Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
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Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell'ambito della sovvenzione n. 1942418 assegnata ad AS e di una borsa di ricerca universitaria della National Science Foundation assegnata a C.M.B.H., nell'ambito della sovvenzione n. 1644760. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation. Gli autori ringraziano il Dr. Noel Vera-González per l'acquisizione dei dati di caratterizzazione delle vescicole lipidiche. Gli autori ringraziano il professor Robert Hurt (Brown University) per l'uso del suo Zetasizer. Gli autori ringraziano la Brown University Mass Spectrometry Facility, in particolare il Dr. Tun-Li Shen per l'assistenza nella quantificazione della composizione lipidica.

1. Sviluppo di vescicole uni-lipidiche
<ol><li>Metodo di idratazione a film sottile<ol>
<li>Preparazione e conservazione di soluzioni lipidiche NOTA: Tutti i passaggi che utilizzano il cloroformio devono essere eseguiti in una cappa aspirante chimica. Il cloroformio deve sempre essere pipettato utilizzando punte per pipette in fibra di carbonio sicure per solventi. Le soluzioni contenenti cloroformio devono essere sempre conservate in flaconcini di vetro.<ol>
<li>Preparare una soluzione madre lipidica da 10 mg/mL ag...

Questo protocollo consente la formazione di vescicole lipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Qui vengono presentati i passaggi critici per formare ciascuna di queste strutture. Quando si formano vescicole lipidiche, è importante estrudere al di sopra della temperatura di transizione del lipide39. Quando è al di sotto della temperatura di transizione, il lipide è fisicamente presente nella sua fase gel ordinata39. In questa fase ordin...

La membrana cellulare, composta principalmente da fosfolipidi, colesterolo e proteine, è un componente cruciale di tutte le cellule viventi1. Con l'organizzazione guidata dall'anfifilicità lipidica, la membrana cellulare funziona come una barriera protettiva e regola il modo in cui la cellula interagisce con l'ambiente circostante2. Diversi processi cellulari dipendono dalla composizione lipidica e proteica della membrana1,2. Ad esempio, le interazioni della membrana cellulare sono importanti per un'efficace somministrazione di farmaci3. Prodotti farmaceutici, biologici, nanomateriali, tossine biologiche e sostanze tossiche ambientali possono influire sull'integrità di una membrana cellulare, influenzando così la funzione cellulare4. La costruzione di modelli di membrana che imitano le cellule in vitro basati sulla composizione lipidica delle membrane cellulari ha il potenziale per fornire strumenti facili per migliorare notevolmente lo studio del potenziale impatto di questi materiali sulle cellule.
I doppi strati lipidici modello includono vescicole lipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. I doppi strati lipidici supportati sono un modello della membrana cellulare fosfolipidica comunemente usata nelle applicazioni biotecnologiche in cui le vescicole lipidiche vengono rotte su un materiale di substrato supportato5,6,7,8,9. Una tecnica comune utilizzata per monitorare la formazione di doppio strato è la microbilancia a cristallo di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che esamina l'adsorbimento delle vescicole rispetto alle proprietà liquide sfuse in situ8,10,11, 12,13,14 . In precedenza, QCM-D è stato utilizzato per dimostrare che in condizioni di flusso, una volta che una copertura critica delle vescicole delle vescicole lipidiche di fosfatidilcolina (PC) è raggiunta sulla superficie, si rompono spontaneamente in rigidi doppi strati lipidici15. Lavori precedenti hanno anche studiato la formazione di doppi strati lipidici supportati con composizioni lipidiche variabili16,l'incorporazione di proteine lipidiche17, 18,19e l'utilizzo di cuscini polimerici20,producendo doppi strati lipidici supportati in grado di imitare vari aspetti della funzione della membrana cellulare.
I doppi strati lipidici sono stati utilizzati per imitare varie barriere biologiche dai livelli subcellulari a quelli degli organi, tra cui mitocondrio, globuli rossi e membrane delle cellule epatiche alterando i componenti fosfolipidi, colesterolo e glicolipidi21. Queste vescicole multilipidiche più complesse possono richiedere metodi aggiuntivi per ottenere la rottura delle vescicole, a seconda della composizione lipidica. Ad esempio, studi precedenti hanno utilizzato un peptide α-elicoidale (AH) derivato dalla proteina non strutturale 5A del virus dell'epatite C per indurre la formazione di doppio strato destabilizzando le vescicole lipidiche adsorbite22,23. Utilizzando questo peptide AH, i doppi strati lipidici supportati che imitano le cellule placentari sono stati precedentemente formati24. Il grande potenziale dei doppi strati lipidici supportati per applicazioni biomediche è stato dimostrato con indagini che abbracciano il trasporto molecolare e delle nanoparticelle25,26,le interazioni tossicorie ambientali27,l'assemblaggio e la funzione proteica17,18,19,la disposizione e l'inserimento dei peptidi28,29,lo screening farmacologico30e le piattaforme microfluidiche31.
I doppi strati lipidici sospesi sono stati utilizzati per studi di screening farmaceutico tramite un test parallelo di permeabilità della membrana artificiale (PAMPA) in cui un doppio strato lipidico è sospeso attraverso un inserto idrofobico poroso32,33,34,35. Sono stati sviluppati modelli lipidici PAMPA per diverse interfacce biologiche tra cui le interfacce sangue-cervello, buccale, intestinale e transdermica36. Combinando le tecniche a doppio strato lipidico supportate e PAMPA, è possibile studiare a fondo l'adsorbimento, la permeabilità e l'incorporazione di composti all'interno dei componenti lipidici di un tessuto o di un tipo di cellula desiderato.
Questo protocollo descrive la fabbricazione e l'applicazione di modelli lipidici a doppio strato di membrana cellulare in vitro per studiare diverse interazioni molecolari. La preparazione di entrambi i doppi strati lipidici e multilipidici supportati e sospesi è dettagliata. Per formare un doppio strato lipidico supportato, le vescicole lipidiche vengono prima sviluppate utilizzando metodi di idratazione ed estrusione a film sottile seguiti da caratterizzazione fisico-chimica. Viene discussa la formazione di un doppio strato lipidico supportato utilizzando il monitoraggio QCM-D e la fabbricazione di membrane lipidiche sospese per l'uso in PAMPA. Infine, vengono esaminate vescicole multilipidiche per lo sviluppo di membrane che imitano cellule più complesse. Utilizzando entrambi i tipi di membrane lipidiche fabbricate, questo protocollo dimostra come questo strumento possa essere utilizzato per studiare le interazioni molecolari. Nel complesso, questa tecnica costruisce cellule che imitano i doppi strati lipidici con elevata riproducibilità e versatilità.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Le membrane cellulari modello sono un utile strumento di screening con applicazioni che vanno dalla scoperta precoce di farmaci agli studi di tossicità. La membrana cellulare è una barriera protettiva cruciale per tutti i tipi di cellule, separando i componenti cellulari interni dall'ambiente extracellulare. Queste membrane sono composte in gran parte da un doppio strato lipidico, che contiene gruppi di testa idrofili esterni e gruppi di coda idrofobici interni, insieme a varie proteine e colesterolo. La composizione e la struttura dei lipidi stessi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della funzione biologica, comprese le interazioni tra le cellule e il microambiente cellulare, che può contenere farmaci, tossine biologiche e sostanze tossiche ambientali. In questo studio, vengono descritti metodi per formulare cellule uni-lipidiche e multi-lipidiche supportate e sospese che imitano i doppi strati lipidici. In precedenza, sono stati sviluppati doppi strati lipidici uni-lipidici di fosfatidilcolina (PC) e doppi strati lipidici ispirati al trofoblasto placentare multilipidico per l'uso nella comprensione delle interazioni molecolari. Qui verranno presentati i metodi per ottenere entrambi i tipi di modelli a doppio strato. Per le cellule che imitano i doppi strati multilipidici, la composizione lipidica desiderata viene prima determinata tramite estrazione lipidica da cellule primarie o linee cellulari seguita da cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Utilizzando questa composizione, le vescicole lipidiche vengono fabbricate utilizzando un metodo di idratazione ed estrusione a film sottile e il loro diametro idrodinamico e il potenziale zeta sono caratterizzati. I doppi strati lipidici supportati e sospesi possono quindi essere formati utilizzando la microbilancia di cristallo di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D) e su una membrana porosa per l'uso in un saggio di permeabilità della membrana artificiale parallela (PAMPA), rispettivamente. I risultati rappresentativi evidenziano la riproducibilità e la versatilità dei modelli lipidici a doppio strato di membrana cellulare in vitro. I metodi presentati possono aiutare nella valutazione rapida e facile dei meccanismi di interazione, come la permeazione, l'adsorbimento e l'incorporamento, di varie molecole e macromolecole con una membrana cellulare, aiutando nello screening dei farmaci candidati e nella previsione della potenziale tossicità cellulare.

Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi per la formazione di doppi strati lipidici supportati e sospesi (Figura 1). Il primo passo per formare un doppio strato lipidico supportato è quello di sviluppare vescicole lipidiche. Il mini estrusore consente di preparare piccoli volumi di vescicole lipidiche (1 mL o meno), mentre il grande estrusore consente di preparare 5-50 mL di vescicole lipidiche in un unico lotto. Le distribuzioni dimensionali delle vescicole unilipidiche formate dal...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

La costruzione di membrane lipidiche a doppio strato descritte in questo protocollo può essere utilizzata per ottenere informazioni cruciali sulle interazioni della membrana con agenti farmaceutici, tossici ambientali e persino composti biologici. Queste tecniche possono essere utilizzate per fabbricare membrane di varia complessità liquida e per valutare la permeabilità, l'assorbimento e l'incorporazione dei composti all'interno delle membrane. Per iniziare, aggiungere il volume appropriato di soluzione madre lipidica in un vile di vetro pulito per ottenere una concentrazione finale di vescicola di 2,5 milligrammi per millilitro dopo la reidratazione.Rimuovere il cloroformio dalla soluzione lipidica, utilizzando un flusso di azoto gassoso. Per garantire la completa rimozione del cloroformio, collegare il film lipidico essiccato al vuoto per almeno quattro ore. Reidratare il film lipidico essiccato con un volume richiesto di tampone di cloruro di sodio Tris per ottenere la concentrazione finale di vescicola di 2,5 milligrammi per millilitro e vortice per circa 15-30 secondi.Trasferire la sospensione della vescicola in un contenitore con ghiaccio secco fino a quando non viene congelata per circa 30 minuti. Dopo che il campione è completamente congelato, scongelare la sospensione in un bagno d'acqua da 30 a 40 gradi Celsius. Vortice la sospensione di vescicole scongelate.Per fare un millilitro o meno di vescicole, ottenere un mini estrusore. Pre-bagnare un supporto filtrante con acqua ultra pura, quindi posizionarlo sulla superficie di supporto della membrana all'interno dell'anello O. Ripetere per il secondo supporto interno della membrana.Posizionare un supporto interno della membrana nell'involucro esterno dell'estrusore. Posizionare una membrana in policarbonato da 100 nanometri sul supporto interno della membrana direttamente sopra il supporto del filtro. Posizionare il secondo supporto interno della membrana nell'involucro esterno dell'estrusore con l'anello O e il lato di supporto del filtro rivolti verso la membrana in policarbonato.Fissare il cuscinetto in politetrafluoroetilene nel nodo di fissaggio e avvitarlo chiuso con l'involucro esterno dell'estrusore. Agganciare l'estrusore nel blocco riscaldante. Caricare la sospensione della vescicola lipidica in una delle siringhe e posizionare la siringa nel blocco termico dell'estrusore, inserendo completamente l'ago in un'estremità dell'estrusore.Inserire la seconda siringa vuota sul lato opposto e bloccare entrambe le siringhe utilizzando le clip del braccio sul blocco termico. Spingere lentamente la sospensione della vescicola nella siringa vuota e poi di nuovo nella siringa originale. Ripetere altre 20 volte per un totale di 21 passaggi attraverso la membrana in policarbonato.Trasferire le vescicole lipidiche in un vile di vetro pulito per la conservazione. Per estrudere da cinque a 50 millilitri di vescicole, assemblare il grande estrusore posizionando il supporto dello schermo del foro grande, il disco centrato, i dischi di scarico e la membrana in policarbonato nello spazio nel supporto inferiore dell'estrusore. Collegare i supporti superiore e inferiore dell'estrusore utilizzando le quattro viti e serrare.Fissare l'unità estrusore al cilindro del campione strofinandolo sul fondo e stringendolo con una chiave inglese per fissarlo. Riempire il cilindro del campione con acqua ultrapura ed estrudere l'acqua attraverso l'unità estrusore prima di aggiungere il campione nel cilindro del campione. Aggiungere la sospensione della vescicola lipidica nel cilindro del campione e avvitare la parte superiore chiusa.Aumentare lentamente la pressione fino a quando il campione inizia a gocciolare dall'unità di estrusore ad una velocità di circa due o tre gocce al secondo in un vile di vetro pulito. Una volta che tutto il campione è stato estruso, spegnere l'alimentazione di azoto e rilasciare la pressione nel cilindro del campione aprendo lentamente la valvola limitatrice di pressione. Versare le vescicole lipidiche nel cilindro del campione e ripetere il passaggio precedente altre nove volte per un totale di 10 estrusi.Caricare la sospensione della vescicola in una cuvetta appropriata e inserirla nello strumento di diffusione dinamica della luce, inserire i dettagli del campione ed eseguire la misurazione utilizzando il software associato. Posizionare la cella zeta nella camera del campione, assicurandosi che gli elettrodi siano a contatto e chiudere il coperchio del portacampioni. Nel software associato, immettere i dettagli del campione e raccogliere le misurazioni.Inserire il sensore di cristallo di quarzo codificato in silice nel modulo di flusso, assicurandosi che la forma a T sul cristallo si allinei con la forma a T sul modulo e avvitare il modulo di flusso chiuso. Negli strumenti con più camere, è possibile formare in parallelo ulteriori doppi strati. Collegare il tubo di ingresso e di uscita al modulo di flusso e alla pompa.Posizionare il tubo nelle protezioni di tenuta e chiudere il coperchio del sistema di analisi. Posizionare un contenitore per i rifiuti all'uscita della pompa per raccogliere le soluzioni esaurite. Per eseguire la pulizia, accendere prima la pompa e impostare la velocità del flusso su 400 microlitri al minuto.Inserire il tubo di ingresso in acqua ultra pura e far scorrere da cinque a 10 millilitri attraverso il modulo. Commutare i tubi in SDS e far scorrere da cinque a 10 millilitri attraverso il modulo. Trasforma i tubi in acqua ultra pura e fai scorrere da 10 a 20 millilitri attraverso il modulo.Infine, far scorrere l'aria attraverso il modulo fino a quando non viene raccolta alcuna soluzione rimanente. Rimuovere il sensore dal modulo di flusso e risciacquare il sensore con acqua ultra pura. Azionare il sensore e il modulo di flusso con un flusso di gas azoto, assicurandosi che l'elettrodo rimanga sempre privo di liquidi.In una cappa chimica, inserire il sensore di cristallo di quarzo rivestito di silice in uno strumento di pulizia a raggi ultravioletti o ozono. Accendere lo strumento e lasciare il trattamento per almeno due minuti. Rimuovere accuratamente i sensori e reinserirli nel modulo di flusso.Accendere lo strumento analizzatore per collegare il software associato e impostare la temperatura sul valore desiderato per formare il doppio strato lipidico di supporto. Lasciare che la temperatura si stabilizzi all'ingresso desiderato. Configurare la misurazione e trovare tutte le frequenze di risonanza del sensore e la dissipazione per i toni tre, cinque, sette, nove, 11 e 13 prima di iniziare la misurazione.Consentire al cloruro di sodio Tris di fluire attraverso il modulo da cinque a 10 minuti, assicurando che la variazione di frequenza di base o Delta F e la variazione di dissipazione o i valori Delta D nel liquido rimangano stabili. Arrestare la pompa, rimuovere il tubo di ingresso dalla soluzione di cloruro di sodio Tris e inserirlo con attenzione nella soluzione di vescicola lipidica. Riflusso per cinque secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria dal tubo di ingresso, quindi continuare il flusso in avanti.Riavviare la misurazione nel software per azzerare la linea di base. Flusso di vescicole lipidiche fino a quando la formazione di due strati viene osservata in tempo reale nel software di acquisizione dati. Quindi ripetere questo passaggio per cambiare il tubo di ingresso dalle vescicole lipidiche al tampone di cloruro di sodio Tris.Aggiungere cinque microlitri della soluzione lipidica al compartimento donatore, che è una piastra filtrante multischermo porosa in polivinilidene difluoruro 96 con dimensioni dei pori di 0,45 micrometri. Immergere immediatamente la piastra filtrante nel compartimento accettore, che è una piastra ricevente di trasporto contenente 300 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Aggiungere 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato al compartimento del donatore di trasporto.Seguire i passaggi precedenti di arresto della pompa e di sostituzione del tubo di ingresso in soluzione di vescicola lipidica e osservare la formazione di doppio strato, quindi modificare il tubo di ingresso nella soluzione alfa elicoidale o peptidica AH. Introdurre la soluzione nel modulo di flusso fino a quando non si osservano cambiamenti di frequenza e cambiamenti di dissipazione dalla nuova aggiunta di soluzione. Arrestare la pompa e lasciare incubare il peptide AH con le vescicole per 10 minuti.Cambiare il tubo di ingresso in cloruro di sodio Tris e avviare il flusso per rimuovere il peptide AH dalle vescicole rotte, portando alla formazione di successo di un doppio strato lipidico. In primo luogo, far scorrere il solvente della molecola, quindi, commutare il tubo di ingresso nella soluzione contenente la molecola di interesse e fluire per almeno cinque minuti. Se lo si desidera, interrompere il flusso e consentire al liquido contenente la molecola desiderata di incubare con il doppio strato.Riportare il tubo di ingresso al solo solvente molecolare. Scorrere per almeno cinque minuti, quindi commutare il tubo di ingresso in cloruro di sodio Tris e scorrere per almeno cinque minuti. Nel software, interrompere la misurazione, salvare il file e arrestare la pompa.Immediatamente dopo i passaggi precedenti per un doppio strato sospeso unilipidico o per un doppio strato sospeso multilipidico, rimuovere PBS dal compartimento della piastra filtrante del donatore e sostituirlo con 200 microlitri della soluzione di prova. Immergersi immediatamente in una nuova piastra del ricevitore di trasporto con 300 microlitri di PBS. Dopo l'incubazione con un leggero dondolo per due ore a 25 gradi Celsius, raccogliere 150 microlitri della soluzione dai compartimenti donatore e accettore.Misurare la concentrazione della molecola in entrambi i campioni utilizzando un metodo appropriato basato sulle proprietà di questa molecola. Sono state confrontate le dimensioni, la polidispersità e il potenziale Zeta delle vescicole PC dell'uovo unilipidico e due composizioni di vescicole multi lipidiche. La distribuzione dimensionale delle vescicole dell'uovo PC e delle vescicole multi lipidiche era quasi identica.Sia le vescicole dell'uovo che quelle multi-lipidiche pc sono state caricate negativamente, mentre le due vescicole multilipidiche sono state caricate positivamente. Vescicole di PC uovo unilipidico facilmente assorbite in superficie, come dimostrato dalla diminuzione del cambiamento di frequenza e dall'aumento del cambiamento di dissipazione, seguito da rottura spontanea. Vescicole multilipidiche assorbite in superficie, ma richiedono l'aggiunta di peptide AH per rompere le vescicole, con conseguente formazione di doppio strato lipidico.Con i doppi strati lipidici supportati, il cambiamento di frequenza e il cambiamento di dissipazione possono essere analizzati prima e dopo l'introduzione di un composto di interesse. Ad esempio, sono state studiate le interazioni di DEHP e tossico ambientale con uni supportato e multistrato da strati. Livelli simili di assorbimento di DEHP sono stati osservati per entrambi i tipi di doppio strato lipidico.Tuttavia, sono state osservate differenze nel cambiamento di dissipazione tra i due strati con un cambiamento di dissipazione più grande osservato per il doppio strato PC dell'uovo rispetto al doppio strato multi lipidico. È stata osservata una piccola permeazione sia per i doppi strati uni-lipidici che multi-lipidici. Seguendo questa procedura, è possibile sviluppare una varietà di cellule che imitano i doppi strati lipidici per consentire lo screening senza cellule delle interazioni molecolari con composti che vanno dai prodotti farmaceutici alle sostanze tossiche ambientali.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

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Ricerca

Bioingegneria

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Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...