Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

이 자료는 그랜트 제1942418 하여 국립과학재단이 지원하는 작품과 1644760 C.M.B.H.에 수여된 국립과학재단 대학원 연구 펠로우십을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 의견, 사실 인정 및 결론 또는 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다. 저자는 지질 소포 특성화 데이터 수집에 대한 박사 노엘 베라 - 곤잘레스 에게 감사드립니다. 저자는 그의 제타저 사용에 대한 교수 로버트 허트 (브라운 대학)에게 감사드립니다. 저자는 브라운 대학 질량 분광 시설, 특히, 박사 툰 리 셴 지질 구성정량에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.

1. 유니 지질 소포 개발
<ol><li>박막 수분 공급 방법<ol>
<li>지질 재고 솔루션의 준비 및 보관 참고: 클로로폼을 사용하는 모든 단계는 화학 연기 후드에서 수행해야 합니다. 클로로폼은 항상 용매 안전 탄소 섬유 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 해야 합니다. 클로로폼을 함유한 솔루션은 항상 유리 바이알에 보관해야 합니다.<ol>
<li>지질 분말을 함유한 유리병에 적절한 부피를 첨가하여 10 mg/mL 지?...

이 프로토콜은 지질 소포의 형성을 허용, 지원 지질 이중 층, 및 일시 중단 지질 이중 층. 여기서는 이러한 각 구조를 형성하기 위한 중요한 단계가 제공됩니다. 지질 소포를 형성할 때,지질(39)의전이 온도 이상으로 돌출하는 것이 중요하다. 전이 온도 이하의 경우, 지질은 주문된 젤 상39에물리적으로 존재한다. 이 주문된 단계에서 탄화수소 지질 꼬리는 완전히 ...

주로 인지질, 콜레스테롤 및 단백질로 구성된 세포막은 모든 살아있는 세포1의중요한 구성 요소입니다. 지질 양용성에 의해 구동되는 조직으로, 세포막은 보호 장벽으로 작동하고 세포가 주변 환경과 상호 작용하는 방법을조절2. 몇몇 세포 과정은 막1,2의지질 및 단백질 조성에 의존한다. 예를 들어, 세포막 상호 작용은 효과적인 약물 전달에 중요하다3. 제약, 생물학적 제제, 나노 물질, 생물학적 독소 및 환경 독성물질은 세포막의 무결성에 영향을 미치므로 세포 기능4에영향을 미칠 수 있다. 세포막의 지질 조성에 기초하여 멤브레인 모델을 모방하는 체외 세포 의 건설은 세포에 대한 이러한 물질의 잠재적 영향에 대한 연구를 크게 향상시키는 촉진 도구를 제공 할 가능성이 있다.
모델 지질 이중층은 지질 소포, 지원되는 지질 이중층 및 일시 중단된 지질 이중층을 포함한다. 지원되는 지질 이중층은 지질 소포가 지원되는 기판물질5,6,7,8,9에서파열되는 생명 공학 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 인지질 세포막의 모델이다. 이중층 형성을 모니터링하는 데 사용되는 일반적인 기술 중 하나는 폐기 모니터링(QCM-D)을 사용하는 석영 결정 마이크로밸런스로, 이 경우, 시투8,10,11, 12,13,14의 벌크 액상 특성과 비교하여 소포의 흡착을 검사합니다. . 이전에는, QCM-D는 유동 조건하에서, 일단 포스파디들콜린 (PC) 지질 소포의 중요한 소포 커버리지가 표면에 달성되면, 그들은 자발적으로 강성 지질 이중층으로 파열한다는 것을 입증하기 위하여 이용되었습니다15. 이전 연구는 또한 다양한 지질조성물(16)을이용한 지원지질 이중층 형성, 지질 단백질17,18,19의편입, 폴리머쿠션(20)을활용하여 세포막 기능의 다양한 측면을 모방할 수 있는 지지지질 이중층을 산출하는 것을 조사하였다.
지질 이중층은 인지질, 콜레스테롤 및 글리콜리피드성분(21)을변경하여 미토콘드리온, 적혈구 및 간 세포막을 포함한 장기 수준으로 세포 에서 다양한 생물학적 장벽을 모방하는 데 사용되어 왔다. 이러한 더 복잡한 다중 지질 소포는 지질 조성물에 따라 소포 파열을 달성하기 위한 추가적인 방법이 필요할 수 있다. 예를 들어, 이전 연구는 C형 간염 바이러스의 비구조적 단백질(5A)으로부터 유래된 α-헬릭탈(AH) 펩티드를 활용하여 흡착지질소포(22,23)를불안정하게 함으로써 이중층 형성을 유도한다. 이 AH 펩티드를 이용하여, 태반 세포를 모방한 지지지질 이중층은 이전에형성되었다 24. 생체 의학 응용을 위한 지원지질 이중층의 큰 잠재력은 분자 및 나노입자 수송25,26,환경 독성 상호 작용 27, 단백질 조립 및 기능17,18,19,펩티드 배열 및 삽입28,29,약물 스크리닝 30 및 미세 유체 플랫폼31에걸친 조사와 함께 입증되었다.
일시 중단된 지질 이중층은 다공성 소수성인서트(32,33,34,35)에걸쳐 지질 이중층이 일시 중단되는 병렬 인공 막 투과성 분석(PAMPA)을 통해 약제학적 스크리닝 연구에 사용되어 왔다. PAMPA 지질 모델은 혈액-뇌, 부칼, 장 및 경피인터페이스(36)를포함한 다양한 생물학적 인터페이스를 위해 개발되었다. 지원되는 지질 이중층 과 PAMPA 기술을 결합함으로써, 원하는 조직 또는 세포 유형의 지질 성분 내에서 화합물의 흡착, 투과성 및 포함을 철저히 연구할 수 있다.
이 프로토콜은 여러 분자 상호 작용을 조사하기 위해 체외 세포막 지질 이중층 모델의 제조 및 적용을 설명합니다. 유니지질과 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 지질 이중 레이어의 준비는 상세합니다. 지원되는 지질 이중층을 형성하기 위해, 지질 소포는 먼저 박막 수분화 및 압출 방법을 사용하여 개발되었으며, 그 다음에 물리화학적 특성화가 뒤따릅니다. PAMPA에서 사용하기 위해 중단된 지질 막의 QCM-D 모니터링 및 제조를 사용하여 지원되는 지질 이중층의 형성에 대해 논의된다. 마지막으로, 멤브레인을 모방하는 더 복잡한 세포 의 발달을 위한 다중 지질 소포를 검사합니다. 두 가지 유형의 제조 된 지질 막을 사용하여이 프로토콜은이 도구를 사용하여 분자 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전반적으로,이 기술은 높은 재현성과 다재 다능성을 가진 지질 이중층을 모방 세포를 생성합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

모델 세포막은 초기 약물 발견에서 독성 연구에 이르기까지 응용 프로그램과 유용한 선별 도구입니다. 세포막은 세포 외 환경에서 내부 세포 구성 요소를 분리하는 모든 세포 유형에 대한 중요한 보호 장벽입니다. 이 막은 다양한 단백질 과 콜레스테롤과 더불어 외부 소수성 머리 단 및 내부 소수성 꼬리 단을 포함하는 지질 이중층의 주로 구성됩니다. 지질 자체의 조성 및 구조는 제약, 생물학적 독소 및 환경 독성물질을 포함할 수 있는 세포와 세포 미세 환경 간의 상호 작용을 포함하여 생물학적 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서는 지질 이중층을 모방한 단지질 및 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 세포를 제조하는 방법이 설명되어 있습니다. 이전에는 지질 지질 인산화(PC) 지질 이중층뿐만 아니라 다중 지질 태반 열대 성 에서 영감을 얻은 지질 이중층이 분자 상호 작용을 이해하는 데 사용하기 위해 개발되었습니다. 여기서 두 가지 유형의 이중 레이어 모델을 달성하기 위한 방법이 표시됩니다. 다중 지질 양층을 모방하는 세포의 경우, 원하는 지질 조성물은 먼저 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)에 선행된 1차 세포 또는 세포주로부터지질 추출을 통해 결정된다. 이 조성물을 사용하여, 지질 소포는 박막 수분 공급 및 압출 방법을 사용하여 제조되고 그들의 유체 역학 직경 및 제타 전위가 특징입니다. 지원되고 중단된 지질 양층은 각각 소멸 모니터링(QCM-D)을 이용한 석영 결정 마이크로밸런스를 이용하여 다공성 멤브레인에 형성될 수 있다. 대표적인 결과는 체외 세포막 지질 이중층 모델의 재현성과 다재다능함을 강조한다. 제시된 방법은 세포막을 가진 각종 분자 및 거대 분자의 투과, 흡착 및 embedment와 같은 상호 작용 기계장치의 신속하고 촉진적인 평가를 도울 수 있고, 약물 후보의 검열 및 잠재적인 세포 독성의 예측을 돕는.

이 프로토콜은 지지및 일시 중단된 지질 이중층을 형성하는 방법을 자세히 설명한다(도1). 지원되는 지질 이중층을 형성하는 첫 번째 단계는 지질 소포를 개발하는 것입니다. 미니 압출기는 소량의 지질 소포(1mL 이하)를 준비할 수 있게 해주며, 대형 압출기는 5-50mL의 지질 소포를 한 배치로 준비할 수 있게 합니다. 미니 또는 대형 압출기에 의해 형성된 유니지질 소포의 크기 ...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

이 프로토콜에 기재된 지질 이중층 막의 건설은 제약 에이전트, 환경 독성제 및 생물학적 화합물과의 막 상호 작용에 대한 중요한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 기술은 다양한 액체 복잡성의 막을 제조하고 막 내의 화합물 투과성, 흡수 및 임베먼트를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면, 깨끗한 유리 사악한에 지질 스톡 솔루션의 적절한 볼륨을 추가하여 수분 후 밀리리터 당 2.5 밀리그램의 최종 소포 농도를 달성하십시오.질소 가스의 스트림을 사용하여 지질 용액에서 클로로포름을 제거합니다. 클로로폼을 완전히 제거하려면 말린 지질 필름을 진공필름에 적어도 4시간 동안 연결합니다. 건조지질막을 트리스 나트륨 염화환 버퍼의 필수 부피로 재수화하여 밀리리터당 2.5밀리그램의 최종 소포 농도를 산출하고, 약 15~30초 동안 소용돌이를 생성한다.소포 현탁액을 드라이 아이스가 있는 용기에 넣고 약 30분 동안 얼어 붙을 때까지 옮습니다. 샘플이 완전히 얼어 붙은 후 30 섭씨 에서 40섭씨 급수 욕조에서 서스펜션을 해동하십시오. 해동 된 소포 서스펜션을 소용돌이.1 밀리리터 이하의 소포를 만들려면 미니 압출기를 얻습니다. 초순수물로 필터 지지체를 미리 적시한 다음 O 링 내부의 멤브레인 지지면에 놓습니다. 두 번째 내부 멤브레인 지원에 대해 반복합니다.하나의 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다. 100나노미터 폴리카보네이트 멤브레인 을 내부 멤브레인 에 배치하여 필터 지지대 위에 직접 배치합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 향한 O 링 및 필터 지지측을 통해 제2 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다.폴리테트라플루오로틸렌 베어링을 리테이너 매듭에 부착하고 압출기 외부 케이스로 닫힙을 나사로 닫습니다. 압출기를 가열 블록에 잘라냅니다. 지질 소포 현탁액을 주사기 중 하나에 적재하고 주사기를 압출기 열 블록에 배치하여 바늘을 압출기의 한쪽 끝에 완전히 삽입합니다.두 번째 빈 주사기를 반대쪽에 삽입하고 열 블록의 팔 클립을 사용하여 두 주사기를 모두 잠급니다. 소포 현탁액을 빈 주사기에 천천히 밀어 넣은 다음 원래 주사기로 돌아갑니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통과하는 총 21회 동안 20회 더 반복합니다.지질 소포를 깨끗한 유리 사블으로 옮겨 보관하십시오. 소포의 5~50밀리리터를 돌출하려면 큰 구멍 스크린 지지대, 중앙 디스크, 드레인 디스크 및 폴리카보네이트 멤브레인을 압출기 의 공간에 배치하여 큰 압출기를 조립한다. 4개의 나사를 사용하여 압출기 상부 및 하부 지지대를 연결하고 조입니다.압출기 유닛을 바닥으로 스크러빙하고 렌치로 조여서 시료 실린더에 부착하여 고정합니다. 샘플 실린더를 초순수물로 채우고 샘플 실린더에 샘플을 추가하기 전에 압출기 장치를 통해 물을 돌출합니다. 지질 소포 서스펜션을 샘플 실린더에 넣고 상단을 닫은 나사로 닫습니다.샘플이 초당 약 2~3방울의 속도로 압출기 장치에서 물방울을 떨어뜨리기 시작할 때까지 천천히 압력을 증가시면 깨끗한 유리 사악하게 넣습니다. 모든 샘플이 압출되면 질소 공급을 끄고 압력 릴리프 밸브를 천천히 열어 샘플 실린더의 압력을 방출합니다. 지질 소포를 다시 샘플 실린더에 붓고 총 10개의 압출을 위해 이전 단계를 9번 더 반복합니다.소포 현탁액을 적절한 큐벳에 적재하고 동적 광 산란 기기에 삽입하고 샘플 세부 정보를 입력하고 관련 소프트웨어를 사용하여 측정을 수행합니다. 제타 셀을 샘플 챔버에 놓고 전극이 접촉하고 있는지 확인하여 샘플 홀더 뚜껑을 닫습니다. 관련 소프트웨어에서 샘플 세부 정보를 입력하고 측정을 수집합니다.실리카 코딩석영액 센서를 유량 모듈에 삽입하여 결정의 T 형상이 모듈의 T 형상과 정렬되고 유동 모듈이 닫히도록 합니다. 여러 챔버가 있는 계측기에서는 추가 이중레이어를 병렬로 형성할 수 있습니다. 유입구와 콘센트 튜브를 유량 모듈 및 펌프에 연결합니다.튜브를 홀딩 가드에 넣고 분석기 시스템의 뚜껑을 닫습니다. 펌프 의 콘센트에 폐기물 용기를 배치하여 사용 된 솔루션을 수집합니다. 청소를 수행하려면 먼저 펌프를 켜고 유동 속도를 분당 400 마이크로리터로 설정합니다.유입구 튜브를 초순수 물에 삽입하고 모듈을 통해 5~10밀리리터를 흘릴 수 있습니다. 튜브를 SDS로 전환하고 모듈을 통해 5~10밀리리터를 플로팅합니다. 튜브를 다시 초순수물로 전환하고 모듈을 통해 10~20밀리리터를 플로팅합니다.마지막으로 남은 솔루션이 수집되지 않고 모듈을 통해 공기를 흐르게 합니다. 유량 모듈에서 센서를 제거하고 초순수로 센서를 헹구는 다. 센서와 유량 모듈을 질소 가스 스트림으로 구동하여 전극이 항상 액체가 없는지 확인합니다.화학 연기 후드에 실리카 코팅 석영 크리스탈 센서를 자외선 또는 오존 세정 기구에 삽입하십시오. 기기를 켜고 적어도 2 분 동안 치료를 허용하십시오. 센서를 조심스럽게 제거하고 유량 모듈로 반품합니다.분석기 기기를 켜서 관련 소프트웨어를 연결하고 지지 지질 이중층을 형성하기 위해 원하는 값으로 온도를 설정합니다. 온도가 원하는 입력으로 안정화되도록 허용합니다. 측정을 구성하고 측정을 시작하기 전에 모든 센서 공명 주파수를 찾고 배음 3, 5, 7, 9, 11 및 13에 대한 소멸을 찾습니다.염화 나트륨이 모듈을 5~10분 동안 흐르도록 허용하여 기준주파수 변경 또는 델타 F 및 방출 변경 또는 액체의 델타 D 값이 안정적으로 유지되도록 합니다. 펌프를 멈추고, 트리스 나트륨 염화나트륨 용액에서 입구 튜브를 제거하고 지질 소포 용액에 조심스럽게 삽입하십시오. 5초 동안 역류하여 입구 튜브에서 기포를 제거한 다음 전진 흐름을 계속합니다.소프트웨어의 측정을 다시 시작하여 기준선을 0으로 설정합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 이중층 형성이 실시간으로 관찰될 때까지 지질 소포를 플로우합니다. 그런 다음 지질 소포에서 염화 나트륨 버퍼로 입구 튜브를 변경하려면이 단계를 반복하십시오.기증자 구획에 지질 용액 5 마이크로리터를 추가하면 0.45 마이크로 미터 의 모공 크기가있는 다공성 폴리 비닐리데네 디플루오라이드 96 우물 멀티 스크린 필터 플레이트입니다. 즉시 인산염 완충식식염 300 마이크로리터를 포함하는 수송 수신기 플레이트인 감수용구에 필터 플레이트를 침수합니다. 수송 기증자 구획에 인산염 완충식식염 200 마이크로리터를 추가합니다.펌프를 중지하고 지질 소포 용액으로 입구 튜브를 변경하고 이중 층 형성을 관찰하는 이전 단계를 따라, 다음 알파 헬릭 또는 AH 펩티드 솔루션으로 입구 튜브를 변경합니다. 새로운 솔루션 추가에서 주파수 변경 및 소멸 변화가 관찰될 때까지 흐름 모듈에 솔루션을 도입합니다. 펌프를 멈추고 AH 펩타이드가 소포로 10분 동안 배양할 수 있도록 합니다.입구 튜브를 염화 나트륨으로 전환하고 파열 된 소포에서 AH 펩티드를 제거하기 위해 흐름을 시작하여 지질 이중 층의 성공적인 형성을 초래합니다. 먼저 분자 용매를 플로우한 다음, 인렛 튜브를 관심 분자를 포함하는 용액으로 전환하여 최소 5분 동안 유동한다. 원하는 경우, 흐름을 중지하고 원하는 분자를 포함하는 액체가 바이레이어로 배양할 수 있도록 한다.인렛 튜브를 분자 용매로 만 변경합니다. 적어도 5분 동안 흐르고, 입구 튜브를 염화나트륨으로 전환하고 적어도 5분간 흐르십시오. 소프트웨어에서 측정을 중지하고 파일을 저장하고 펌프를 중지합니다.유니지질 일시 중단 된 이중 층 또는 다중 지질 일시 중단 된 이중 층에 대한 이전 단계에 대한 이전 단계에 이어 기증자 필터 플레이트 컴파트먼트에서 PBS를 제거하고 테스트 용액의 200 마이크로 리터로 대체하십시오. PBS 300 마이크로리터가 있는 새로운 운송 수신기 플레이트에 즉시 담급됩니다. 섭씨 25도에서 2시간 동안 부드러운 흔들림으로 잠복한 후 기증자와 수용자 구획에서 150마이크로리터의 용액을 수집합니다.이 분자의 특성에 따라 적절한 방법을 사용하여 두 샘플모두에서 분자 농도를 측정합니다. 유니지질 계란 PC 소포의 크기, 다각형 및 제타 전위, 그리고 2개의 다중 지질 소포 조성물을 비교하였다. 계란 PC 소포와 멀티 지질 하나의 소포의 크기 분포는 거의 동일했다.계란과 PC 멀티 지질 1 개의 소포는 음수 충전되었고 멀티 지질 2 개의 소포가 긍정적으로 충전되었습니다. 단지질 계란 PC 소포는 주파수 변화의 감소에 의해 도시된 바와 같이 표면에 쉽게 흡수되고, 소멸 변화의 증가, 그리고 자발적인 파열에 선행됩니다. 다중 지질 소포는 표면에 흡수되지만 소포를 파열시키기 위해 AH 펩타이드를 첨가하여 지질 이중층 형성을 초래합니다.지원되는 지질 이중층으로, 주파수 변화 및 소멸 변화는 관심있는 화합물의 도입 전후에 분석될 수 있다. 예를 들어, 지원되는 유니와 다층층층의 DEHP 및 환경 독성제의 상호 작용이 조사되었다. DEHP 흡수의 유사한 수준은 두 지질 이중층 유형에 대해 관찰되었다.그러나, 소멸 변화에 있어서의 차이는 다중 지질 1bilayer에 비해 계란 PC 이중층에 대해 볼 수 있는 더 큰 소멸 변화를 가진 양층 들 사이에서 관찰되었다. 유니 및 다중 지질 1개의 양층 모두에 대해 작은 투과가 관찰되었다. 이 절차에 따라, 지질 이중층을 모방하는 다양한 세포가 제약에서 환경 독성물질에 이르는 화합물과의 분자 상호 작용을 세포없는 선별할 수 있도록 개발될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

연구

생체공학

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...