Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом в рамках гранта No 1942418 присужденного A.S., и стипендии Национального научного фонда для аспирантов, присужденной C.M.B.H., в соответствии с грантом No 1644760. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда. Авторы благодарят доктора Ноэля Веру-Гонсалеса за получение данных о характеристике липидных пузырьков. Авторы благодарят профессора Роберта Херта (Университет Брауна) за использование его Zetasizer. Авторы благодарят Центр масс-спектрометрии Университета Брауна, в частности, доктора Тун-Ли Шена за помощь в количественной оценке липидного состава.

1. Развитие однолипидных везикул
<ol><li>Метод тонкопленочной гидратации<ol>
<li>Приготовление и хранение растворов липидного сырья ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы с использованием хлороформа должны выполняться в химической вытяжке. Хлороформ всегда следует пипетировать с использованием безопас?...

Этот протокол позволяет образовывать липидные везикулы, поддерживаемые липидные бислои и взвешенные липидные бислои. Здесь представлены критические шаги для формирования каждой из этих структур. При образовании липидных пузырьков важно экструдировать выше температуры перехода лип?...

Клеточная мембрана, состоящая в основном из фосфолипидов, холестерина и белков, является важнейшим компонентом всех живых клеток1. Благодаря организации, обусловленной амфифильностью липидов, клеточная мембрана функционирует как защитный барьер и регулирует, как клетка взаимодействует с окружающей средой2. Несколько клеточных процессов зависят от липидного и белкового составамембраны 1,2. Например, клеточные мембранные взаимодействия важны для эффективной доставки лекарств3. Фармацевтические препараты, биологические препараты, наноматериалы, биологические токсины и токсиканты окружающей среды могут влиять на целостность клеточной мембраны, тем самым влияя на клеточную функцию4. Построение моделей мембран in vitro, имитирующих клетки, на основе липидного состава клеточных мембран может обеспечить легкие инструменты для значительного улучшения изучения потенциального воздействия этих материалов на клетки.
Модельные липидные бислои включают липидные везикулы, поддерживаемые липидные бислои и взвешенные липидные бислои. Поддерживаемые липидные бислои представляют собой модель фосфолипидной клеточной мембраны, обычно используемой в биотехнологических приложениях, где липидные везикулы разрываются на поддерживаемом материале субстрата5,6,7,8,9. Одним из распространенных методов, используемых для мониторинга двухслойного образования, является микровес кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D), который исследует адсорбцию везикул в сравнении с объемными свойствами жидкости in situ8,10,11,12,13,14 . Ранее QCM-D использовался для демонстрации того, что в условиях потока, как только на поверхности достигается критическое покрытие пузырчатых липидных пузырьков фосфатидилхолина (ПК), они самопроизвольно разрываются на жесткие липидные бислои15. Предыдущая работа также исследовала образование поддерживаемых липидных бислоев с различными липидными композициями16,включением липидных белков17,18,19и использованием полимерных подушек20,что дает поддерживаемые липидные бислои, способные имитировать различные аспекты функции клеточной мембраны.
Липидные бислои использовались для имитации различных биологических барьеров от субклеточных до органных уровней, включая митохондрии, эритроциты и мембраны клеток печени, путем изменения фосфолипидов, холестерина и гликолипидных компонентов21. Эти более сложные многолипидные везикулы могут потребовать дополнительных методов для достижения разрыва везикул, в зависимости от липидного состава. Например, в предыдущих исследованиях использовался α-спиральный (АГ) пептид, полученный из неструктурного белка 5А вируса гепатита С, чтобы индуцировать образование бислоя путем дестабилизации адсорбированных липидных везикул22,23. Используя этот пептид AH, ранее были сформированы поддерживаемые липидные бислои, имитирующие плацентарные клетки24. Большой потенциал поддерживаемых липидных бислоев для биомедицинских применений был продемонстрирован с помощью исследований, охватывающих перенос молекул и наночастиц25,26,токсикантные взаимодействия окружающей среды27,сборку и функцию белка17,18,19,расположение и введение пептидов28,29,скрининг лекарств30и микрофлюидные платформы31.
Взвешенные липидные бислои были использованы для фармацевтических скрининговых исследований с помощью параллельного искусственного анализа проницаемости мембран (PAMPA), где липидный бислой подвешен через пористую гидрофобную вставку32,33,34,35. Липидные модели PAMPA были разработаны для различных биологических интерфейсов, включая кровяно-мозговой, буккальный, кишечный и трансдермальный интерфейсы36. Комбинируя как поддерживаемый липидный бислой, так и методы PAMPA, можно тщательно изучить адсорбцию, проницаемость и встраивание соединений в липидные компоненты желаемого типа ткани или клеток.
Этот протокол описывает изготовление и применение моделей липидных бислоев клеточной мембраны in vitro для исследования нескольких молекулярных взаимодействий. Подробно описано получение как однолипидных, так и мультилипидных поддерживаемых и взвешенных липидных бислоев. Чтобы сформировать поддерживаемый липидный бислой, липидные везикулы сначала разрабатываются с использованием тонкопленочных методов гидратации и экструзии с последующей физико-химической характеристикой. Обсуждается формирование поддерживаемого липидного бислоя с использованием мониторинга QCM-D и изготовление взвешенных липидных мембран для использования в PAMPA. Наконец, исследуются многолипидные везикулы для развития более сложных клеточных имитирующих мембран. Используя оба типа изготовленных липидных мембран, этот протокол демонстрирует, как этот инструмент может быть использован для изучения молекулярных взаимодействий. В целом, этот метод конструирует клетки, имитирующие липидные бислои с высокой воспроизводимостью и универсальностью.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Модельные клеточные мембраны являются полезным инструментом скрининга с приложениями, варьирующимися от раннего открытия лекарств до исследований токсичности. Клеточная мембрана является важнейшим защитным барьером для всех типов клеток, отделяя внутренние клеточные компоненты от внеклеточной среды. Эти мембраны состоят в основном из липидного бислоя, который содержит внешние гидрофильные головные группы и внутренние гидрофобные хвостовые группы, а также различные белки и холестерин. Состав и структура самих липидов играют решающую роль в регулировании биологической функции, включая взаимодействия между клетками и клеточной микросредой, которая может содержать фармацевтические препараты, биологические токсины и токсиканты окружающей среды. В этом исследовании описаны методы формулирования однолипидных и мультилипидных поддерживаемых и взвешенных клеток, имитирующих липидные бислои. Ранее были разработаны однолипидные фосфатидилхолиновые (PC) липидные бислои, а также многолипидные плацентарные трофобласт-вдохновленные липидными бислоями для использования в понимании молекулярных взаимодействий. Здесь будут представлены методы достижения обоих типов двухслойных моделей. Для клеток, имитирующих мультилипидные бислои, желаемую липидную композицию сначала определяют путем экстракции липидов из первичных клеток или клеточных линий с последующей жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (LC-MS). С использованием этой композиции липидные везикулы изготавливают методом тонкопленочной гидратации и экструзии и характеризуют их гидродинамический диаметр и дзета-потенциал. Поддерживаемые и взвешенные липидные бислои затем могут быть сформированы с использованием микровесов кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D) и на пористой мембране для использования в параллельном анализе проницаемости искусственной мембраны (PAMPA), соответственно. Репрезентативные результаты подчеркивают воспроизводимость и универсальность липидных двухслойных моделей in vitro клеточной мембраны. Представленные методы могут помочь в быстрой, поверхностной оценке механизмов взаимодействия, таких как проникновение, адсорбция и встраивание различных молекул и макромолекул с клеточной мембраной, помогая в скрининге кандидатов на лекарства и прогнозировании потенциальной клеточной токсичности.

Этот протокол детализирует методы формирования поддерживаемых и взвешенных липидных бислоев(рисунок 1). Первым шагом к формированию поддерживаемого липидного бислоя является развитие липидных пузырьков. Мини-экструдер позволяет готовить небольшие объемы липидных пу...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Этот протокол описывает образование клеток, имитирующих однолипидные и мультилипидные везикулы, поддерживаемые липидные бислои и взвешенные липидные бислои. Эти модели in vitro могут быть адаптированы для включения различных типов липидов и могут быть использованы для исследования различных взаимодействий молекул и макромолекул.

Сборка поддерживаемых и взвешенных липидных бислойных моделей, имитирующих клетки, для изучения молекулярных взаимодействий

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Конструкция липидных двухслойных мембран, описанная в этом протоколе, может быть использована для получения важной информации о мембранных взаимодействиях с фармацевтическими агентами, токсикантами окружающей среды и даже биологическими соединениями. Эти методы могут быть использованы для изготовления мембран различной сложности жидкости, а также для оценки проницаемости соединений, абсорбции и встраивания в мембраны. Для начала добавьте соответствующий объем раствора липидного сырья в чистую стеклянную мерзость, чтобы достичь конечной концентрации пузырьков 2,5 миллиграмма на миллилитр после регидратации.Удалить хлороформ из раствора липидов, используя струю газообразного азота. Чтобы обеспечить полное удаление хлороформа, подключите высушенную липидную пленку к вакууму не менее четырех часов. Регидратируйте высушенную липидную пленку требуемым объемом буфера хлорида натрия Tris, чтобы получить конечную концентрацию пузырьков 2,5 миллиграмма на миллилитр, и вихрь в течение приблизительно 15-30 секунд.Переложите везикулярную суспензию в контейнер с сухим льдом до замораживания в течение примерно 30 минут. После того, как образец будет полностью заморожен, разморозьте суспензию на водяной бане с температурой от 30 до 40 градусов цельсия. Вихревая размороженная везикулярная суспензия.Чтобы сделать один миллилитр или меньше везикул, приобретите мини-экструдер. Предварительно смочите опору фильтра сверхчистой водой, затем поместите ее на опорную поверхность мембраны внутри кольца O. Повторите для второй внутренней мембранной опоры.Поместите одну внутреннюю мембранную опору во внешний корпус экструдера. Поместите одну 100-нанометровую поликарбонатную мембрану на внутреннюю мембранную опору непосредственно над опорой фильтра. Поместите вторую внутреннюю мембранную опору во внешний корпус экструдера с кольцом O и опорой фильтра, обращенной к поликарбонатной мембране.Прикрепите подшипник политетрафторэтилена к стопорному узлу и завинтите его закрытым наружным корпусом экструдера. Закрепите экструдер в нагревательном блоке. Загрузите суспензию липидного пузырька в один из шприцев и поместите шприц в тепловой блок экструдера, полностью вставив иглу в один конец экструдера.Вставьте второй пустой шприц в противоположную сторону и зафиксируйте оба шприца с помощью зажимов на тепловом блоке. Медленно вдавите вяленую суспензию в пустой шприц, а затем обратно в исходный шприц. Повторите еще 20 раз, в общей сложности 21 проход через поликарбонатную мембрану.Переложите липидные везикулы в чистую стеклянную мерзость для хранения. Чтобы выдавить от пяти до 50 миллилитров везикул, соберите большой экструдер, поместив большую отверстие экранной опоры, центрированный диск, дренажные диски и поликарбонатную мембрану в пространство в нижней опоре экструдера. Соедините верхнюю и нижнюю опоры экструдера с помощью четырех винтов и затяните.Прикрепите блок экструдера к цилиндру для образцов, почистив его до дна и затянув гаечным ключом для фиксации. Наполните цилиндр для проб сверхчистой водой и выдавите воду через экструдер перед добавлением образца в цилиндр для образцов. Добавьте суспензию липидного пузырька в цилиндр для образцов и прикрутите верхнюю закрытую часть.Медленно увеличивайте давление до тех пор, пока образец не начнет капать из экструдера со скоростью примерно две-три капли в секунду в чистую стеклянную мерзость. После того, как весь образец будет экструдирован, выключите подачу азота и спустите давление в цилиндре для образцов, медленно открыв клапан сброса давления. Перелейте липидные везикулы обратно в цилиндр образца и повторите предыдущий шаг еще девять раз, в общей сложности 10 экструзий.Загрузите везикулярную суспензию в соответствующую кювету и вставьте в прибор динамического рассеяния света, введите детали образца и выполните измерение с помощью соответствующего программного обеспечения. Поместите дзета-ячейку в камеру для отбора проб, убедившись, что электроды находятся в контакте, и закройте крышку держателя образца. В соответствующем программном обеспечении введите сведения о образце и соберите измерения.Вставьте датчик кварцевого кристалла с кодировкой кремнезема в модуль потока, убедившись, что Т-образная форма на кристалле совпадает с Т-образной формой на модуле, и завинтите модуль потока закрытым. В инструментах с несколькими камерами параллельно могут образовываться дополнительные бислои. Подключите впускную и выпускную трубки к проточному модулю и насосу.Поместите трубку в удерживающую кожухи и закройте крышку анализаторной системы. Поместите контейнер для отходов на выходе из насоса для сбора отработанных растворов. Для выполнения очистки сначала включите насос и установите скорость потока на 400 микролитров в минуту.Вставьте впускную трубку в сверхчистую воду и пропустите через модуль от пяти до 10 миллилитров. Переключите трубку в SDS и пропустите от пяти до 10 миллилитров через модуль. Переключите трубку обратно в сверхчистую воду и протейте через модуль от 10 до 20 миллилитров.Наконец, пропустите воздух через модуль до тех пор, пока не будет собран оставшийся раствор. Извлеките датчик из модуля потока и промойте его сверхчистой водой. Управляйте датчиком и модулем потока с потоком газообразного азота, следя за тем, чтобы электрод всегда оставался свободным от любой жидкости.В химический вытяжной капюшон вставьте кварцевый кристаллический датчик с кремнеземным покрытием в ультрафиолетовый или озоноочистительный прибор. Включите инструмент и оставьте обработку не менее двух минут. Осторожно извлеките датчики и верните их в модуль потока.Включите анализатор, чтобы подключить соответствующее программное обеспечение и установить температуру на желаемое значение для формирования поддерживающего липидного бислоя. Позвольте температуре стабилизироваться до нужного входа. Настройте измерение и найдите все резонансные частоты датчика, а также рассеивание для обертонов три, пять, семь, девять, 11 и 13 перед началом измерения.Позвольте Tris хлориду натрия протекать через модуль в течение пяти-10 минут, гарантируя, что базовое изменение частоты или delta F и изменение диссипации или значения Delta D в жидкости остаются стабильными. Остановите насос, извлеките впускную трубку из раствора натрия Tris и осторожно вставьте ее в раствор липидных пузырьков. Обратный поток в течение пяти секунд, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из впускной трубки, а затем продолжить прямой поток.Перезапустите измерение в программном обеспечении, чтобы свести к нулю базовый уровень. Поток липидных везикул до образования бислоя наблюдается в режиме реального времени в программном обеспечении для сбора данных. Затем повторите этот шаг, чтобы изменить впускную трубку с липидных пузырьков обратно на буфер хлорида натрия Tris.Добавьте пять микролитров липидного раствора в донорский отсек, который представляет собой пористый поливинилидендифторид 96 скважины с многоэкранной фильтрующей пластиной с размером пор 0,45 микрометра. Немедленно погрузите фильтрующую пластину в отсек акцептора, который представляет собой транспортную приемную пластину, содержащую 300 микролитров фосфатно-буферного физиологического раствора. Добавьте 200 микролитров фосфатно-буферного физиологического раствора в отсек транспортного донора.Выполните предыдущие шаги по остановке насоса и замене входной трубки на раствор липидных пузырьков и наблюдению за образованием бислоя, затем замените впускную трубку на альфа-спиральный или ГЛТИДный раствор AH. Вводите раствор в модуль потока до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение частоты и диссипации от добавления нового раствора. Остановите насос и дайте пептиду АГ инкубироваться с везикулами в течение 10 минут.Переключите впускную трубку в Tris хлорид натрия и запустите поток, чтобы удалить пептид AH из разорванных везикул, что приведет к успешному образованию липидного бислоя. Сначала протолкните молекулу растворителя, затем переключите входную трубку в раствор, содержащий интересующую молекулу, и течь в течение, по меньшей мере, пяти минут. При желании остановите поток и дайте жидкости, содержащей нужную молекулу, инкубироваться с бислоем.Замените впускную трубку обратно на молекулярный растворитель. Течь в течение не менее пяти минут, затем переключите впускную трубку на Tris натрия хлорид и течь в течение не менее пяти минут. В программном обеспечении остановите измерение, сохраните файл и остановите насос.Сразу после выполнения предыдущих шагов для однолипидного взвешенного бислоя или для многолипидного взвешенного бислоя удалите PBS из отсека донорной фильтрующей пластины и замените 200 микролитрами тестового раствора. Немедленно погружайтесь в новую транспортную приемную пластину с 300 микролитрами PBS. После инкубации с мягким раскачиванием в течение двух часов при 25 градусах Цельсия соберите 150 микролитров раствора из донорского и акцепторного отсеков.Измерьте концентрацию молекулы в обоих образцах с помощью соответствующего метода, основанного на свойствах этой молекулы. Сравнивались размер, полидисперсность и дзета-потенциал однолипидных яйцеклеток PC везикул и двух составов многолипидных пузырьков. Распределение по размерам везикул PC яйца и многолипидных везикул было почти идентичным.Как яйцеклетка, так и PC мультилипидные везикулы были отрицательно заряжены, в то время как мультилипидные две везикулы были положительно заряжены. Однолипидные яйцеклетки PC везикулы легко всасываются на поверхность, о чем свидетельствует уменьшение изменения частоты и увеличение изменения диссипации с последующим самопроизвольным разрывом. Многолипидные везикулы всасываются на поверхность, но требуют добавления пептида АГ для разрыва везикул, в результате чего образуются липидные бислои.С поддерживаемыми липидными бислоями изменение частоты и изменение диссипации могут быть проанализированы до и после введения интересующего соединения. Например, исследованы взаимодействия DEHP и экологического токсиканта с поддерживаемым уни и многослойными слоями. Аналогичные уровни абсорбции DEHP наблюдались для обоих типов липидных бислоев.Тем не менее, различия в изменении диссипации наблюдались между бислоями с большим изменением диссипации, наблюдаемым для бислоя яйца PC по сравнению с многолипидным однослойным. Малое проникновение наблюдалось как для одно-, так и для многолипидных бислоев. После этой процедуры могут быть разработаны различные клеточные имитирующие липидные бислои, чтобы обеспечить бесклеточный скрининг молекулярных взаимодействий с соединениями, начиная от фармацевтических препаратов и заканчивая токсикантами окружающей среды.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Синтез, монтаж, и характеристика монослоя охраняемые пленок золота наночастицы для Белки электрохимии монослоя

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Адгезия частот для пробирной В Ситу Кинетика Анализ кросс-соединительного молекулярных взаимодействий в клетка-клетка интерфейс

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Винтовая Организация свертывания крови фактора VIII на липидный нанотрубок

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Подготовка Mica Поддерживаемые липидного бислоя за большой размер оптической микроскопии изображений

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий<em&gt; В Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Автоматизированная двухслойной липидной мембраной, Образование Использование тонкой пленки полидиметилсилоксана

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...