Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
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この資料は、A.S.に授与されたグラント・ノー・1942418の下で国立科学財団が支援する仕事と、グラント・No.1644760の下でC.M.B.H.に授与された国立科学財団大学院研究フェローシップに基づいています。この資料で表明された意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。著者らは、ノエル・ベラ・ゴンサレス博士の脂質ベシクル特徴付けデータ取得に感謝する。著者らは、彼のゼータサイザーの使用のためにロバート・ハート教授(ブラウン大学)に感謝します。著者らは、ブラウン大学質量分析施設、特にTun-Liシェン博士に脂質組成の定量化に関する支援を受け付けたことに感謝している。

1. ユニリピッドベシクルの開発
<ol><li>薄膜ハイドレーション法<ol>
<li>脂質ストック溶液の調製と保存 注:クロロホルムを使用するすべてのステップは、化学ヒュームフードで行う必要があります。クロロホルムは、常に溶媒安全な炭素繊維ピペットチップを使用して配管する必要があります。クロロホルムを含む溶液は、常にガラスバイアルに保存する必要があります。<ol>
<li>適切な量の...

このプロトコルは、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層の形成を可能にする。ここでは、これらの構造を形成するための重要なステップを示します。脂質小胞を形成する場合、脂質39の転移温度を超えて押し出することが重要である。転移温度を下回ると、脂質は、その秩序ゲル相39に物理的に存在する。この順序付けられた段階では...

細胞膜は、主にリン脂質、コレステロール、およびタンパク質から構成され、全ての生細胞1の重要な構成要素である。脂質両親媒性によって駆動される組織では、細胞膜は保護障壁として機能し、細胞がその周囲の環境とどのように相互作用するかを調節する2。いくつかの細胞プロセスは、膜1、2の脂質およびタンパク質組成に依存する。例えば、細胞膜相互作用は、効果的な薬物送達3にとって重要である。医薬品、生物学的製剤、ナノ材料、生物学的毒素、および環境毒性物質は、細胞膜の完全性に影響を与え、細胞機能4に影響を及ぼす可能性がある。細胞膜の脂質組成に基づくインビトロ細胞模倣膜モデルの構築は、細胞に対するこれらの材料の潜在的な影響の研究を大幅に強化するファシリティツールを提供する可能性を秘めています。
モデル脂質二重層は、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を含む。サポートされる脂質二重層は、サポートされる基板材料5、6、7、8、9で脂質小胞が破裂するバイオテクノロジー用途で一般的に使用されるリン脂質細胞膜のモデルである。二重層形成を監視するために使用される一般的な技術の1つは、水晶結晶マイクロバランスと散逸モニタリング(QCM-D)であり、それは、その場8、10、11、12、13、14のバルク液体特性と比較して小胞の吸着を調べる.以前、QCM-Dは、フロー条件下で、一度ホスファチジルコリン(PC)脂質小胞の臨界小胞被覆が表面上で達成されることを実証するために使用されてきたが、それらは、硬質脂質二重層15に自発的に破裂する。また、脂質組成16の様々な脂質を用いた支持脂質二重層形成、脂質タンパク質17、18、19の組込み、およびポリマークッション20を利用して、細胞膜機能の様々な局面を模倣し得る支持脂質二重層を得たことも調べてきた。
脂質二重層は、リン脂質、コレステロール、および糖脂質成分21を改変することにより、ミトコンドリア、赤血球、および肝臓細胞膜を含む細胞下から器官レベルまで様々な生物学的障壁を模倣するために使用されてきた。これらのより複雑な多脂質小胞は、脂質組成に応じて、小胞破裂を達成するための追加の方法を必要とするかもしれない。例えば、以前の研究では、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質5Aに由来するαヘリカル(AH)ペプチドを利用して、吸着した脂質小胞22,23を不安定化させることによって二層形成を誘導している。このAHペプチドを用いて、胎盤細胞を模倣した支持脂質二重層が以前に形成された24.生体医学用途に対するサポート脂質二重層の大きな可能性は、分子およびナノ粒子輸送25、26、環境毒性相互作用27、タンパク質組立および機能17、18、19、ペプチド配置および挿入28、29、薬物スクリーニング30、およびマイクロ流体プラットフォーム31に及ぶ調査で実証されている。
懸濁された脂質二重層は、多孔質疎水性インサート32、33、34、35に脂質二重層が懸濁される平行人工膜透過性アッセイ(PAMPA)を介して医薬スクリーニング試験に使用されている。PAMPA脂質モデルは、血液脳、頬、腸、経皮インターフェース36を含む異なる生物学的インターフェースのために開発された。支持脂質二重層とPAMPAの技術を組み合わせることにより、所望の組織または細胞型の脂質成分内に化合物の吸着、透過性、および埋め込みが徹底的に検討できる。
このプロトコルは、いくつかの分子相互作用を調査するために 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの製造と適用について説明する。ユニ脂質とマルチ脂質の両方の調製は、二重層を支持し、懸濁した脂質をサポートし、詳細である。脂質小胞は、脂質二重層を形成するために、まず薄膜水和法および押出法を用いて開発され、その後に物理化学的特徴付けが行われます。PAMPAで使用するための懸濁型脂質膜のQCM-Dモニタリングおよび製造を用いた支持脂質二重層の形成が議論される。最後に、より複雑な細胞模倣膜の発達のための多脂質小胞を調べる。このプロトコルは、両方のタイプの作製脂質膜を使用して、このツールを使用して分子相互作用を研究する方法を示しています。全体的に、この技術は、高い再現性と汎用性を有する脂質二重層を模倣する細胞を構築する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

モデル細胞膜は、創薬初期から毒性研究に至るまでの用途を備えた有用なスクリーニングツールです。細胞膜は、細胞外環境から細胞内成分を分離し、すべての細胞タイプのための重要な保護障壁です。これらの膜は、様々なタンパク質およびコレステロールと共に、外側の親水性ヘッド基および内側の疎水性尾基を含む脂質二重層から構成される大部分を占める。脂質の組成と構造は、細胞と細胞微小環境との相互作用を含む生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たします。本研究では、脂質二重層を模倣するユニ脂質およびマルチ脂質を支持し、懸濁細胞を処方する方法について説明する。以前は、分子相互作用を理解するために、ユニ脂質ホスファチジルコリン(PC)脂質二重層ならびに多脂質胎盤性栄養芽細胞に触発された脂質二重層が開発されました。ここでは、両層モデルの両方を達成するための方法を提示する。細胞模倣多重層の場合、所望の脂質組成物は、まず、一次細胞または細胞株からの脂質抽出を介して決定され、続いて液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)が続く。この組成物を用いて、脂質小胞は薄膜水和および押出方法を用いて作製され、それらの流体力学的直径およびゼータ電位が特徴付けられる。サポートされ、懸濁された脂質二重層は、次に、散逸モニタリング(QCM-D)と並列人工膜透過性アッセイ(PAMPA)で使用するための多孔質膜上の水晶マイクロバランスを使用して形成することができる。代表結果は 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの再現性と汎用性を強調しています。提示された方法は、細胞膜を有する様々な分子および高分子の浸透、吸着、埋め込みなどの相互作用メカニズムの迅速かつ容易な評価を助け、薬物候補のスクリーニングおよび潜在的な細胞毒性の予測に役立つ。

このプロトコルは、サポートされている脂質二重層を形成するための方法を詳述する(図1)。サポートされる脂質二重層を形成するための最初のステップは、脂質小胞を開発することです。小型押出機は少量の脂質小胞を調製することを可能にする(1mL以下)、大きい押出機は1つのバッチで調製される脂質小胞の5-50 mLを可能にする。ミニまたは大型押出機のいずれかによっ...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

このプロトコルに記載されている脂質二重層膜の構築は、医薬品、環境毒性物質、さらには生物学的化合物との膜相互作用に関する重要な情報を得るために使用することができる。これらの技術は、様々な液体の複雑さの膜を製造するために使用され、膜内の化合物の透過性、吸収、および埋め込みを評価するために使用することができます。まず、脂質ストック溶液の適切な量をクリーンガラスのvileに加え、水分補給後に1ミリリットル当たり2.5ミリグラムの最終小胞濃度を達成します。窒素ガスの流れを用いて、脂質溶液からクロロホルムを除去する。クロロホルムを完全に除去するために、乾燥した脂質膜を真空に少なくとも4時間接続します。乾燥した脂質膜をトリスナトリウムクロリドバッファーの必要量で水分補給し、1ミリリットル当たり2.5ミリグラムの最終小胞濃度を得るために、約15〜30秒間渦を生じさせる。ベシクル懸濁液をドライアイス付きの容器に移し、約30分間凍結します。試料を完全に凍結した後、30〜40度の摂氏水浴で懸濁液を解凍する。解凍された小胞懸濁液を渦。1ミリリットル以下の小胞を作るためには、ミニ押出機を入手する。フィルターサポートを超純水で予め濡らし、その後、Oリング内の膜支持面に置きます。2番目の内部膜支持について繰り返します。押出機の外側のケーシングに1つの内部膜支持体を置く。100ナノメートルのポリカーボネート膜を、フィルター支持体の上に直接内部膜支持体に置きます。第2の内部膜支持体を、ポリカーボネート膜に面したOリングとフィルター支持側の押出機外ケースに配置します。ポリテトラフルオロエチレンベアリングをリテーナーノットに取り付け、押出機の外枠で締めます。押出機を加熱ブロックにクリップします。脂質小胞懸濁液を注射器の1つにロードし、注射器を押出機のヒートブロックに配置し、針を押出機の一端に完全に挿入します。2番目の空のシリンジを反対側に挿入し、ヒートブロックのアームクリップを使用して両方のシリンジをロックします。小胞の懸濁液を空のシリンジにゆっくりと押し込み、元のシリンジに戻します。ポリカーボネート膜を通過する合計21回に対してさらに20回繰り返します。脂質小胞を清潔なガラスの下に移して保管してください。5~50ミリリットルの小胞を押し出すために、大きな穴スクリーン支持体、中央のディスク、ドレインディスク、ポリカーボネート膜を押出し下げ支持体のスペースに配置して大きな押出機を組み立てます。4本のネジを使用して押出機の上下支持を接続し、締め付けします。押出機ユニットをサンプルシリンダーに取り付け、底部にスクラブし、レンチで締めて固定します。サンプルシリンダーに超純水を充填し、サンプルをサンプルシリンダーに追加する前に、押出機ユニットを通して水を押し出します。脂質ベシクル懸濁液をサンプルシリンダーに加え、上部を閉じます。サンプルが1秒あたり約2〜3滴の速度で押出機ユニットから滴り始めるまで、ゆっくりと圧力を高め、きれいなガラスの下品に入ります。すべてのサンプルが押し出されたら、窒素供給をオフにし、圧力リリーフバルブをゆっくりと開けてサンプルシリンダーの圧力を解放します。脂質小胞をサンプルシリンダーに戻し、前のステップをさらに9回繰り返して合計10回の押出を行います。ベシクル懸濁液を適切なキュベットに積み込み、動的光散乱計に挿入し、サンプルの詳細を入力し、関連するソフトウェアを使用して測定を行います。ゼタセルをサンプルチャンバに入れ、電極が接触していることを確認し、サンプルホルダーの蓋を閉じます。関連ソフトウェアで、サンプルの詳細を入力し、測定値を収集します。シリカコード化された水晶センサーをフローモジュールに挿入し、結晶上のT字型がモジュールのT形状と一致していることを確認し、フローモジュールを閉じます。複数のチャンバーを備えた機器では、追加の二重層を並列に形成することができます。流入口と出口チューブをフローモジュールとポンプに接続します。チューブを保持ガードに入れ、アナライザーシステムの蓋を閉じます。ポンプの出口に廃棄物容器を置き、使用済みのソリューションを収集します。クリーニングを行う場合は、まずポンプをオンにし、流速を毎分400マイクロリットルに設定します。入口チューブを超純水に挿入し、モジュールを通して5〜10ミリリットルを流します。チューブをSDSに切り替え、モジュールを通して5〜10ミリリットルを流します。チューブを超純水に戻し、モジュールを通して10〜20ミリリットルを流します。最後に、残りの溶液が回収されなくなるまで、モジュールを通して空気を流します。フローモジュールからセンサーを取り外し、超純水でセンサーをすすきます。センサーとフローモジュールを窒素ガス流で駆動し、電極が常に液体を使い果たさないようにします。化学ヒュームフードで、シリカコーティングされた水晶センサーを紫外線またはオゾン洗浄器具に挿入します。器械をオンにし、少なくとも2分間の処置を許可する。センサーを慎重に取り外し、フローモジュールに戻します。アナライザー装置をオンにして、関連するソフトウェアを接続し、支持脂質二重層を形成するための所望の値に温度を設定します。温度が目的の入力に安定するようにします。測定を構成し、すべてのセンサ共振周波数を検出し、測定を開始する前に、倍音3、5、7、9、11、および13の放散を検出します。トリス塩化ナトリウムがモジュールを5〜10分間流れ、ベースライン周波数変化またはデルタFおよび液体中の散逸変化またはデルタD値が安定していることを確認します。ポンプを停止し、トリス塩化ナトリウム溶液から入口チューブを取り出し、慎重に脂質ベシクル溶液に挿入します。流入口チューブから気泡を取り除き、次に前進流を続けるために5秒間逆流します。ベースラインをゼロにしてソフトウェアの測定を再開します。データ取得ソフトウェアにおいて二重層形成がリアルタイムに観察されるまでのフロー脂質小胞。次に、このステップを繰り返して、入口チューブを脂質小胞からトリス塩化ナトリウムバッファーに戻します。脂質溶液の5マイクロリットルをドナーコンパートメントに加え、これは、0.45マイクロメートルの細孔サイズを有する多孔性ポリビニリデンジフッ化96ウェルのマルチスクリーンフィルタープレートである。すぐにフィルタープレートをアクセプタコンパートメントに沈め、リン酸緩衝生理食塩水の300マイクロリットルを含む輸送受信機プレートである。リン酸緩衝生理食塩水を200マイクロリットルの輸送ドナーコンパートメントに加えます。ポンプを停止し、入口チューブを脂質ベシクル溶液に変更し、二重層形成を観察する前の手順に従い、次に入口チューブをアルファヘリカルまたはAHペプチド溶液に変更します。新しいソリューションの追加から周波数変化と散逸変化が観察されるまで、フローモジュールにソリューションを導入します。ポンプを停止し、AHペプチドが10分間小胞でインキュベートできるようにします。入口チューブをトリス塩化ナトリウムに切り替え、破裂した小胞からAHペプチドを除去する流れを開始し、脂質二重層の形成に成功する。まず、分子溶媒を流し、次に、インレットチューブを、目的の分子を含む溶液に切り替え、少なくとも5分間流れる。必要に応じて、流れを停止し、目的の分子を含む液体を二重層と共にインキュベートすることを可能にする。入口チューブを分子溶媒だけに戻します。少なくとも5分間流れ、次に入口チューブを塩化トリスナトリウムに切り替え、少なくとも5分間流します。ソフトウェアで、測定を停止し、ファイルを保存して、ポンプを停止します。ユニ脂質懸濁二重層またはマルチ脂質懸濁二重層の直前の手順の直後に、ドナーフィルタープレートコンパートメントからPBSを取り除き、200マイクロリットルの試験溶液に置き換えます。すぐに300マイクロリットルのPBSを備えた新しい輸送受信機プレートに沈水する。摂氏25度で2時間穏やかな揺れでインキュベーションした後、ドナーとアクセクサコンパートメントから溶液の150マイクロリットルを収集します。この分子の特性に基づいて適切な方法を用いて、両方のサンプル中の分子濃度を測定する。サイズ、多分散性、および、ユニリピッドエッグPC小胞のゼータ電位、および2つの多脂質小胞組成物を比較した。卵PC小胞と多脂質1小胞のサイズ分布はほぼ同じであった。卵とPCの両方の多脂質1小胞は負に電荷を帯び、多脂質2小胞は正に荷電した。ユニリピッドエッグPC小胞は、周波数変化の減少、および散逸変化の増加、続いて自発的破裂の増加によって示されるように、表面に容易に吸収される。多脂質小胞は、表面に吸収され、小胞を破裂させるためにAHペプチドの添加を必要とするが、脂質二重層形成をもたらす。脂質二重層をサポートすることで、周波数変化と散逸変化を、対象化合物の導入前後で分析することができます。例えば、DEHPと環境毒性物質と支持されたユニとの相互作用と層による多層化を調査した。同様のレベルのDEHP吸収が両方の脂質二重層タイプについて観察された。しかし、卵PC二重層に対して見られる大きな散逸変化を有する二重層間では、散逸変化の違いが、マルチ脂質1二重層と比較して観察された。ユニおよびマルチ脂質1つの二重層の両方について、ほとんど透過が認められなかった。この手順に従って、脂質二重層を模倣する様々な細胞を開発して、医薬品から環境毒性物質に至るまでの化合物との分子相互作用を無細胞でスクリーニングできるようにすることができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

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3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...