Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant No. 1942418 tildelt A.S., og et National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildelt C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation. Forfatterne takker Dr. Noel Vera-González for lipid vesicle karakterisering datainnsamling. Forfatterne takker professor Robert Hurt (Brown University) for bruken av hans Zetasizer. Forfatterne takker Brown University Mass Spectrometry Facility, spesielt Dr. Tun-Li Shen for hjelp med kvantifisering av lipidsammensetning.

1. Utvikling av uni-lipid vesicles
<ol><li>Tynnfilmhydreringsmetode<ol>
<li>Forberedelse og lagring av lipid lagerløsninger MERK: Alle trinn ved bruk av kloroform må utføres i en kjemisk avtrekkshette. Kloroform skal alltid pipetteres ved hjelp av løsemiddelsikre pipettespisser av karbonfiber. Oppløsninger som inneholder kloroform skal alltid oppbevares i hetteglass av glass.<ol>
<li>Forbered en 10 mg / ml lipidoppløsning ved å legge til riktig volum kloroform i hetteglasset som inneholder lipidpulveret og bl...

Denne protokollen tillater dannelse av lipid vesicles, støttede lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Her presenteres kritiske trinn for å danne hver av disse strukturene. Når du danner lipid vesicles, er det viktig å ekstrudere over overgangstemperaturen til lipid39. Når du er under overgangstemperaturen, er lipiden fysisk til stede i sin bestilte gelfase39. I denne bestilte fasen er hydrokarbon lipidhalene fullt utvidet, noe som gjør ekstrudering utfordrende...

Cellemembranen, som hovedsakelig består av fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en avgjørende komponent i alle levende celler1. Med organisering drevet av lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer hvordan cellen samhandler med omgivelsene2. Flere cellulære prosesser er avhengige av lipid- og proteinsammensetningen av membranen1,2. For eksempel er cellemembraninteraksjoner viktige for effektiv legemiddellevering3. Legemidler, biologer, nanomaterialer, biologiske giftstoffer og miljøgifter kan påvirke integriteten til en cellemembran, og dermed påvirke cellulær funksjon4. Konstruksjonen av in vitro-cellemimikeringsmembranmodeller basert på lipidsammensetningen av cellemembraner har potensial til å gi facile verktøy for å forbedre studiet av den potensielle effekten av disse materialene på celler. 
Modell lipid bilayers inkluderer lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Støttede lipidbilayere er en modell av fosfolipidcellemembranen som vanligvis brukes i bioteknologiske applikasjoner der lipid vesicles brister på et støttet substratmateriale5,6,7,8,9. En vanlig teknikk som brukes til å overvåke bilayerdannelse er kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D), som undersøker adsorpsjon av vesikler i forhold til bulkvæskeegenskapene in situ8,10,11,12,13,14 . Tidligere har QCM-D blitt brukt til å demonstrere at under strømningsforhold, når en kritisk vesicle dekning av fosfatidylkolin (PC) lipid vesikler oppnås på overflaten, bryter de spontant inn i stive lipidbilayers15. Tidligere arbeid har også undersøkt støttet lipidbilayerformasjon med varierende lipidsammensetninger16, inkorporering av lipidproteiner17,18,19, og bruk av polymerputer20, noe som gir støttede lipidbilayere som er i stand til å etterligne ulike aspekter av cellemembranfunksjonen.
Lipid bilayers har blitt brukt til å etterligne ulike biologiske barrierer fra sub-cellulære til organnivåer, inkludert mitokondrie, rød blodlegeme og levercellemembraner ved å endre fosfolipid-, kolesterol- og glykolipidkomponentene21. Disse mer komplekse multi-lipid vesikler kan kreve flere metoder for å oppnå vesicle brudd, avhengig av lipid sammensetningen. For eksempel har tidligere studier brukt et α-spiralisk (AH) peptid avledet fra hepatitt C-virusets ikke-strukturelle protein 5A for å indusere bilayerdannelse ved å destabilisere adsorbert lipid vesikler22,23. Ved hjelp av dette AH-peptidet har støttede lipidbilayere som etterligner placentalceller tidligere blitt dannet24. Det store potensialet for støttede lipidbilayers for biomedisinske applikasjoner har blitt demonstrert med undersøkelser som spenner over molekylær og nanopartikkeltransport25,26, miljøtoksiske interaksjoner27, proteinmontering og funksjon17,18,19, peptidarrangement og innsetting28,29, legemiddelscreening30og mikrofluidiske plattformer31.
Suspendert lipid bilayers har blitt brukt til farmasøytisk screening studier via en parallell kunstig membran permeabilitet analyse (PAMPA) hvor en lipid bilayer er suspendert over en porøs hydrofob innsats32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller er utviklet for forskjellige biologiske grensesnitt, inkludert blod-hjerne, bukkal, tarm og transdermale grensesnitt36. Ved å kombinere både de støttede lipid-bilayer- og PAMPA-teknikkene, kan adsorpsjon, permeabilitet og innebygging av forbindelser i lipidkomponenter av ønsket vev eller celletype studeres grundig.
Denne protokollen beskriver fabrikasjon og anvendelse av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller for å undersøke flere molekylære interaksjoner. Fremstilling av både uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert lipid bilayers er detaljert. For å danne en støttet lipidbilayer utvikles lipid vesikler først ved hjelp av tynnfilmhydrering og ekstruderingsmetoder etterfulgt av fysisk-kjemisk karakterisering. Dannelse av en støttet lipidbilayer ved bruk av QCM-D-overvåking og fabrikasjon av suspenderte lipidmembraner til bruk i PAMPA diskuteres. Til slutt undersøkes multi-lipid vesicles for utvikling av mer komplekse cellemimikeringsmembraner. Ved hjelp av begge typer fremstilte lipidmembraner demonstrerer denne protokollen hvordan dette verktøyet kan brukes til å studere molekylære interaksjoner. Totalt sett konstruerer denne teknikken cellemimikering lipid bilayers med høy reproduserbarhet og allsidighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Modellcellemembraner er et nyttig screeningverktøy med anvendelser som spenner fra tidlig legemiddeloppdagelse til toksisitetsstudier. Cellemembranen er en avgjørende beskyttende barriere for alle celletyper, som skiller de interne cellulære komponentene fra det ekstracellulære miljøet. Disse membranene består i stor grad av en lipidbilayer, som inneholder ytre hydrofile hodegrupper og indre hydrofobe halegrupper, sammen med ulike proteiner og kolesterol. Lipidenes sammensetning og struktur spiller en avgjørende rolle i reguleringen av biologisk funksjon, inkludert interaksjoner mellom celler og cellulær mikromiljøet, som kan inneholde legemidler, biologiske giftstoffer og miljøgifter. I denne studien beskrives metoder for å formulere uni-lipid og multi-lipid støttet og suspendert celle som etterligner lipid-bilayers. Tidligere ble uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirert lipid bilayers utviklet for bruk i å forstå molekylære interaksjoner. Her vil metoder for å oppnå begge typer bilayermodeller bli presentert. For celler som etterligner multi-lipid bilayers, bestemmes ønsket lipidsammensetning først via lipidekstraksjon fra primære celler eller cellelinjer etterfulgt av flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjelp av denne sammensetningen fremstilles lipid vesicles ved hjelp av en tynnfilmhydrerings- og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotensial er preget. Støttede og suspenderte lipid-bilayers kan deretter dannes ved hjelp av kvartskrystallmikrobalanse med dissipasjonsovervåking (QCM-D) og på en porøs membran for bruk i henholdsvis en parallell kunstig membranpermeabilitetsanalyse (PAMPA). De representative resultatene fremhever reproduserbarhet og allsidighet av in vitro cellemembran lipid bilayer modeller. Metodene som presenteres kan hjelpe til med rask, facile vurdering av interaksjonsmekanismene, som permeasjon, adsorpsjon og innebygging, av ulike molekyler og makromolekyler med cellemembran, som hjelper til med screening av narkotikakandidater og prediksjon av potensiell cellulær toksisitet.

Denne protokollen beskriver metoder for å danne støttede og suspenderte lipid-bilayere (figur 1). Det første trinnet for å danne en støttet lipid bilayer er å utvikle lipid vesicles. Mini ekstruderen gjør det mulig å tilberede små mengder lipid vesicles (1 ml eller mindre), mens den store ekstruderen gjør det mulig å fremstille 5-50 ml lipid vesicles i en batch. Størrelsesfordelinger av uni-lipid vesicles dannet av enten mini eller stor ekstruder er vist i fi...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Denne protokollen beskriver dannelsen av celle som etterligner uni-lipid og multi-lipid vesicles, støttet lipid bilayers, og suspendert lipid bilayers. Disse in vitro-modellene kan tilpasses for å inkorporere en rekke lipidtyper og kan brukes til å undersøke ulike molekyl- og makromolekylinteraksjoner.

Montering av cellemikrokering støttede og suspenderte Lipid Bilayer-modeller for studiet av molekylære interaksjoner

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Byggingen av lipidbilayermembraner beskrevet i denne protokollen kan brukes til å skaffe avgjørende informasjon om membraninteraksjoner med farmasøytiske midler, miljøgifter og til og med biologiske forbindelser. Disse teknikkene kan brukes til å fremstille membraner av varierende flytende kompleksitet, og til å vurdere sammensatt permeabilitet, absorpsjon og innebygging i membraner. Til å begynne med, legg til riktig volum lipid lagerløsning i en ren glasssjofel for å oppnå en endelig vesiclekonsentrasjon på 2,5 milligram per milliliter etter rehydrering.Fjern kloroform fra lipidoppløsning ved hjelp av en strøm av nitrogengass. For å sikre full fjerning av kloroform, koble den tørkede lipidfilmen til vakuumet i minst fire timer. Rehydrer den tørkede lipidfilmen med et nødvendig volum Tris natriumkloridbuffer for å gi den endelige vesiclekonsentrasjonen på 2,5 milligram per milliliter, og virvel i ca. 15 til 30 sekunder.Overfør vesicle suspensjonen til en beholder med tørris til den er frosset i ca. 30 minutter. Etter at prøven er helt frossen, tin suspensjonen i et 30 til 40 grader Celsius vannbad. Virvel den tinte vesicle suspensjon.For å lage en milliliter eller mindre vesicles, få en mini ekstruder. Forsvå en filterstøtte med ultra rent vann, og plasser den deretter på membranstøtteoverflaten inne i O-ringen. Gjenta for den andre interne membranstøtten.Plasser en intern membranstøtte i ekstruderens ytre foringsrør. Plasser en 100 nanometer polykarbonatmembran på den indre membranstøtten direkte over filterstøtten. Plasser den andre interne membranstøtten i ekstruderens ytre foringsrør med O-ringen og filterstøttesiden vendt mot polykarbonatmembranen.Fest polytetrafluoretylenlageret i holderknuten og skru det lukket med ekstruderens ytre foringsrør. Fest ekstruderen inn i varmeblokken. Legg lipid vesicle suspensjonen i en av sprøytene og plasser sprøyten i ekstrudervarmeblokken, og sett nålen helt inn i den ene enden av ekstruderen.Sett den andre tomme sprøyten inn i motsatt side og lås begge sprøytene ved hjelp av armklemmene på varmeblokken. Skyv vesicle-fjæringen langsomt inn i den tomme sprøyten og deretter tilbake i den opprinnelige sprøyten. Gjenta 20 ganger til for totalt 21 passerer gjennom polykarbonatmembranen.Overfør lipid vesicles til en ren glass sjofel for lagring. For å ekstrudere fem til 50 milliliter vesicles, monter den store ekstruderen ved å plassere den store hullskjermstøtten, sentrert plate, dreneringsskiver og polykarbonatmembran i rommet i ekstruderens nedre støtte. Koble ekstruderens øvre og nedre støtter ved hjelp av de fire skruene og stram til.Fest ekstruderenheten til prøvesylinderen ved å skrubbe den til bunnen og stramme med en skiftenøkkel for å feste den. Fyll prøvesylinderen med ultrarent vann og ekstruder vannet gjennom ekstruderenheten før du legger prøven i prøvesylinderen. Tilsett lipid vesicle suspensjon i prøvesylinderen og skru toppen lukket.Øk trykket langsomt til prøven begynner å dryppe fra ekstruderenheten med en hastighet på omtrent to til tre dråper per sekund i en ren glasssjofel. Når alle prøvene er ekstrudert, slår du av nitrogentilførselen og slipper trykket i prøvesylinderen ved å åpne trykkavlastningsventilen sakte. Hell lipid vesiklene tilbake i prøvesylinderen og gjenta forrige trinn ni ganger til for totalt 10 profiler.Last vesicle-fjæringen inn i passende cuvette, og sett inn i det dynamiske lysspredningsinstrumentet, skriv inn prøvedetaljene og utfør målingen ved hjelp av tilhørende programvare. Plasser zetacellen i prøvekammeret, sørg for at elektrodene er i kontakt, og lukk prøveholderlokket. Skriv inn eksempeldetaljene i den tilknyttede programvaren, og samle inn målinger.Sett den silikakodede kvartskrystallsensoren inn i strømningsmodulen, og sørg for at T-formen på krystallen stemmer overens med T-formen på modulen og skru strømningsmodulen lukket. I instrumenter med flere kamre kan ytterligere bilayers dannes parallelt. Koble innløps- og utløpsslangen til strømningsmodulen og pumpen.Plasser slangen i holdebeskyttelsen og lukk lokket på analysatorsystemet. Plasser en avfallsbeholder ved pumpens utløp for å samle inn brukte løsninger. For å utføre rengjøringen må du først slå på pumpen og sette strømningshastigheten til 400 mikroliter per minutt.Sett innløpsslangen i ultra rent vann og strømning fem til 10 milliliter gjennom modulen. Bytt slangen til SDS og strømning fem til ti milliliter gjennom modulen. Bytt slangen tilbake til ultra rent vann og strømning 10 til 20 milliliter gjennom modulen.Til slutt strømmer luft gjennom modulen til ingen gjenværende løsning er samlet inn. Fjern sensoren fra strømningsmodulen og skyll sensoren med ultra rent vann. Kjør sensoren og strømningsmodulen med en nitrogengassstrøm, og sørg for at elektroden alltid forblir fri for væske.I en kjemisk avtrekkshette setter du silikabelagt kvartskrystallsensor inn i et ultrafiolett eller ozonrengjøringsinstrument. Slå på instrumentet og la det bli behandlet i minst to minutter. Fjern sensorene forsiktig og returner dem inn i strømningsmodulen.Slå på analysatorinstrumentet for å koble den tilhørende programvaren og stille inn temperaturen til ønsket verdi for å danne den støttende lipid-bilayeren. La temperaturen stabilisere seg til ønsket inngang. Konfigurer målingen og finn alle sensorresonansfrekvenser og spredning for overtoner tre, fem, syv, ni, 11 og 13 før du starter målingen.La Tris natriumklorid strømme gjennom modulen i fem til ti minutter, og sørg for at basisfrekvensendringen eller Delta F og dissipasjonsendringen eller Delta D-verdiene i væske forblir stabile. Stopp pumpen, fjern innløpsslangen fra Tris natriumkloridoppløsning, og sett den forsiktig inn i lipid vesicle-løsningen. Tilbakestrømning i fem sekunder for å fjerne eventuelle luftbobler fra innløpsslangen, og fortsett deretter fremoverstrømmen.Start målingen i programvaren på nytt for å nullstille grunnlinjen. Flow lipid vesicles til bilayer formasjon observeres i sanntid i datainnsamling programvare. Gjenta deretter dette trinnet for å endre innløpsslangen fra lipid vesicles tilbake til Tris natriumkloridbuffer.Tilsett fem mikroliter av lipidløsningen til donorrommet, som er en porøs polyvinylliddifluorid 96 brønn flerskjermfilterplate med 0,45 mikrometer porestørrelse. Senk umiddelbart filterplaten ned i akseptorrommet, som er en transportmottakerplate som inneholder 300 mikroliter fosfatbufret saltvann. Tilsett 200 mikroliter fosfatbufret saltvann i transportdonorrommet.Følg tidligere trinn for å stoppe pumpen og endre innløpsslangen til lipid vesicle-løsning og observere bilayerdannelse, og bytt deretter innløpsslangen til alfa-spiral- eller AH-peptidløsningen. Introduser løsningen i strømningsmodulen til frekvensendring og spredningsendring observeres fra det nye løsningstillegget. Stopp pumpen og la AH-peptidet inkubere med vesiklene i 10 minutter.Bytt innløpsslangen inn i Tris natriumklorid, og start strømmen for å fjerne AH-peptidet fra de rupturede vesiklene, noe som fører til vellykket dannelse av en lipidbilayer. Først strømning av molekylløsningsmidlet, bytt deretter innløpsslangen til løsningen som inneholder molekylet av interesse og strømning i minst fem minutter. Om ønskelig, stopp strømmen og la væsken som inneholder ønsket molekyl inkubere med bilayeren.Bytt innløpsslangen tilbake til molekylløsningsmidlet alene. Strømning i minst fem minutter, bytt deretter innløpsslangen til Tris natriumklorid og strømning i minst fem minutter. I programvaren stopper du målingen, lagrer filen og stopper pumpen.Umiddelbart etter tidligere trinn for en uni-lipid suspendert bilayer eller for en multi-lipid suspendert bilayer, fjern PBS fra donorfilterskiltrommet og erstatt med 200 mikroliter av testløsningen. Senk umiddelbart ned i en ny transportmottakerplate med 300 mikroliter PBS. Etter inkubasjon med skånsom gynging i to timer ved 25 grader Celsius, samle 150 mikroliter av løsningen fra donor- og akseptorrommene.Mål molekylkonsentrasjonen i begge prøvene ved hjelp av en passende metode basert på egenskapene til dette molekylet. Størrelse, polydispersitet og Zeta potensial av Uni-lipid egg PC vesiles, og to multi lipid vesicle komposisjoner ble sammenlignet. Størrelsesfordelingen av egg PC vesicles og multi lipid en vesicles var nesten identisk.Både egg og PC multi-lipid en vesicles ble negativt ladet, mens multi-lipid to vesicles ble positivt ladet. Uni-lipid egg PC vesicles lett absorbert til overflaten, som vist ved nedgangen i frekvensendring, og økning i dissipation endring, etterfulgt av spontan brudd. Multi-lipid vesicles absorbert til overflaten, men krever tilsetning av AH peptid for å sprekke vesicles, noe som resulterer i lipid bilayer formasjon.Med støttede lipid-bilayere kan frekvensendring og dissipasjonsendring analyseres før og etter innføring av en interessesammensetning. For eksempel ble interaksjoner mellom DEHP og miljøgift med støttet uni og flerlags av lag undersøkt. Lignende nivåer av DEHP absorpsjon ble observert for begge lipid bilayer typer.Imidlertid ble forskjeller i dissipasjonsendring observert mellom bilayers med en større dissipation endring sett for egg PC bilayer sammenlignet med multi lipid en bilayer. Det ble observert lite permeasjon for både uni-og multi-lipid en bilayers. Etter denne prosedyren kan en rekke celler som etterligner lipidbilayers utvikles for å muliggjøre cellefri screening av molekylære interaksjoner med forbindelser som spenner fra legemidler til miljøtoksiske stoffer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Heft frekvens analyse for In Situ Kinetics Analyse av Cross-junctional molekylære interaksjoner på Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helical Organisering av koagulasjonsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Utarbeidelse av 3D kollagen Gels og mikro for studier av 3D Interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatisert lipid bilaget Membran Dannelse Ved hjelp av en Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...