Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation im Rahmen von Grant No. 1942418 an AS und einem Graduate Research Fellowship der National Science Foundation an C.M.B.H. unter Grant No. 1644760 unterstützt werden. Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider. Die Autoren danken Dr. Noel Vera-González für die Datenerfassung zur Charakterisierung von Lipidvesikeln. Die Autoren danken Professor Robert (Brown University) für den Einsatz seines Zetasizers. Die Autoren danken der Brown University Mass Spectrometry Facility, insbesondere Dr. Tun-Li Shen für die Unterstützung bei der Quantifizierung der Lipidzusammensetzung.

1. Entwicklung von Uni-Lipid-Vesikeln
<ol><li>Dünnschicht-Hydratationsmethode<ol>
<li>Herstellung und Lagerung von Lipidstocklösungen HINWEIS: Alle Schritte mit Chloroform müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Chloroform sollte immer mit lösungsmittelsicheren Kohlefaserpipettenspitzen pipettiert werden. Lösungen, die Chloroform enthalten, sollten immer in Glasfläschchen gelagert werden.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 mg/ml Lipidstocklösung vor, indem Sie das entsprechende Volumen Chloroform in ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Bildung von Lipidvesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Hier werden kritische Schritte vorgestellt, um jede dieser Strukturen zu bilden. Bei der Bildung von Lipidvesikeln ist es wichtig, oberhalb der Sprungtemperatur des Lipids39zu extrudieren. Wenn unterhalb der Übergangstemperatur das Lipid physisch in seiner geordneten Gelphase39vorhanden ist. In dieser geordneten Phase sind die Kohlenwasser...

Die Zellmembran, die hauptsächlich aus Phospholipiden, Cholesterin und Proteinen besteht, ist ein entscheidender Bestandteil aller lebenden Zellen1. Mit einer durch Lipidamphiphilie getriebenen Organisation fungiert die Zellmembran als Schutzbarriere und reguliert, wie die Zelle mit ihrer Umgebung interagiert2. Mehrere zelluläre Prozesse sind abhängig von der Lipid- und Proteinzusammensetzung derMembran 1,2. Zum Beispiel sind Zellmembraninteraktionen wichtig für eine effektive Arzneimittelabgabe3. Pharmazeutika, Biologika, Nanomaterialien, biologische Toxine und Umweltgifte können die Integrität einer Zellmembran beeinflussen und dadurch die Zellfunktion beeinträchtigen4. Die Konstruktion von In-vitro-Zell-imitierenden Membranmodellen, die auf der Lipidzusammensetzung von Zellmembranen basieren, hat das Potenzial, einfache Werkzeuge bereitzustellen, um die Untersuchung der möglichen Auswirkungen dieser Materialien auf Zellen erheblich zu verbessern.
Modell-Lipiddoppelschichten umfassen Lipidvesikel, unterstützte Lipiddoppelschichten und suspendierte Lipiddoppelschichten. Unterstützte Lipiddoppelschichten sind ein Modell der Phospholipidzellmembran, die üblicherweise in biotechnologischen Anwendungen verwendet wird, bei denen Lipidvesikel auf einem trägern Substratmaterial5,6,7,8,9 gerissenwerden. Eine gängige Technik zur Überwachung der Doppelschichtbildung ist die Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D), die die Adsorption von Vesikeln im Vergleich zu den Flüssigeneigenschaften in situuntersucht 8,10,11,12,13,14 . Zuvor wurde QCM-D verwendet, um zu zeigen, dass unter Strömungsbedingungen, sobald eine kritische Vesikelabdeckung von Phosphatidylcholin (PC) Lipidvesikeln auf der Oberfläche erreicht ist, sie spontan in starre Lipiddoppelschichten15aufbrechen. Frühere Arbeiten haben auch die unterstützte Lipiddoppelschichtbildung mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen16,den Einbau von Lipidproteinen17,18,19und die Verwendung von Polymerkissen20untersucht, wodurch unterstützte Lipiddoppelschichten entstehen, die verschiedene Aspekte der Zellmembranfunktion nachahmen können.
Lipiddoppelschichten wurden verwendet, um verschiedene biologische Barrieren von subzellulären bis hin zu Organebenen nachzuahmen, einschließlich Mitochondrium, roten Blutkörperchen und Leberzellmembranen, indem die Phospholipid-, Cholesterin- und Glykolipidkomponenten verändert wurden21. Diese komplexeren Multilipidvesikel können je nach Lipidzusammensetzung zusätzliche Methoden erfordern, um eine Vesikelruptur zu erreichen. Zum Beispiel haben frühere Studien ein α-helikales (AH) Peptid verwendet, das vom nichtstrukturellen Protein 5A des Hepatitis-C-Virus abgeleitet ist, um die Doppelschichtbildung durch Destabilisierung der adsorbierten Lipidvesikel zu induzieren22,23. Unter Verwendung dieses AH-Peptids wurden zuvor unterstützte Lipiddoppelschichten gebildet, die Plazentazellen nachahmen24. Das große Potenzial unterstützter Lipiddoppelschichten für biomedizinische Anwendungen wurde mit Untersuchungen gezeigt, die den molekularen und Nanopartikeltransport25,26, umwelttoxische Wechselwirkungen27, Proteinaufbau und -funktion17,18,19, Peptidanordnung und -insertion28,29, Arzneimittelscreening30und mikrofluidische Plattformen31umfassen.
Suspendierte Lipiddoppelschichten wurden für pharmazeutische Screening-Studien über einen parallelen künstlichen Membranpermeabilitätstest (PAMPA) verwendet, bei dem eine Lipiddoppelschicht über einen porösen hydrophoben Einsatz32,33,34,35suspendiert ist. PAMPA-Lipidmodelle wurden für verschiedene biologische Grenzflächen entwickelt, einschließlich der Blut-Hirn-, bukkalen, intestinalen und transdermalen Grenzflächen36. Durch die Kombination sowohl der unterstützten Lipiddoppelschicht als auch der PAMPA-Techniken können Adsorption, Permeabilität und Einbettung von Verbindungen in Lipidkomponenten eines gewünschten Gewebes oder Zelltyps gründlich untersucht werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Anwendung von In-vitro-Zellmembran-Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung verschiedener molekularer Wechselwirkungen. Die Herstellung von sowohl Uni-Lipid- als auch Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Lipiddoppelschichten wird detailliert beschrieben. Um eine unterstützte Lipiddoppelschicht zu bilden, werden Lipidvesikel zunächst unter Verwendung von Dünnschichthydratations- und Extrusionsmethoden entwickelt, gefolgt von einer physikalisch-chemischen Charakterisierung. Die Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht unter Verwendung von QCM-D-Überwachung und Herstellung von suspendierten Lipidmembranen für den Einsatz in PAMPA wird diskutiert. Schließlich werden Multilipidvesikel für die Entwicklung komplexerer zellimitierender Membranen untersucht. Unter Verwendung beider Arten von hergestellten Lipidmembranen zeigt dieses Protokoll, wie dieses Werkzeug zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen verwendet werden kann. Insgesamt konstruiert diese Technik zellnachahmende Lipiddoppelschichten mit hoher Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Modellzellmembranen sind ein nützliches Screening-Tool mit Anwendungen, die von der frühen Wirkstoffentdeckung bis hin zu Toxizitätsstudien reichen. Die Zellmembran ist eine entscheidende Schutzbarriere für alle Zelltypen, die die internen zellularen Komponenten von der extrazellulären Umgebung trennt. Diese Membranen bestehen größtenteils aus einer Lipiddoppelschicht, die äußere hydrophile Kopfgruppen und innere hydrophobe Schwanzgruppen sowie verschiedene Proteine und Cholesterin enthält. Die Zusammensetzung und Struktur der Lipide selbst spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der biologischen Funktion, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der zellulären Mikroumgebung, die Arzneimittel, biologische Toxine und Umweltgifte enthalten kann. In dieser Studie werden Methoden zur Formulierung von Ein-Lipid- und Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Zell-imitierenden Lipiddoppelschichten beschrieben. Zuvor wurden Ein-Lipid-Phosphatidylcholin (PC)-Lipiddoppelschichten sowie Multi-Lipid-Plazenta-Trophoblast-inspirierte Lipiddoppelschichten für das Verständnis molekularer Wechselwirkungen entwickelt. Hier werden Methoden zur Erreichung beider Arten von Doppelschichtmodellen vorgestellt. Für zellnachahmende Multilipid-Doppelschichten wird die gewünschte Lipidzusammensetzung zunächst durch Lipidextraktion aus Primärzellen oder Zelllinien bestimmt, gefolgt von der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Unter Verwendung dieser Zusammensetzung werden Lipidvesikel unter Verwendung eines Dünnschichthydratations- und Extrusionsverfahrens hergestellt und ihr hydrodynamischer Durchmesser und ihr Zetapotential charakterisiert. Gestützte und suspendierte Lipiddoppelschichten können dann unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) und auf einer porösen Membran zur Verwendung in einem parallelen künstlichen Membranpermeabilitätsassay (PAMPA) gebildet werden. Die repräsentativen Ergebnisse unterstreichen die Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit von In-vitro-Zellmembran-Lipid-Doppelschichtmodellen. Die vorgestellten Methoden können bei der schnellen, einfachen Bewertung der Interaktionsmechanismen wie Permeation, Adsorption und Einbettung verschiedener Moleküle und Makromoleküle mit einer Zellmembran helfen, beim Screening von Arzneimittelkandidaten und der Vorhersage potenzieller zellulärer Toxizität helfen.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bildung von unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichten (Abbildung 1). Der erste Schritt zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht ist die Entwicklung von Lipidvesikeln. Der Mini-Extruder ermöglicht die Herstellung kleiner Mengen von Lipidvesikeln (1 ml oder weniger), während der große Extruder die Herstellung von 5-50 ml Lipidvesikeln in einer Charge ermöglicht. Größenverteilungen von Einlipidvesikeln, die entweder vom Mini-...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Die in diesem Protokoll beschriebene Konstruktion von Lipiddoppelschichtmembranen kann verwendet werden, um entscheidende Informationen über Membranwechselwirkungen mit pharmazeutischen Wirkstoffen, umwelttoxischen Mitteln und sogar biologischen Verbindungen zu erhalten. Diese Techniken können verwendet werden, um Membranen mit unterschiedlicher Flüssigkeitskomplexität herzustellen und die Permeabilität, Absorption und Einbettung von Verbindungen in Membranen zu bewerten. Geben Sie zunächst das entsprechende Volumen der Lipidstocklösung in ein sauberes Glas, um nach der Rehydratation eine endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.Entfernen Sie Chloroform aus der Lipidlösung mit einem Stickstoffgasstrom. Um eine vollständige Entfernung von Chloroform zu gewährleisten, verbinden Sie den getrockneten Lipidfilm mindestens vier Stunden lang mit dem Vakuum. Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit einem erforderlichen Volumen an Tris-Natriumchloridpuffer, um die endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter zu erhalten, und wirbeln Sie etwa 15 bis 30 Sekunden lang.Die Vesikelsuspension in einen Behälter mit Trockeneis geben, bis sie für ca. 30 Minuten eingefroren ist. Nachdem die Probe vollständig eingefroren ist, tauen Sie die Suspension in einem 30 bis 40 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Wirbeln Sie die aufgetaute Vesikelsuspension.Um einen Milliliter oder weniger Vesikel herzustellen, besorgen Sie sich einen Mini-Extruder. Befeuchten Sie eine Filterhalterung mit ultrareinem Wasser und legen Sie sie dann auf die Membranträgeroberfläche im O-Ring. Wiederholen Sie dies für die zweite interne Membranstütze.Positionieren Sie eine interne Membranstütze in das Außengehäuse des Extruders. Legen Sie eine 100 Nanometer große Polycarbonatmembran direkt über die Filterhalterung auf die interne Membranhalterung. Positionieren Sie den zweiten internen Membranträger im Extruderaußengehäuse mit dem O-Ring und der Filterträgerseite, die der Polycarbonatmembran zugewandt sind.Befestigen Sie das Polytetrafluorethylenlager in den Halterastecker und schrauben Sie es mit dem Extruderaußengehäuse zu. Clippen Sie den Extruder in den Heizblock. Laden Sie die Lipidvesikelsuspension in eine der Spritzen und positionieren Sie die Spritze im Extruder-Wärmeblock, wobei Sie die Nadel vollständig in ein Ende des Extruders einführen.Setzen Sie die zweite leere Spritze in die gegenüberliegende Seite ein und verriegeln Sie beide Spritzen mit den Armklammern am Wärmeblock. Drücken Sie die Vesikelaufhängung langsam in die leere Spritze und dann wieder in die Originalspritze. Wiederholen Sie dies 20 weitere Male für insgesamt 21 Durchgänge durch die Polycarbonatmembran.Übertragen Sie die Lipidvesikel zur Lagerung in ein sauberes Glas. Um fünf bis 50 Milliliter Vesikel zu extrudieren, montieren Sie den großen Extruder, indem Sie den großen Lochsiebträger, die zentrierte Scheibe, die Ablassscheiben und die Polycarbonatmembran in den Raum in der unteren Auflage des Extruders legen. Verbinden Sie die oberen und unteren Stützen des Extruders mit den vier Schrauben und ziehen Sie sie fest.Befestigen Sie die Extrudereinheit am Probenzylinder, indem Sie sie an der Unterseite schrubben und mit einem Schraubenschlüssel festziehen, um sie zu sichern. Füllen Sie den Probenzylinder mit Reinstwasser und extrudieren Sie das Wasser durch die Extrudereinheit, bevor Sie die Probe in den Probenzylinder geben. Die Lipidvesikelsuspension in den Probenzylinder geben und die Oberseite verschrauben.Erhöhen Sie langsam den Druck, bis die Probe mit einer Geschwindigkeit von etwa zwei bis drei Tropfen pro Sekunde aus der Extrudereinheit in ein sauberes Glas zu tropfen beginnt. Sobald alle Proben extrudiert wurden, schalten Sie die Stickstoffzufuhr aus und geben Sie den Druck im Probenzylinder ab, indem Sie das Überdruckventil langsam öffnen. Gießen Sie die Lipidvesikel zurück in den Probenzylinder und wiederholen Sie den vorherigen Schritt neun weitere Male für insgesamt 10 Extrusionen.Laden Sie die Vesikelsuspension in die entsprechende Küvette und legen Sie sie in das dynamische Lichtstreuinstrument ein, geben Sie die Probendetails ein und führen Sie die Messung mit der zugehörigen Software durch. Legen Sie die Zetazelle in die Probenkammer, stellen Sie sicher, dass die Elektroden in Kontakt sind, und schließen Sie den Probenhalterdeckel. Geben Sie in der zugehörigen Software die Probendetails ein und sammeln Sie Messungen.Setzen Sie den quarzcodierten Quarzkristallsensor in das Durchflussmodul ein, um sicherzustellen, dass die T-Form auf dem Kristall mit der T-Form auf dem Modul übereinstimmt, und schrauben Sie das Durchflussmodul zu. Bei Instrumenten mit mehreren Kammern können zusätzliche Doppelschichten parallel gebildet werden. Schließen Sie den Einlass- und Auslassschlauch an das Durchflussmodul und die Pumpe an.Legen Sie den Schlauch in die Haltevorrichtungen und schließen Sie den Deckel des Analysatorsystems. Stellen Sie einen Abfallbehälter an den Auslass der Pumpe, um verbrauchte Lösungen zu sammeln. Um die Reinigung durchzuführen, schalten Sie zuerst die Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 400 Mikroliter pro Minute ein.Führen Sie den Einlassschlauch in Reinstwasser ein und lassen Sie fünf bis 10 Milliliter durch das Modul fließen. Schalten Sie die Schläuche in SDB um und strömen Sie fünf bis 10 Milliliter durch das Modul. Schläuche wieder in Reinstwasser umschalten und 10 bis 20 Milliliter durch das Modul strömen lassen.Schließlich strömen Sie Luft durch das Modul, bis keine verbleibende Lösung mehr gesammelt ist. Entfernen Sie den Sensor aus dem Durchflussmodul und spülen Sie den Sensor mit hochreinem Wasser ab. Treiben Sie den Sensor und das Durchflussmodul mit einem Stickstoffgasstrom an, um sicherzustellen, dass die Elektrode immer frei von Flüssigkeit bleibt.Setzen Sie den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor in einen chemischen Abzug in ein UV- oder Ozonreinigungsinstrument ein. Schalten Sie das Instrument ein und lassen Sie die Behandlung mindestens zwei Minuten einwirken. Entfernen Sie die Sensoren vorsichtig und geben Sie sie in das Durchflussmodul zurück.Schalten Sie das Analysegerät ein, um die zugehörige Software anzuschließen, und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert für die Bildung der unterstützenden Lipiddoppelschicht ein. Lassen Sie die Temperatur auf den gewünschten Eingang stabilisieren. Konfigurieren Sie die Messung und finden Sie alle Sensorresonanzfrequenzen und die Dissipation für die Obertöne drei, fünf, sieben, neun, 11 und 13, bevor Sie mit der Messung beginnen.Lassen Sie Tris-Natriumchlorid fünf bis 10 Minuten durch das Modul fließen, um sicherzustellen, dass die Basisfrequenzänderung oder Delta F- und Dissipationsänderung oder Delta D-Werte in Flüssigkeit stabil bleiben. Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Einlassschlauch von der Tris-Natriumchloridlösung und führen Sie ihn vorsichtig in die Lipidvesikellösung ein. Fünf Sekunden lang rückströmen, um Luftblasen aus dem Einlassschlauch zu entfernen, und dann den Vorwärtsstrom fortsetzen.Starten Sie die Messung in der Software neu, um die Baseline auf Null zu setzen. Fließen Lipidvesikel bis zur Doppelschichtbildung in Echtzeit in der Datenerfassungssoftware. Wiederholen Sie dann diesen Schritt, um den Einlassschlauch von Lipidvesikeln zurück in Tris-Natriumchloridpuffer zu ändern.Fügen Sie fünf Mikroliter der Lipidlösung in das Donorkompartiment hinzu, bei dem es sich um eine poröse Polyvinylidendifluorid-96-Well-Multiscreen-Filterplatte mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern handelt. Tauchen Sie die Filterplatte sofort in das Akzeptorfach ein, bei dem es sich um eine Transportbehälterplatte handelt, die 300 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält. 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in das Transportspenderkompartiment geben.Befolgen Sie die vorherigen Schritte, um die Pumpe zu stoppen und den Einlassschlauch in Lipidvesikellösung umzuwandeln und die Doppelschichtbildung zu beobachten, dann ändern Sie den Einlassschlauch in die Alpha-Helikal- oder AH-Peptidlösung. Führen Sie die Lösung in das Durchflussmodul ein, bis die Frequenzänderung und die Verlustleistungsänderung durch die neue Lösungszugabe beobachtet werden. Stoppen Sie die Pumpe und lassen Sie das AH-Peptid 10 Minuten lang mit den Vesikeln inkubieren.Schalten Sie den Einlassschlauch in Tris-Natriumchlorid um und starten Sie den Fluss, um das AH-Peptid aus den gerissenen Vesikeln zu entfernen, was zur erfolgreichen Bildung einer Lipiddoppelschicht führt. Zuerst das Moleküllösungsmittel fließen lassen, dann den Einlassschlauch in die Lösung umschalten, die das Molekül von Interesse enthält, und mindestens fünf Minuten lang fließen lassen. Wenn gewünscht, stoppen Sie den Fluss und lassen Sie die Flüssigkeit, die das gewünschte Molekül enthält, mit der Doppelschicht inkubieren.Wechseln Sie den Einlassschlauch zurück zum Moleküllösungsmittel allein. Mindestens fünf Minuten durchströmen lassen, dann den Einlassschlauch in Tris-Natriumchlorid umschalten und mindestens fünf Minuten lang fließen lassen. Stoppen Sie in der Software die Messung, speichern Sie die Datei und stoppen Sie die Pumpe.Unmittelbar nach den vorherigen Schritten für eine Einlipid-Suspendierungsdoppelschicht oder für eine Multi-Lipid-Suspendierungsdoppelschicht wird PBS aus dem Donorfilterplattenkompartiment entfernt und durch 200 Mikroliter der Testlösung ersetzt. Tauchen Sie sofort in eine neue Transportbehälterplatte mit 300 Mikrolitern PBS ein. Nach der Inkubation mit sanftem Schaukeln für zwei Stunden bei 25 Grad Celsius werden 150 Mikroliter der Lösung aus den Spender- und Akzeptorkompartimenten entnommen.Messen Sie die Molekülkonzentration in beiden Proben mit einer geeigneten Methode, die auf den Eigenschaften dieses Moleküls basiert. Größe, Polydispersität und Zetapotential von Uni-Lipid-Ei-PC-Vesikeln und zwei Multilipid-Vesikelzusammensetzungen wurden verglichen. Die Größenverteilung der Ei-PC-Vesikel und der Multi-Lipid-Eins-Vesikel war nahezu identisch.Sowohl Ei- als auch PC-Multilipid-Eins-Vesikel waren negativ geladen, während Zwei-Lipid-Vesikel positiv geladen waren. Uni-Lipid-Ei-PC-Vesikel werden leicht an die Oberfläche absorbiert, wie die Abnahme der Frequenzänderung und die Zunahme der Dissipationsänderung zeigen, gefolgt von einer spontanen Ruptur. Multilipidvesikel werden an die Oberfläche absorbiert, erfordern jedoch die Zugabe von AH-Peptid, um die Vesikel zu reißen, was zur Bildung von Lipiddoppelschichten führt.Mit unterstützten Lipiddoppelschichten können Frequenzänderungen und Dissipationsänderungen vor und nach der Einführung einer interessierenden Verbindung analysiert werden. So wurden beispielsweise Wechselwirkungen von DEHP und umwelttoxischem Wirkstoff mit träger Uni und schichtweise mehrschichtig untersucht. Ähnliche Konzentrationen der DEHP-Absorption wurden für beide Lipiddoppelschichttypen beobachtet.Es wurden jedoch Unterschiede in der Dissipationsänderung zwischen den Doppelschichten beobachtet, wobei eine größere Dissipationsänderung für die Ei-PC-Doppelschicht im Vergleich zur Multilipid-Doppelschicht beobachtet wurde. Sowohl für Ein- als auch für Multilipid-Doppelschichten wurde eine geringe Permeation beobachtet. Nach diesem Verfahren kann eine Vielzahl von zellimitierenden Lipiddoppelschichten entwickelt werden, um ein zellfreies Screening molekularer Wechselwirkungen mit Verbindungen von Pharmazeutika bis hin zu umwelttoxischen Mitteln zu ermöglichen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Forschung

Biotechnik

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Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...