Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
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Este material é baseado em trabalho apoiado pela Fundação Nacional de Ciência sob o Grant No. 1942418 concedido à A.S., e uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência concedida à C.M.B.H., sob o grant no. 1644760. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência. Os autores agradecem ao Dr. Noel Vera-González pela aquisição de dados de caracterização de vesículas lipídicas. Os autores agradecem ao professor Robert Hurt (Brown University) pelo uso de seu Zetasizer. Os autores agradecem ao Brown University Mass Spectrometria Facility, em particular, Dr. Tun-Li Shen pela assistência com a composição lipídica quantificada.

1. Desenvolvimento de vesículas uni-lipídicas
<ol><li>Método de hidratação de filme fino<ol>
<li>Preparação e armazenamento de soluções de estoque lipídudo NOTA: Todas as etapas que utilizam clorofórmio precisam ser realizadas em uma capa de fumaça química. O clorofórmio deve ser sempre pipetado usando pontas de pipeta de fibra de carbono com proteção. As soluções que contenham clorofórmio devem ser sempre armazenadas em frascos de vidro.<ol>
<li>Prepare uma solução de caldo lipídico de 10 mg/m...

Este protocolo permite a formação de vesículas lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Aqui, são apresentados passos críticos para formar cada uma dessas estruturas. Ao formar vesículas lipídicas, é importante extrusão acima da temperatura de transição do lipídio39. Quando abaixo da temperatura de transição, o lipídio está fisicamente presente em sua fase de gelordenado 39. Nesta fase ordenada, as caudas lipídicas de hi...

A membrana celular, composta principalmente de fosfolipídios, colesterol e proteínas, é um componente crucial de todas as células vivas1. Com organização impulsionada pela anfífilia lipídica, a membrana celular funciona como uma barreira protetora e regula como a célula interage com seu ambiente circundante2. Diversos processos celulares dependem da composição lipídica e proteica da membrana1,2. Por exemplo, as interações de membrana celular são importantes para uma entrega eficaz de medicamentos3. Medicamentos, biológicos, nanomateriais, toxinas biológicas e tóxicos ambientais podem impactar a integridade de uma membrana celular, afetando assim a função celular4. A construção de modelos de membrana de imitação de células in vitro baseadas na composição lipídica das membranas celulares tem o potencial de fornecer ferramentas fáceis para aprimorar muito o estudo do impacto potencial desses materiais nas células.
Bicamadas lipídicas modelo incluem vesículas lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Bicamadas lipídicas suportadas são um modelo da membrana celular fosfolipídica comumente usada em aplicações biotecnológicas onde vesículas lipídicas são rompidas em um material substrato suportado5,6,7,8,9. Uma técnica comum usada para monitorar a formação de bicamadas é o microequilípmo de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que examina a adsorção de vesículas em comparação com as propriedades líquidas a granel no situ8,10,11,12,13,14 . Anteriormente, o QCM-D tem sido usado para demonstrar que, em condições de fluxo, uma vez que uma cobertura vesícula crítica de vesículas lipídicas fosfattidylcholina (PC) é alcançada na superfície, elas se rompem espontaneamente em bicamadas lipídicas rígidas15. Trabalhos anteriores também investigaram a formação de vitonas com diferentes composições lipídicas16, incorporação de proteínas lipídicas17,18,19, e utilizando almofadas de polímero20,produzindo bicamadas lipídicas suportadas capazes de imitar vários aspectos da função da membrana celular.
Bicamadas lipídicas têm sido usadas para imitar várias barreiras biológicas, do subcelular aos níveis de órgãos, incluindo mitocôndria, glóbulos vermelhos e membranas de células hepáticas alterando os componentes fosfolipídicos, colesterol e glicóptiides21. Essas vesículas multi-lipídicas mais complexas podem exigir métodos adicionais para alcançar a ruptura vesícula, dependendo da composição lipídica. Por exemplo, estudos anteriores utilizaram um peptídeo α-helicoidal (AH) derivado da proteína não estrutural 5A do vírus da hepatite C para induzir a formação de bicamadas desestabilizando as vesículas lipídicas adsorvidas22,23. Usando este peptídeo AH, bicamadas lipídicas apoiadas imitando células placentárias foram previamente formadas24. O grande potencial de bicamadas lipídicas suportadas para aplicações biomédicas tem sido demonstrado com investigações abrangendo o transporte molecular e nanopartícula25,26, interações toxicantes ambientais27,montagem e função de proteínas17,18,19,arranjo de peptídeos e inserção28,29,triagem de medicamentos30e plataformas microfluidas31.
Bicamadas lipídicas suspensas têm sido usadas para estudos de triagem farmacêutica através de um ensaio paralelo de permeabilidade de membrana artificial (PAMPA) onde uma bicamada lipídica é suspensa através de uma inserção hidrofóbica porosa32,33,34,35. Modelos lipídicos PAMPA foram desenvolvidos para diferentes interfaces biológicas, incluindo as interfaces hemato-cerebral, bucal, intestinal e transdérmica36. Combinando as técnicas de bicamadas lipídicas suportadas e técnicas PAMPA, a adsorção, a permeabilidade e a incorporação de compostos dentro de componentes lipíduos de um tecido ou tipo celular desejado podem ser exaustivamente estudados.
Este protocolo descreve a fabricação e aplicação de modelos de bicamadas lipídicas de membrana celular in vitro para investigar várias interações moleculares. A preparação de bicamadas lipídicas e multi-lipídicas e multi-lipídicas é detalhada. Para formar uma bicamada lipídica suportada, as vesículas lipídicas são desenvolvidas pela primeira vez usando métodos de hidratação e extrusão de filmes finos seguidos pela caracterização físico-química. Discute-se a formação de um bicamado lipídeco suportado usando monitoramento e fabricação de membranas lipídicas suspensas para uso no PAMPA. Finalmente, vesículas multi-lipídicas para o desenvolvimento de membranas de imitação celular mais complexas são examinadas. Usando ambos os tipos de membranas lipídicas fabricadas, este protocolo demonstra como esta ferramenta pode ser usada para estudar interações moleculares. No geral, essa técnica constrói células imitando bicamadas lipídicas com alta reprodutibilidade e versatilidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

As membranas celulares modelo são uma ferramenta de triagem útil com aplicações que vão desde a descoberta precoce de drogas até estudos de toxicidade. A membrana celular é uma barreira protetora crucial para todos os tipos de células, separando os componentes celulares internos do ambiente extracelular. Essas membranas são compostas em grande parte por uma bicamada lipídica, que contém grupos de cabeças hidrofílicas externas e grupos de cauda hidrofóbica interna, juntamente com várias proteínas e colesterol. A composição e estrutura dos próprios lipídios desempenham um papel crucial na regulação da função biológica, incluindo interações entre as células e o microambiente celular, que podem conter fármacos, toxinas biológicas e tóxicos ambientais. Neste estudo, são descritos métodos para formular células uni-lipídicas e multi-lipídicas que imitam bicamadas lipídicas. Anteriormente, bicamadas lipídicas de fosfartilina uni-lipídica (PC), bem como bicamadas lipídicas multi-lipídicas inspiradas em trophoblast foram desenvolvidas para uso na compreensão de interações moleculares. Aqui, serão apresentados métodos para alcançar os dois tipos de modelos bicamadas. Para as bicamadas multi-lipídicas, a composição lipídica desejada é determinada pela primeira vez através da extração lipídica de células primárias ou linhas celulares seguidas por espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS). Usando esta composição, as vesículas lipídicas são fabricadas usando um método de hidratação e extrusão de películas finas e seu diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta são caracterizados. Bicamadas lipídicas suportadas e suspensas podem então ser formadas usando microequilíptico de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D) e em uma membrana porosa para uso em um ensaio paralelo de permeabilidade da membrana artificial (PAMPA), respectivamente. Os resultados representativos destacam a reprodutibilidade e versatilidade dos modelos de bicamadas lipídicas de membrana celular in vitro. Os métodos apresentados podem auxiliar na avaliação rápida e fácil dos mecanismos de interação, como permeação, adsorção e incorporação, de várias moléculas e macromoléculas com uma membrana celular, auxiliando na triagem de candidatos a medicamentos e na previsão de potencial toxicidade celular.

Este protocolo detalha os métodos de formação de bicamadas lipídicas suportadas e suspensas(Figura 1). O primeiro passo para formar um bicamado lipídigo apoiado é desenvolver vesículas lipídicas. A mini extrusora permite que pequenos volumes de vesículas lipídicas sejam preparados (1 mL ou menos), enquanto a grande extrusora permite que 5-50 mL de vesículas lipídicas sejam preparados em um lote. Distribuições de tamanho de vesículas uni-lipídicas formadas pelo mini ou grande ...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

A construção de membranas lipídicas de bicamadas descritas neste protocolo pode ser usada para obter informações cruciais sobre interações de membranas com agentes farmacêuticos, toxicantes ambientais e até mesmo compostos biológicos. Essas técnicas podem ser usadas para fabricar membranas de complexidade líquida variada, e para avaliar a permeabilidade composta, absorção e incorporação dentro de membranas. Para começar, adicione o volume apropriado de solução de caldo lipíduo em uma vile de vidro limpo para obter uma concentração vesícula final de 2,5 miligramas por mililitro após a reidratação.Remova o clorofórmio da solução lipídica, usando um fluxo de gás nitrogênio. Para garantir a remoção completa do clorofórmio, conecte o filme lipíduo seco ao vácuo por pelo menos quatro horas. Reidratar o filme lipídico seco com um volume necessário de tampão de cloreto de sódio Tris para produzir a concentração final de vesícula de 2,5 miligramas por mililitro, e vórtice por aproximadamente 15 a 30 segundos.Transfira a suspensão da vesícula para um recipiente com gelo seco até congelar por aproximadamente 30 minutos. Depois que a amostra estiver completamente congelada, descongele a suspensão em um banho de água de 30 a 40 graus Celsius. Vórtice a suspensão vesícula descongelada.Para fazer um mililitro ou menos de vesículas, obtenha uma mini extrusora. Pré-molhar um suporte de filtro com água ultra pura e, em seguida, coloque-o sobre a superfície de suporte da membrana dentro do anel O. Repita para o segundo suporte interno da membrana.Posicione um suporte interno de membrana na carcaça externa extrusora. Coloque uma membrana de policarbonato de 100 nanômetros sobre o suporte interno da membrana diretamente sobre o suporte do filtro. Posicione o segundo suporte interno de membrana na carcaça externa extrusora com o anel O e o lado de suporte do filtro voltado para a membrana de policarbonato.Coloque o politetrafluoroetileno no nó do retentor e enrosque-o com a carcaça externa da extrusora. Corte a extrusora no bloco de aquecimento. Coloque a suspensão da vesícula lipídica em uma das seringas e posicione a seringa no bloco de calor extrusor, inserindo a agulha totalmente em uma extremidade da extrusora.Insira a segunda seringa vazia no lado oposto e bloqueie ambas as seringas usando os grampos de braço no bloco de calor. Empurre lentamente a suspensão vesícula para a seringa vazia e depois volte para a seringa original. Repita mais 20 vezes para um total de 21 passagens através da membrana de policarbonato.Transfira as vesículas lipídicas para um vidro limpo vil para armazenamento. Para extruir de cinco a 50 mililitros de vesículas, monte a grande extrusora colocando o suporte de tela de furo grande, disco centralado, discos de drenagem e membrana de policarbonato no espaço no suporte inferior extrusor. Conecte os suportes superiores e inferiores da extrusora usando os quatro parafusos e aperte.Coloque a unidade de extrusão no cilindro de amostra esfregando-a na parte inferior e apertando com uma chave inglesa para fixar. Encha o cilindro de amostra com água ultrauso e extrude a água através da unidade de extrusora antes de adicionar a amostra ao cilindro de amostra. Adicione a suspensão da vesícula lipídica no cilindro de amostra e enrosque a parte superior fechada.Aumente lentamente a pressão até que a amostra comece a escorrer da unidade de extrusora a uma taxa de aproximadamente duas a três gotas por segundo em uma vile de vidro limpo. Uma vez que toda a amostra tenha sido extrudada, desligue a fonte de nitrogênio e solte a pressão no cilindro de amostra abrindo a válvula de alívio de pressão lentamente. Despeje as vesículas lipídicas de volta no cilindro de amostra e repita o passo anterior mais nove vezes para um total de 10 extrusões.Carregue a suspensão da vesícula em cuvette apropriada e insira no instrumento de dispersão de luz dinâmica, insira os detalhes da amostra e realize a medição usando o software associado. Coloque a célula zeta na câmara de amostra, garantindo que os eletrodos estejam em contato e feche a tampa do suporte da amostra. No software associado, insira os detalhes da amostra e colete medições.Insira o sensor de cristal de quartzo codificado por sílica no módulo de fluxo, garantindo que a forma T no cristal se alinhe com a forma T no módulo e enrosque o módulo de fluxo fechado. Em instrumentos com múltiplas câmaras, bicamadas adicionais podem ser formadas em paralelo. Conecte a entrada e a tubulação de saída ao módulo de fluxo e à bomba.Coloque a tubulação nos protetores de retenção e feche a tampa do sistema de analisador. Coloque um recipiente de lixo na saída da bomba para coletar soluções gastas. Para realizar a limpeza, ligue primeiro a bomba e defina a velocidade de fluxo para 400 microliters por minuto.Insira a tubulação de entrada em água ultra pura e flua de 5 a 10 mililitros através do módulo. Mude a tubulação para SDS e flua de 5 a 10 mililitros através do módulo. Mude a tubulação de volta para água ultra pura e flua de 10 a 20 mililitros através do módulo.Finalmente, flua ar através do módulo até que nenhuma solução restante seja coletada. Remova o sensor do módulo de fluxo e enxágue o sensor com água ultra pura. Dirija o sensor e o módulo de fluxo com um fluxo de gás nitrogênio, certificando-se de que o eletrodo permanece sempre livre de qualquer líquido.Em uma capa de fumaça química, insira o sensor de cristal revestido de sílica em um instrumento de limpeza ultravioleta ou ozônio. Ligue o instrumento e deixe o tratamento por pelo menos dois minutos. Remova os sensores cuidadosamente e devolva-os para o módulo de fluxo.Ligue o instrumento analisador para conectar o software associado e defina a temperatura ao valor desejado para formar o bicamadorão lipídeco de suporte. Deixe a temperatura estabilizar para a entrada desejada. Configure a medição e encontre todas as frequências de ressonância do sensor e dissipação para sobretons três, cinco, sete, nove, 11 e 13 antes de iniciar a medição.Permita que o cloreto de sódio Tris flua através do módulo por cinco a 10 minutos, garantindo que a frequência de base mude ou Delta F e mude de dissipação ou valores Delta D em líquido permaneçam estáveis. Pare a bomba, remova a tubulação de entrada da solução de cloreto de sódio Tris e insira-a cuidadosamente na solução de vesícula lipídica. Backflow por cinco segundos para remover quaisquer bolhas de ar da tubulação de entrada e, em seguida, continuar o fluxo para a frente.Reinicie a medição no software para zerar a linha de base. Fluxo de vesículas lipídicas até que a formação de bicamadas seja observada em tempo real no software de aquisição de dados. Em seguida, repita esta etapa para alterar a tubulação de entrada de vesículas lipídicas de volta para o tampão de cloreto de sódio Tris.Adicione cinco microliters da solução lipídica ao compartimento do doador, que é uma placa de filtro polivinida de polivinida porosa 96 bem multi-tela com tamanho de poros de 0,45 micrometro. Submerse imediatamente a placa do filtro no compartimento do receptor, que é uma placa receptora de transporte contendo 300 microliters de soro fisco tamponado fosfato. Adicione 200 microliters de soro fisiológico tamponado de fosfato ao compartimento do doador de transporte.Siga os passos anteriores de parar a bomba e alterar a tubulação de entrada para solução de vesícula lipídica e observar a formação de bicamadas, em seguida, altere a tubulação de entrada para a solução de peptídeo alfa helicoidal ou AH. Introduza a solução no módulo de fluxo até que a mudança de frequência e a mudança de dissipação sejam observadas a partir da nova adição da solução. Pare a bomba e deixe o peptídeo AH incubar com as vesículas por 10 minutos.Mude a tubulação de entrada em cloreto de sódio Tris, e inicie o fluxo para remover o peptídeo AH das vesículas rompidas, levando à formação bem sucedida de um bicamado lipídico. Primeiro, flua o solvente da molécula, depois, troque a tubulação de entrada para a solução contendo a molécula de interesse e fluxo por pelo menos cinco minutos. Se desejar, pare o fluxo e deixe que o líquido que contenha a molécula desejada incubar com a bicamadas.Mude a tubulação de entrada de volta para o solvente de molécula sozinho. Flua por pelo menos cinco minutos, depois troque a tubulação de entrada em cloreto de sódio Tris e flua por pelo menos cinco minutos. No software, pare a medição, salve o arquivo e pare a bomba.Imediatamente seguindo as etapas anteriores para uma bicamada suspensa uni-lipídica ou para uma bicamada suspensa multi-lipídica, remova o PBS do compartimento da placa do filtro do doador e substitua por 200 microlitradores da solução de teste. Submerse imediatamente em uma nova placa receptora de transporte com 300 microliters de PBS. Após a incubação com balanço suave por duas horas a 25 graus Celsius, recolham 150 microliters da solução dos compartimentos doador e aceitador.Meça a concentração da molécula em ambas as amostras usando um método apropriado baseado nas propriedades desta molécula. Tamanho, polidispersidade e potencial zeta de vesículas de PC de ovo uni-lipídida, e duas composições de vesículas multifídidas foram comparadas. A distribuição de tamanho das vesículas do PC do ovo e vesículas multi lipídicas eram quase idênticas.Tanto o ovo quanto o PC multi-lipídas foram carregados negativamente, enquanto duas vesículas multi-lipídicas foram carregadas positivamente. As vesículas do PC do ovo uni-lipídida foram prontamente absorvidas à superfície, como mostra a diminuição da mudança de frequência, e aumento da mudança de dissipação, seguida de ruptura espontânea. Vesículas multi-lipídicas absorvidas à superfície, mas requerem a adição de peptídeo AH para romper as vesículas, resultando em formação de bicamadas lipídicas.Com bicamadas lipídicas suportadas, a mudança de frequência e a mudança de dissipação podem ser analisadas antes e depois da introdução de um composto de juros. Por exemplo, foram investigadas interações de DEHP e toxicante ambiental com uni apoiada e multicamadas por camadas. Níveis semelhantes de absorção de DEHP foram observados para ambos os tipos de bicamadas lipídicas.No entanto, foram observadas diferenças na mudança de dissipação entre as bicamadas com uma maior mudança de dissipação observada para a bicamada de PC de ovo em comparação com a multi-lipídica uma bicamada. Pouca permeação foi observada tanto para bicamadas uni-e-lipídicas. Após este procedimento, uma variedade de bicamadas lipídicas de imitação de células pode ser desenvolvida para permitir a triagem livre de células de interações moleculares com compostos que vão de fármacos a tóxicos ambientais.

Research

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Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...