Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס ' 1942418 שהוענק ל- A.S., ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע שהוענקה ל- C.M.B.H., תחת גרנט מס '1644760. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע. המחברים מודים לד"ר נואל ורה-גונזלס על רכישת נתוני אפיון השומנים. המחברים מודים לפרופסור רוברט הארט (אוניברסיטת בראון) על השימוש בזטסייזר שלו. המחברים מודים למתקן ספקטרומטריית המסה של אוניברסיטת בראון, בפרט, ד"ר טון-לי שן על הסיוע בכימות הרכב השומנים.

1. פיתוח שלשלפי שומנים חד-שומניים
<ol><li>שיטת הידרציה סרט דק<ol>
<li>הכנה ואחסון של פתרונות מלאי שומנים בדם הערה: כל השלבים באמצעות כלורופורם צריכים להתבצע במכסה אדים כימי. כלורופורם תמיד צריך להיות pipetted באמצעות טיפים פיפטה סיבי פחמן בטוח ממס. פתרונות המכילים כלורופורם תמיד צריך להיות מאוחסן ...

פרוטוקול זה מאפשר היווצרות שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ו bilayers שומנים מושעה. כאן מוצגים צעדים קריטיים ליצירת כל אחד מהמבנים הללו. בעת יצירת שלל שומנים, חשוב להבלט מעל טמפרטורת המעבר של השומנים39. כאשר מתחת לטמפרטורת המעבר, השומנים נוכחים פיזית בשלב הג'ל המוזמן ש?...

קרום התא, המורכב בעיקר פוספוליפידים, כולסטרול, וחלבונים, הוא מרכיב מכריע של כל התאים החיים1. עם ארגון מונע על ידי אמפיפיליות שומנים בדם, קרום התא מתפקד כמחסום מגן ומסדיר כיצד התא אינטראקציה עם הסביבה שמסביב2. מספר תהליכים תאיים תלויים בהרכב השומנים והחלבון של הממברנה1,2. לדוגמה, אינטראקציות קרום התא חשובות עבור משלוח סמים יעיל3. תרופות, ביולוגיות, ננו-חומרים, רעלנים ביולוגיים ורעילים סביבתיים יכולים להשפיע על שלמות קרום התא, ובכך להשפיע על תפקוד התא4. בניית תאי במבחנה מחקה מודלים ממברנה המבוססים על הרכב השומנים של קרום התא יש פוטנציאל לספק כלים facile כדי לשפר מאוד את המחקר של ההשפעה הפוטנציאלית של חומרים אלה על תאים.
דו-שכבתי השומנים לדוגמה כוללים שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ובולייה שומנים מושעים. bilayers שומנים נתמכים הם מודל של קרום התא פוספוליפיד נפוץ ביישומי ביוטכנולוגיה שבו שלפוחיות השומנים נקרעים על חומר מצע נתמך5,6,7,8,9. טכניקה נפוצה אחת המשמשת לניטור היווצרות bilayer היא מיקרו-איזון גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), הבוחן את ספיחת שלפוחיות בהשוואה למאפיינים הנוזליים בתפזורת במקום8,10,11,12,13,14 . בעבר, QCM-D שימש כדי להדגים כי בתנאי זרימה, פעם כיסוי ארסית קריטית של שלפוחיות שומנים (PC) מושגת על פני השטח, הם נקרעים באופן ספונטני לתוך bilayers שומנים נוקשים15. עבודה קודמת חקרה גם היווצרות דו-שכבתית שומנים נתמכת עם הרכבים שומנים שונים16, שילוב של חלבונים שומניםבדם 17,18,19, וניצול כריות פולימר20, מניב bilayers שומנים נתמכים מסוגל לחקות היבטים שונים של תפקוד קרום התא.
bilayers השומנים שימשו כדי לחקות מחסומים ביולוגיים שונים מן תת התא לרמות איברים כולל מיטוכונדריון, תא דם אדום, קרום תא הכבד על ידי שינוי רכיבי פוספוליפיד, כולסטרול, וגליקולפיד21. שלל רב שומנים מורכבים יותר אלה עשויים לדרוש שיטות נוספות כדי להשיג קרע ארסי, בהתאם להרכב השומנים. לדוגמה, מחקרים קודמים השתמשו בפפטיד α-סלילי (AH) הנגזר מהחלבון הלא מובנה של נגיף הפטיטיס C 5A כדי לגרום להיווצרות דו-שכבתית על ידי ערעור שלטי השומנים הפולאים22,23. באמצעות פפטיד AH זה, דו-שכבות שומנים נתמכות המחקות תאי שליה נוצרו בעבר24. הפוטנציאל הגדול של bilayers שומנים נתמך עבור יישומים ביו-רפואיים הוכח עם חקירות המשתרעות על פני מולקולרית וננו-חלקיקים25,26, אינטראקציות רעילות סביבתיות27, הרכבת חלבון ופונקציה17,18,19, סידור פפטיד והכנסת28,29, הקרנת סמים30,ופלטפורמות מיקרופלואידיות31.
bilayers שומנים מושעים שימשו למחקרי הקרנה פרמצבטית באמצעות בדיקת חדירות קרום מלאכותי מקביל (PAMPA) שבו bilayer שומנים מושעה על פני תוספת הידרופובית נקבובי32,33,34,35. מודלים שומנים PAMPA פותחו עבור ממשקים ביולוגיים שונים כולל הדם - מוח, buccal, מעיים, וממשקים transdermal36. על ידי שילוב הן של דו-שכבתי השומנים הנתמכות והן טכניקות PAMPA, ספיחה, חדורות והטמעה של תרכובות בתוך רכיבי השומנים של רקמה רצויה או סוג התא ניתן ללמוד ביסודיות.
פרוטוקול זה מתאר את הייצור והיישום של מודלים bilayer השומנים קרום התא במבחנה לחקור מספר אינטראקציות מולקולריות. הכנת דו-לשוניים חד-שומניים ורב-שומנים הנתמכים והשעייתם של שכבות השומנים מפורטת. כדי ליצור דו-שכבתית שומנים נתמכת, שלפוחיות שומנים מפותחות לראשונה באמצעות שיטות הידרציה ושחול סרט דק ואחריו אפיון פיזיקוכימי. היווצרות של דו-שכבתי שומנים נתמך באמצעות ניטור QCM-D ייצור של קרומי שומנים מושעים לשימוש PAMPA נדון. לבסוף, שלל רב שומנים להתפתחות של ממברנות מורכבות יותר חיקוי תאים נבדקים. באמצעות שני סוגי ממברנות שומנים מפוברקות, פרוטוקול זה מדגים כיצד כלי זה יכול לשמש לחקר אינטראקציות מולקולריות. בסך הכל, טכניקה זו בונה תאים מחקים שכבות שומנים עם רבייה גבוהה ורבגוניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

מודל קרום התא הם כלי סינון שימושי עם יישומים החל גילוי סמים מוקדם מחקרים רעילות. קרום התא מהווה מחסום מגן חיוני לכל סוגי התאים, המפריד בין הרכיבים התאיים הפנימיים לסביבה החוץ-תאית. ממברנות אלה מורכבות בעיקר מביבאי שומנים, המכיל קבוצות ראש הידרופיליות החיצוניות וקבוצות זנב הידרופוביות פנימיות, יחד עם חלבונים וכולסטרול שונים. הרכב ומבנה השומנים עצמם ממלאים תפקיד מכריע בוויסות התפקוד הביולוגי, כולל אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה התאית, שעשויה להכיל תרופות, רעלים ביולוגיים וטפילים סביבתיים. במחקר זה, שיטות לגיבוש חד שומנים, מרובה שומנים תומכים ותא מושעה מחקה bilayers שומנים מתוארים. בעבר, פוספטידילכולין חד שומני (PC) bilayers שומנים, כמו גם רב שומנים שליה טרופיבלסט בהשראת bilayers שומנים פותחו לשימוש בהבנת אינטראקציות מולקולריות. כאן יוצגו שיטות להשגת שני סוגי דגמי הדו-שכבתיה. עבור תאים מחקים דו-שכבתיים מרובי שומנים, הרכב השומנים הרצוי נקבע תחילה באמצעות מיצוי שומנים מתאים ראשיים או מקווי תאים ואחריו ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS). באמצעות קומפוזיציה זו, שלפוחיות השומנים מפוברקות בשיטת הידרציה ושחול סרט דק ואת הקוטר ההידרודינמי שלהם ואת פוטנציאל זטה מאופיינים. לאחר מכן ניתן ליצור דו-שכבתי שומנים נתמכים ומושעים באמצעות מיקרו-איזון קריסטל קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) ועל קרום נקבובי לשימוש בבדיקת חדירות מקבילה של קרום מלאכותי (PAMPA), בהתאמה. התוצאות הייצוגיות מדגישות את הרבייה והרבגוניות של דגמי דו-שכבתי השומנים של קרום התא במבחנה. השיטות המוצגות יכולות לסייע בהערכה מהירה ומקלה של מנגנוני האינטראקציה, כגון חדירות, ספיחה והטמעה, של מולקולות שונות ומקרומולקולות עם קרום התא, המסייעות בהקרנת מועמדים לתרופות וחיזוי רעילות תאית פוטנציאלית.

פרוטוקול זה מפרט שיטות ליצירת דו-שכבתיות שומנים נתמכות ומושעות(איור 1). הצעד הראשון ליצירת דו-שכבתי שומני נתמך הוא לפתח שלל שומנים. מחשוף מיני מאפשר כמויות קטנות של שלשולי שומנים להיות מוכן (1 מ"ל או פחות), בעוד המחשוף הגדול מאפשר 5-50 מ"ל של שלשולי שומנים להיות מוכן באצווה אחת. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

בניית ממברנות דו-שכבתיות שומנים המתוארות בפרוטוקול זה יכולה לשמש כדי לקבל מידע חיוני על אינטראקציות ממברנה עם סוכני תרופות, רעילים סביבתיים, ואפילו תרכובות ביולוגיות. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לפברק ממברנות של מורכבות נוזלית משתנה, ולהעריך חדירות תרכובת, ספיגה, והטמעה בתוך ממברנות. כדי להתחיל, להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת מלאי השומנים לתוך זכוכית נקייה לתפלת כדי להשיג ריכוז ארסיות סופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר לאחר rehydration.הסר כלורופורם מתמיסת השומנים, באמצעות זרם של גז חנקן. כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם, חבר את סרט השומנים המיובש לוואקום במשך ארבע שעות לפחות. Rehydrate סרט השומנים היבש עם נפח נדרש של חוצץ טריס נתרן כלורי כדי להניב את ריכוז ההזרמה הסופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר, מערבולת במשך כ 15 עד 30 שניות.מעבירים את ההשעיה הארסית למיכל עם קרח יבש עד להקפאה של כ-30 דקות. לאחר המדגם קפוא לחלוטין, להפשיר את ההשעיה באמבט מים 30 עד 40 מעלות צלזיוס. מערבולת השעיית ארסיה מופשרת.כדי להפוך מיליליטר אחד או פחות של שלל, להשיג מחול מיני. יש להרטיב מסנן עם מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן להניח אותו על משטח התמיכה בממברנה בתוך טבעת ה-O. חזור על הפעולה לקבלת התמיכה הפנימית השנייה בממברנה.מקם תמיכה פנימית אחת בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה. הנח קרום פוליקרבונט אחד של 100 ננומטר על התמיכה הפנימית בממברנה ישירות מעל התמיכה במסנן. מקם את התמיכה הפנימית השנייה בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה עם טבעת O וסינון צד תמיכה מול קרום פוליקרבונט.חבר את הפוליטרפלואורואתילן הנושא לתוך קשר שכר הטרחה ובורג אותו סגור עם המארז החיצוני של המכבש. חותכים את המהלל לבלוק החימום. לטעון את ההשעיה השומנים לתוך אחד המזרקים למקם את המזרק לתוך בלוק חום extruder, החדרת המחט באופן מלא לתוך קצה אחד של המכבש.הכנס את המזרק הריק השני לצד הנגדי ונעל את שני המזרקים באמצעות מהדקי הזרוע על בלוק החום. לאט לאט לדחוף את ההשעיה vesicle לתוך המזרק הריק ולאחר מכן בחזרה למזרק המקורי. חזור על 20 פעמים נוספות עבור סך של 21 עובר דרך קרום פוליקרבונט.מעבירים את שלל השומנים לשפל זכוכית נקי לאחסון. כדי להבליט חמישה עד 50 מיליליטר של שלל, להרכיב את המבליט הגדול על ידי הצבת התמיכה במסך החור הגדול, דיסק ממורכז, דיסק ניקוז, וקרום פוליקרבונט לתוך החלל בתמיכה התחתונה extruder. חבר את התמיכה העליונה והתחתון באמצעות ארבעת הברגים והידוק.חבר את יחידת המבליט לצילינדר המדגם על ידי קרצוף זה לתחתית והידוק עם מפתח ברגים כדי לאבטח. מלא את גליל המדגם במים אולטרה-סברים ונווט את המים דרך יחידת האקסטרודר לפני הוספת הדגימה לצילינדר המדגם. מוסיפים את מתלה השומנים לצילינדר המדגם ומברגים את החלק העליון סגור.לאט להגביר את הלחץ עד המדגם מתחיל לטפטף מיחידת extruder בקצב של כ שתיים עד שלוש טיפות לשנייה לתוך זכוכית נקייה. לאחר כל המדגם כבר extruded, לכבות את אספקת חנקן ולשחרר את הלחץ בצילינדר המדגם על ידי פתיחת שסתום הקלה בלחץ לאט. יוצקים את שלטי השומנים בחזרה לתוך גליל המדגם ולחזור על השלב הקודם תשע פעמים נוספות עבור סך של 10 שחול.טען את ההשעיה הזרימה לתוך cuvette המתאים, ולהכניס לתוך מכשיר פיזור האור הדינמי, להזין את פרטי המדגם, ולבצע את המדידה באמצעות התוכנה המשויכת. מניחים את תא הזטה בתא הדגימה, ומוודאים שהאלקטרודות נמצאות בקשר, וסוגרים את מכסה מחזיק הדגימה. בתוכנה המשויכת, הזן את הפרטים לדוגמה ואסוף מדידות.הכנס את חיישן גביש הקוורץ המקודד של סיליקה למודול הזרימה, והבטח שצורת ה- T על הגביש תתיישר עם צורת ה- T במודול ותברג את מודול הזרימה סגור. במכשירים עם תאים מרובים, bilayers נוספים ניתן ליצור במקביל. חבר את הצינורות והשקע למודול הזרימה והמשאבה.מניחים את הצינורות לתוך שומרי ההחזקה וסוגרים את המכסה של מערכת המנתח. מניחים מיכל פסולת בשקע המשאבה כדי לאסוף פתרונות שהוצאו. כדי לבצע את הניקוי, הפעל תחילה את המשאבה והגדר את מהירות הזרימה ל-400 מיקרוליטרים לדקה.הכנס את צינורות הכניסה למים טהורים במיוחד ולזרום חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. החלף צינורות לתוך SDS ולהזרים חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. מעבירים צינורות בחזרה למים טהורים במיוחד וזורמים 10 עד 20 מיליליטר דרך המודול.לבסוף, לזרום אוויר דרך המודול עד שלא נאסף פתרון שנותר. הסר את החיישן ממודול הזרימה ושטוף את החיישן במים טהורים במיוחד. כונן החיישן ואת מודול הזרימה עם זרם גז חנקן, מוודא כי האלקטרודה תמיד נשאר ללא כל נוזל.במכסה המנוע הכימי, הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למכשיר ניקוי אולטרה סגול או אוזון. הפעל את המכשיר ולאפשר טיפול במשך שתי דקות לפחות. הסר את החיישנים בזהירות והחזר אותם לתוך מודול הזרימה.הפעל את מכשיר המנתח כדי לחבר את התוכנה המשויכת ולהגדיר את הטמפרטורה לערך הרצוי ליצירת דו-שכבתי השומנים התומך. אפשר לטמפרטורה להתייצב לקלט הרצוי. קבע את תצורת המדידה ומצא את כל תדרי התהודה של החיישן, ופיזור צלילים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13 לפני תחילת המדידה.אפשר ל-Tris נתרן כלוריד לזרום דרך המודול במשך חמש עד עשר דקות, מה שמבטיח שהשדר הבסיסי ישתנה או דלתא F ושינוי פיזור או ערכי דלתא D בנוזל יישארו יציבים. עצרו את המשאבה, הסירו את צינורות הכניסה מתמיסת טריס נתרן כלורי, והכניסו אותה בזהירות לתמיסת השומנים. זרימה אחורית למשך חמש שניות כדי להסיר את כל בועות האוויר מהצינורות בפרצון, ולאחר מכן להמשיך את הזרימה קדימה.הפעל מחדש את המדידה בתוכנה כדי לאפס את קו הבסיס. לזרום שלטי שומנים עד היווצרות bilayer הוא ציין בזמן אמת בתוכנה לרכישת נתונים. לאחר מכן חזור על שלב זה כדי לשנות את צינורות ההכנסה של שלל השומנים בחזרה למאגר נתרן כלורי טריס.הוסף חמישה microliters של פתרון השומנים לתא התורם, שהוא דיפלואוריד פוליווינילידן נקבובי 96 היטב צלחת מסנן רב מסך עם גודל נקבובית 0.45 מיקרו מטר. מיד להטביע את צלחת המסנן לתוך תא הקבלה, שהוא צלחת מקלט תובלה המכיל 300 microliters של תמיסת מלח חוצץ פוספט. הוסף 200 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חוצץ פוספט לתא תורם התחבורה.בצע את השלבים הקודמים של עצירת המשאבה ושינוי צינורות הכניסה לפתרון ארסילי שומנים וצפייה היווצרות bilayer, ולאחר מכן לשנות את צינורות הכניסה לתוך פתרון אלפא הלילי או AH פפטיד. הצג את הפתרון לתוך מודול הזרימה עד שינוי תדירות ושינוי פיזור נצפים מתוספת הפתרון החדשה. עצרו את המשאבה ואפשרו לפפטיד AH לדגור עם שלל במשך 10 דקות.החליפו את צינורות הכניסה ל-Tris נתרן כלורי, והתחלו את הזרימה כדי להסיר את הפפטיד של AH משלשלות הקרועות, מה שמוביל להיווצרות מוצלחת של דו-שכבתית שומנית. ראשית, להזרים את ממס המולקולה, ולאחר מכן, להעביר את צינורות הכניסה לתוך הפתרון המכיל את המולקולה של עניין ולזרום במשך חמש דקות לפחות. אם תרצה, לעצור את הזרימה ולאפשר לנוזל המכיל את המולקולה הרצויה לדגור עם bilayer.לשנות את צינורות המפרצון בחזרה לממס המולקולה לבד. לזרום במשך חמש דקות לפחות, ולאחר מכן להעביר את צינורות הכניסה לתוך טריס נתרן כלורי, ולזרום במשך חמש דקות לפחות. בתוכנה, הפסק את המדידה, שמור את הקובץ והפסק את המשאבה.מיד לאחר שלבים קודמים עבור bilayer מושעה שומנים חד שומנים או עבור bilayer מושעה שומנים מרובים, להסיר PBS מתא צלחת מסנן התורם ולהחליף עם 200 microliters של פתרון הבדיקה. מיד לשקוע בלוח מקלט תחבורה חדש עם 300 microliters של PBS. לאחר דגירה עם נדנדה עדינה במשך שעתיים ב 25 מעלות צלזיוס, לאסוף 150 microliters של הפתרון מן התורם ותאי הקבלה.מדוד את ריכוז המולקולה בשתי הדגימות בשיטה מתאימה המבוססת על תכונות של מולקולה זו. גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של שלל מחשב ביצה חד שומנים, ושני הרכבים ארסיות שומנים מרובים הושוו. התפלגות הגודל של שלל מחשב הביצה ושלשלות מרובות שומנים היו כמעט זהות.שלל אחד מרובה שומנים של ביצים ומחשב אישי טעונים לרעה, בעוד שני שלטי שלטי שומנים מרובים טעונים באופן חיובי. שלפוחיות מחשב ביצה חד-שומנית נספגות בקלות על פני השטח, כפי שמוצג על ידי הירידה בשינוי התדר, ועלייה בשינוי פיזור, ואחריו קרע ספונטני. שלטי שומנים מרובים נספגים על פני השטח, אבל דורשים את התוספת של פפטיד AH כדי לקרוע את שלל, וכתוצאה מכך היווצרות bilayer השומנים.עם bilayers שומנים נתמכים, שינוי תדירות ושינוי פיזור ניתן לנתח לפני ואחרי הצגת תרכובת של עניין. לדוגמה, אינטראקציות של DEHP ורעיל סביבתי עם חד נתמך ורב שכבתי על ידי שכבות נחקרו. רמות דומות של ספיגת DEHP נצפו עבור שני סוגי bilayer השומנים.עם זאת, הבדלים בשינוי פיזור נצפו בין bilayers עם שינוי פיזור גדול יותר לראות עבור bilayer PC ביצה לעומת bilayer אחד שומנים מרובים. חלחלה קטנה נצפתה הן עבור דו-שכבתיות חד-שומניות והן עבור שכבות מרובות שומנים. בעקבות הליך זה, ניתן לפתח מגוון של תאים מחקים שכבות שומנים כדי לאפשר הקרנה ללא תאים של אינטראקציות מולקולריות עם תרכובות החל תרופות רעילים סביבתיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...