membrane cellulaire phospholipide couramment utilisée dans les applications biotechnologiques où les vésicules lipidiques sont rompues sur un matériau de substratsupporté5,6,7,8,9. Une technique couramment utilisée pour surveiller la formation de bicouches est la microbalance de cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D), qui examine l’adsorption des vésicules par rapport aux propriétés liquides en vrac in situ8,10,11,12,13,14 . Auparavant, QCM-D a été utilisé pour démontrer que dans des conditions d’écoulement, une fois qu’une couverture vésiculaire critique des vésicules lipidiques phosphatidylcholine (PC) est obtenue à la surface, elles se rompent spontanément en bicouches lipidiques rigides15. Des travaux antérieurs ont également étudié la formation de bicouches lipidiques soutenues avec des compositions lipidiques variables16,l’incorporation de protéines lipidiques17,18,19et l’utilisation de coussins polymères20,produisant des bicouches lipidiques supportées capables d’imiter divers aspects de la fonction de la membrane cellulaire.
Les bicouches lipidiques ont été utilisées pour imiter diverses barrières biologiques allant des niveaux subcellulaires aux niveaux d’organes, y compris la mitochondrie, les globules rouges et les membranes des cellules hépatiques en modifiant les composants phospholipides, cholestérol et glycolipides21. Ces vésicules multilipidiques plus complexes peuvent nécessiter des méthodes supplémentaires pour obtenir une rupture de vésicule, en fonction de la composition lipidique. Par exemple, des études antérieures ont utilisé un peptide α-hélicoïdal (AH) dérivé de la protéine non structurelle 5A du virus de l’hépatite C pour induire la formation de bicouches en déstabilisant les vésicules lipidiques adsorbées22,23. En utilisant ce peptide AH, des bicouches lipidiques supportées imitant les cellules placentaires ont déjà été formées24. Le grand potentiel des bicouches lipidiques supportées pour des applications biomédicales a été démontré avec des études couvrant le transport moléculaire et de nanoparticules25,26, les interactions toxiquesenvironnementales 27, l’assemblage et la fonction des protéines17,18,19, l’arrangement et l’insertion peptidiques28,29, le dépistage demédicaments 30, et les plates-formes microfluidiques31.
Les bicouches lipidiques en suspension ont été utilisées pour des études de criblage pharmaceutique via un test parallèle de perméabilité de la membrane artificielle (PAMPA) où une bicouche lipidique est suspendue à travers un insert hydrophobe poreux32,33,34,35. Des modèles lipidiques PAMPA ont été développés pour différentes interfaces biologiques, y compris les interfaces sang-cerveau, buccale, intestinale et transdermique36. En combinant à la fois les techniques de bicouche lipidique et de PAMPA, l’adsorption, la perméabilité et l’incorporation de composés dans les composants lipidiques d’un type de tissu ou de cellule souhaité peuvent être étudiés en profondeur.
Ce protocole décrit la fabrication et l’application de modèles de bicouches lipidiques de membrane cellulaire in vitro pour étudier plusieurs interactions moléculaires. La préparation des bicouches unilipidiques et multilipidiques soutenues et en suspension est détaillée. Pour former une bicouche lipidique supportée, les vésicules lipidiques sont d’abord développées en utilisant des méthodes d’hydratation et d’extrusion en couche mince suivies d’une caractérisation physico-chimique. La formation d’une bicouche lipidique supportée à l’aide de la surveillance QCM-D et la fabrication de membranes lipidiques en suspension pour une utilisation dans PAMPA est discutée. Enfin, les vésicules multilipidiques pour le développement de membranes imitant des cellules plus complexes sont examinées. En utilisant les deux types de membranes lipidiques fabriquées, ce protocole démontre comment cet outil peut être utilisé pour étudier les interactions moléculaires. Dans l’ensemble, cette technique construit des bicouches lipidiques imitant les cellules avec une reproductibilité et une polyvalence élevées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Les membranes cellulaires modèles sont un outil de dépistage utile avec des applications allant de la découverte précoce de médicaments aux études de toxicité. La membrane cellulaire est une barrière protectrice cruciale pour tous les types de cellules, séparant les composants cellulaires internes de l’environnement extracellulaire. Ces membranes sont composées en grande partie d’une bicouche lipidique, qui contient des groupes de tête hydrophile externe et des groupes de queue hydrophobes internes, ainsi que diverses protéines et cholestérol. La composition et la structure des lipides eux-mêmes jouent un rôle crucial dans la régulation de la fonction biologique, y compris les interactions entre les cellules et le microenvironnement cellulaire, qui peut contenir des produits pharmaceutiques, des toxines biologiques et des toxiques environnementaux. Dans cette étude, des méthodes pour formuler des bicouches unilipidiques et multilipidiques soutenues et en suspension imitant les cellules lipidiques sont décrites. Auparavant, des bicouches lipidiques unilipidiques phosphatidylcholine (PC) ainsi que des bicouches lipidiques multilipidiques inspirées du trophoblaste placentaire ont été développées pour être utilisées dans la compréhension des interactions moléculaires. Ici, les méthodes pour réaliser les deux types de modèles bicouches seront présentées. Pour les cellules imitant les bicouches multilipidiques, la composition lipidique souhaitée est d’abord déterminée par extraction lipidique à partir de cellules primaires ou de lignées cellulaires, suivie d’une chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). En utilisant cette composition, les vésicules lipidiques sont fabriquées à l’aide d’une méthode d’hydratation et d’extrusion en couche mince et leur diamètre hydrodynamique et leur potentiel zêta sont caractérisés. Les bicouches lipidiques supportées et en suspension peuvent ensuite être formées à l’aide d’une microbalance à cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D) et sur une membrane poreuse pour une utilisation dans un test de perméabilité à membrane artificielle parallèle (PAMPA), respectivement. Les résultats représentatifs mettent en évidence la reproductibilité et la polyvalence des modèles de bicouches lipidiques de membrane cellulaire in vitro. Les méthodes présentées peuvent aider à évaluer rapidement et facilement les mécanismes d’interaction, tels que la perméation, l’adsorption et l’incorporation, de diverses molécules et macromolécules avec une membrane cellulaire, aidant ainsi au dépistage des candidats médicaments et à la prédiction de la toxicité cellulaire potentielle.

Ce protocole détaille les méthodes de formation des bicouches lipidiques supportées et suspendues (Figure 1). La première étape pour former une bicouche lipidique soutenue consiste à développer des vésicules lipidiques. La mini-extrudeuse permet de préparer de petits volumes de vésicules lipidiques (1 mL ou moins), tandis que la grande extrudeuse permet de préparer 5 à 50 mL de vésicules lipidiques en un seul lot. Les distributions granulométriques des vésicules unilipidiques ...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

La construction des membranes bicouches lipidiques décrites dans ce protocole peut être utilisée pour obtenir des informations cruciales sur les interactions membranaires avec les agents pharmaceutiques, les toxiques environnementaux et même les composés biologiques. Ces techniques peuvent être utilisées pour fabriquer des membranes de complexité liquide variable et pour évaluer la perméabilité, l’absorption et l’incorporation des composés dans les membranes. Pour commencer, ajoutez le volume approprié de solution mère lipidique dans un verre propre vile pour obtenir une concentration finale de vésicules de 2,5 milligrammes par millilitre après réhydratation.Éliminer le chloroforme de la solution lipidique à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Pour assurer l’élimination complète du chloroforme, connectez le film lipidique séché au vide pendant au moins quatre heures. Réhydrater le film lipidique séché avec un volume requis de tampon de chlorure de sodium Tris pour obtenir la concentration finale de vésicules de 2,5 milligrammes par millilitre, et vortex pendant environ 15 à 30 secondes.Transférer la suspension de vésicule dans un récipient avec de la glace carbonique jusqu’à ce qu’elle soit congelée pendant environ 30 minutes. Une fois l’échantillon complètement congelé, décongeler la suspension dans un bain-marie de 30 à 40 degrés Celsius. Vortex la suspension de vésicule décongelée.Pour faire un millilitre ou moins de vésicules, procurez-vous une mini extrudeuse. Pré-mouillez un support de filtre avec de l’eau ultra pure, puis placez-le sur la surface de support de membrane à l’intérieur du joint torique. Répétez l’opération pour le deuxième support de membrane interne.Positionnez un support de membrane interne dans le boîtier extérieur de l’extrudeuse. Placez une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres sur le support de membrane interne directement sur le support du filtre. Placez le deuxième support de membrane interne dans le boîtier extérieur de l’extrudeuse avec le joint torique et le côté du support du filtre face à la membrane en polycarbonate.Fixez le roulement en polytétrafluoroéthylène dans le nœud de retenue et vissez-le fermé avec le boîtier extérieur de l’extrudeuse. Clipsez l’extrudeuse dans le bloc chauffant. Chargez la suspension de vésicule lipidique dans l’une des seringues et positionnez la seringue dans le bloc thermique de l’extrudeuse, en insérant complètement l’aiguille dans une extrémité de l’extrudeuse.Insérez la deuxième seringue vide dans le côté opposé et verrouillez les deux seringues à l’aide des clips de bras sur le bloc chauffant. Poussez lentement la suspension de vésicule dans la seringue vide, puis dans la seringue d’origine. Répétez 20 fois de plus pour un total de 21 passages à travers la membrane en polycarbonate.Transférez les vésicules lipidiques dans un verre propre vile pour le stockage. Pour extruder cinq à 50 millilitres de vésicules, assemblez la grande extrudeuse en plaçant le support de l’écran à grand trou, le disque centré, les disques de drainage et la membrane en polycarbonate dans l’espace du support inférieur de l’extrudeuse. Connectez les supports supérieur et inférieur de l’extrudeuse à l’aide des quatre vis et serrez.Fixez l’unité d’extrusion au cylindre d’échantillon en la frottant vers le bas et en la serrant avec une clé à fixer. Remplissez le cylindre d’échantillon avec de l’eau ultrapure et extrudez l’eau à travers l’unité d’extrusion avant d’ajouter l’échantillon dans le cylindre d’échantillon. Ajouter la suspension de vésicule lipidique dans le cylindre d’échantillon et visser le dessus fermé.Augmentez lentement la pression jusqu’à ce que l’échantillon commence à s’égoutter de l’unité d’extrusion à une vitesse d’environ deux à trois gouttes par seconde dans un verre propre vile. Une fois que tout l’échantillon a été extrudé, coupez l’alimentation en azote et relâchez la pression dans le cylindre d’échantillon en ouvrant lentement la soupape de surpression. Versez les vésicules lipidiques dans le cylindre d’échantillon et répétez l’étape précédente neuf fois de plus pour un total de 10 extrusions.Chargez la suspension de vésicule dans la cuvette appropriée et insérez-la dans l’instrument de diffusion dynamique de la lumière, entrez les détails de l’échantillon et effectuez la mesure à l’aide du logiciel associé. Placez la cellule zêta dans la chambre d’échantillonnage, en vous assurant que les électrodes sont en contact, et fermez le couvercle du porte-échantillon. Dans le logiciel associé, entrez les détails de l’échantillon et collectez les mesures.Insérez le capteur de cristal de quartz codé à la silice dans le module d’écoulement, en vous assurant que la forme en T sur le cristal s’aligne sur la forme en T sur le module et vissez le module d’écoulement fermé. Dans les instruments à chambres multiples, des bicouches supplémentaires peuvent être formées en parallèle. Connectez le tuyau d’entrée et de sortie au module de débit et à la pompe.Placez le tube dans les protecteurs de maintien et fermez le couvercle du système d’analyse. Placez un conteneur à déchets à la sortie de la pompe pour collecter les solutions usées. Pour effectuer le nettoyage, allumez d’abord la pompe et réglez la vitesse d’écoulement à 400 microlitres par minute.Insérez le tube d’entrée dans de l’eau ultra pure et faites couler cinq à 10 millilitres à travers le module. Basculez le tube dans la FDS et faites circuler cinq à 10 millilitres à travers le module. Retournez le tube dans de l’eau ultra pure et faites couler 10 à 20 millilitres à travers le module.Enfin, faites circuler l’air à travers le module jusqu’à ce qu’aucune solution restante ne soit collectée. Retirez le capteur du module de débit et rincez-le à l’eau ultra pure. Entraînez le capteur et le module de débit avec un flux d’azote gazeux, en vous assurant que l’électrode reste toujours exempte de tout liquide.Dans une hotte à fumée chimique, insérez le capteur de cristal de quartz revêtu de silice dans un instrument de nettoyage ultraviolet ou à l’ozone. Allumez l’instrument et laissez le traitement pendant au moins deux minutes. Retirez soigneusement les capteurs et retournez-les dans le module de flux.Allumez l’instrument de l’analyseur pour connecter le logiciel associé et réglez la température à la valeur souhaitée pour former la bicouche lipidique de soutien. Laissez la température se stabiliser à l’entrée souhaitée. Configurez la mesure et recherchez toutes les fréquences de résonance du capteur et la dissipation pour les harmoniques trois, cinq, sept, neuf, 11 et 13 avant de commencer la mesure.Laissez le chlorure de sodium Tris s’écouler à travers le module pendant cinq à 10 minutes, en veillant à ce que le changement de fréquence de base ou le changement de Delta F et de dissipation ou les valeurs Delta D dans le liquide restent stables. Arrêtez la pompe, retirez le tuyau d’entrée de la solution de chlorure de sodium Tris et insérez-le soigneusement dans la solution de vésicule lipidique. Refoulement pendant cinq secondes pour éliminer les bulles d’air du tuyau d’entrée, puis continuer le flux vers l’avant.Redémarrez la mesure dans le logiciel pour mettre à zéro la ligne de base. Circulez les vésicules lipidiques jusqu’à ce que la formation de bicouches soit observée en temps réel dans le logiciel d’acquisition de données. Répétez ensuite cette étape pour changer le tube d’entrée des vésicules lipidiques en tampon de chlorure de sodium Tris.Ajouter cinq microlitres de la solution lipidique au compartiment donneur, qui est une plaque filtrante poreuse en polyvinylidène difluorure 96 puits multi-écran avec une taille de pore de 0,45 micro mètre. Immergez immédiatement la plaque filtrante dans le compartiment accepteur, qui est une plaque réceptrice de transport contenant 300 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. Ajouter 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans le compartiment donneur de transport.Suivez les étapes précédentes consistant à arrêter la pompe et à remplacer le tube d’entrée par une solution de vésicule lipidique et à observer la formation de bicouches, puis remplacez le tube d’entrée par la solution alpha hélicoïdale ou peptidique AH. Introduisez la solution dans le module d’écoulement jusqu’à ce qu’un changement de fréquence et un changement de dissipation soient observés à partir de l’ajout de la nouvelle solution. Arrêtez la pompe et laissez le peptide AH incuber avec les vésicules pendant 10 minutes.Changez le tube d’entrée en chlorure de sodium Tris et commencez le flux pour éliminer le peptide AH des vésicules rompues, ce qui conduit à la formation réussie d’une bicouche lipidique. Tout d’abord, faites couler le solvant de la molécule, puis basculez le tuyau d’entrée dans la solution contenant la molécule d’intérêt et faites couler pendant au moins cinq minutes. Si vous le souhaitez, arrêtez l’écoulement et laissez le liquide contenant la molécule désirée incuber avec la bicouche.Remplacez le tuyau d’entrée par le solvant moléculaire seul. Débitez pendant au moins cinq minutes, puis basculez le tuyau d’entrée en chlorure de sodium Tris et faites couler pendant au moins cinq minutes. Dans le logiciel, arrêtez la mesure, enregistrez le fichier et arrêtez la pompe.Immédiatement après les étapes précédentes pour une bicouche en suspension unilipidique ou pour une bicouche suspendue multilipidique, retirez le PBS du compartiment de la plaque filtrante du donneur et remplacez-le par 200 microlitres de la solution d’essai. Immergez-vous immédiatement dans une nouvelle plaque réceptrice de transport avec 300 microlitres de PBS. Après incubation avec un balancement doux pendant deux heures à 25 degrés Celsius, prélever 150 microlitres de la solution dans les compartiments donneur et accepteur.Mesurer la concentration de la molécule dans les deux échantillons en utilisant une méthode appropriée basée sur les propriétés de cette molécule. La taille, la polydispersité et le potentiel zêta des vésicules PC de l’œuf unilipidique, ainsi que deux compositions de vésicules multilipidiques ont été comparées. La distribution granulométrique des vésicules PC de l’œuf et des vésicules multilipidiques était presque identique.Les vésicules multilipidiques de l’œuf et du PC ont été chargées négativement, tandis que les vésicules multilipidiques ont été chargées positivement. Les vésicules PC d’oeuf unilipidique facilement absorbées à la surface, comme le montre la diminution du changement de fréquence et l’augmentation du changement de dissipation, suivie d’une rupture spontanée. Les vésicules multilipidiques sont absorbées à la surface, mais nécessitent l’ajout de peptide AH pour rompre les vésicules, ce qui entraîne la formation de bicouches lipidiques.Avec les bicouches lipidiques prises en charge, le changement de fréquence et le changement de dissipation peuvent être analysés avant et après l’introduction d’un composé d’intérêt. Par exemple, les interactions du DEHP et du toxique environnemental avec l’uni et le multicouche supporté par couches ont été étudiées. Des niveaux similaires d’absorption du DEHP ont été observés pour les deux types de bicouches lipidiques.Cependant, des différences dans le changement de dissipation ont été observées entre les bicouches avec un changement de dissipation plus important observé pour la bicouche PC de l’œuf par rapport à la bicouche multilipidique une. Peu de perméation a été observée pour les bicouches uni-lipidiques et multi-lipides. À la suite de cette procédure, une variété de bicouches lipidiques imitant les cellules peut être développée pour permettre le criblage sans cellule des interactions moléculaires avec des composés allant des produits pharmaceutiques aux toxiques environnementaux.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Recherche

Bio-ingénierie

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d&#39;un Thin Film Polydiméthylsiloxane

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...