Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
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Este material se basa en el trabajo apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. 1942418 otorgada a A.S., y una Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias otorgada a C.M.B.H., bajo la Subvención No. 1644760. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation. Los autores agradecen al Dr. Noel Vera-González por la adquisición de datos de caracterización de vesículas lipídicas. Los autores agradecen al profesor Robert Hurt (Universidad de Brown) por el uso de su Zetasizer. Los autores agradecen a la Instalación de Espectrometría de Masas de la Universidad de Brown, en particular, al Dr. Tun-Li Shen por su ayuda para cuantificar la composición lipídica.

1. Desarrollo de vesículas unilipídicas
<ol><li>Método de hidratación de película delgada<ol>
<li>Preparación y almacenamiento de soluciones de almacenamiento de lípidos NOTA: Todos los pasos que usan cloroformo deben realizarse en una campana de humos químicos. El cloroformo siempre debe pipetearse con puntas de pipeta de fibra de carbono seguras para solventes. Las soluciones que contienen cloroformo siempre deben almacenarse en viales de vidrio.<ol>
<li>Prepare una solución de caldo de lípidos de 10 mg/...

Este protocolo permite la formación de vesículas lipídicas, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Aquí, se presentan pasos críticos para formar cada una de estas estructuras. Al formar vesículas lipídicas, es importante extruir por encima de la temperatura de transición del lípido39. Cuando está por debajo de la temperatura de transición, el lípido está físicamente presente en su fase de gel ordenada39. En esta fase ordenada, las cola...

La membrana celular, compuesta principalmente de fosfolípidos, colesterol y proteínas, es un componente crucial de todas las células vivas1. Con una organización impulsada por la anfifilia lipídica, la membrana celular funciona como una barrera protectora y regula cómo la célula interactúa con su entorno circundante2. Varios procesos celulares dependen de la composición lipídica y proteica de la membrana1,2. Por ejemplo, las interacciones de la membrana celular son importantes para la administración efectiva de fármacos3. Los productos farmacéuticos, biológicos, nanomateriales, toxinas biológicas y tóxicos ambientales pueden afectar la integridad de una membrana celular, afectando así la función celular4. La construcción de modelos de membrana que imitan células in vitro basados en la composición lipídica de las membranas celulares tiene el potencial de proporcionar herramientas fáciles para mejorar en gran medida el estudio del impacto potencial de estos materiales en las células.
Las bicapas lipídicas modelo incluyen vesículas lipídicas, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Las bicapas lipídicas soportadas son un modelo de la membrana celular fosfolípida comúnmente utilizada en aplicaciones biotecnológicas donde las vesículas lipídicas se rompen sobre un material de sustrato soportado5,6,7,8,9. Una técnica común utilizada para monitorear la formación de bicapa es la microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que examina la adsorción de vesículas en comparación con las propiedades líquidas a granel in situ8,10,11,12,13,14 . Anteriormente, QCM-D se ha utilizado para demostrar que en condiciones de flujo, una vez que se logra una cobertura crítica de vesículas lipídicas de fosfatidilcolina (PC) en la superficie, se rompen espontáneamente en bicapas lipídicas rígidas15. Trabajos anteriores también han investigado la formación de bicapas lipídicas apoyadas con composiciones lipídicas variables16,la incorporación de proteínas lipídicas17, 18,19y la utilización de cojines de polímeros20,produciendo bicapas lipídicas soportadas capaces de imitar varios aspectos de la función de la membrana celular.
Las bicapas lipídicas se han utilizado para imitar varias barreras biológicas desde los niveles subcelulares hasta los de órganos, incluidas la mitocondria, los glóbulos rojos y las membranas de las células hepáticas, alterando los componentes de fosfolípidos, colesterol y glicolípidos21. Estas vesículas multilipídicas más complejas pueden requerir métodos adicionales para lograr la ruptura de la vesícula, dependiendo de la composición lipídica. Por ejemplo, estudios previos han utilizado un péptido α-helicoidal (AH) derivado de la proteína no estructural 5A del virus de la hepatitis C para inducir la formación de bicapa desestabilizando las vesículas lipídicas adsorbidas22,23. Usando este péptido AH, previamente se han formado bicapas lipídicas soportadas que imitan las célulasplacentarias 24. El gran potencial de las bicapas lipídicas soportadas para aplicaciones biomédicas se ha demostrado con investigaciones que abarcan el transporte molecular y de nanopartículas25,26,interacciones tóxicas ambientales27,ensamblaje y función de proteínas17,18,19,disposición e inserción de péptidos28,29,detección de fármacos30y plataformas microfluídicas31.
Las bicapas lipídicas suspendidas se han utilizado para estudios de cribado farmacéutico a través de un ensayo paralelo de permeabilidad a la membrana artificial (PAMPA) donde se suspende una bicapa lipídica a través de un inserto hidrofóbico poroso32,33,34,35. Se han desarrollado modelos lipídicos de PAMPA para diferentes interfaces biológicas, incluidas las interfaces sangre-cerebro, bucal, intestinal y transdérmica36. Al combinar tanto la bicapa lipídica soportada como las técnicas PAMPA, se puede estudiar a fondo la adsorción, la permeabilidad y la incrustación de compuestos dentro de los componentes lipídicos de un tejido o tipo de célula deseado.
Este protocolo describe la fabricación y aplicación de modelos de bicapa lipídica de membrana celular in vitro para investigar varias interacciones moleculares. Se detalla la preparación de las bicapas lipídicas y suspendidas de lípidos unilipídicas y multilídicas. Para formar una bicapa lipídica soportada, las vesículas lipídicas se desarrollan primero utilizando métodos de hidratación y extrusión de película delgada seguidos de caracterización fisicoquímica. Se discute la formación de una bicapa lipídica soportada utilizando el monitoreo QCM-D y la fabricación de membranas lipídicas suspendidas para su uso en PAMPA. Finalmente, se examinan las vesículas multilipídicas para el desarrollo de membranas que imitan células más complejas. Utilizando ambos tipos de membranas lipídicas fabricadas, este protocolo demuestra cómo esta herramienta se puede utilizar para estudiar las interacciones moleculares. En general, esta técnica construye bicapas lipídicas que imitan a las células con alta reproducibilidad y versatilidad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Las membranas celulares modelo son una herramienta de detección útil con aplicaciones que van desde el descubrimiento temprano de fármacos hasta los estudios de toxicidad. La membrana celular es una barrera protectora crucial para todos los tipos de células, separando los componentes celulares internos del entorno extracelular. Estas membranas están compuestas en gran parte por una bicapa lipídica, que contiene grupos de cabeza hidrófilos externos y grupos de cola hidrófobos internos, junto con varias proteínas y colesterol. La composición y la estructura de los lípidos en sí mismos juegan un papel crucial en la regulación de la función biológica, incluidas las interacciones entre las células y el microambiente celular, que puede contener productos farmacéuticos, toxinas biológicas y tóxicos ambientales. En este estudio, se describen métodos para formular bicapas lipídicas y multilipídicas apoyadas y suspendidas que imitan a las células lipídicas. Anteriormente, se desarrollaron bicapas lipídicas de fosfatidilcolina (PC) unilídicas, así como bicapas lipídicas inspiradas en trofoblastos placentarios multilípidos para su uso en la comprensión de las interacciones moleculares. Aquí, se presentarán los métodos para lograr ambos tipos de modelos bicapa. Para las bicapas multilipídicas que imitan a las células, la composición lipídica deseada se determina primero mediante la extracción de lípidos de células primarias o líneas celulares, seguida de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Utilizando esta composición, las vesículas lipídicas se fabrican utilizando un método de hidratación y extrusión de película delgada y se caracterizan su diámetro hidrodinámico y potencial zeta. Las bicapas lipídicas soportadas y suspendidas se pueden formar utilizando microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D) y en una membrana porosa para su uso en un ensayo de permeabilidad de membrana artificial paralela (PAMPA), respectivamente. Los resultados representativos destacan la reproducibilidad y versatilidad de los modelos de bicapa lipídica de membrana celular in vitro. Los métodos presentados pueden ayudar en la evaluación rápida y fácil de los mecanismos de interacción, como la permeación, la adsorción y la incrustación, de varias moléculas y macromoléculas con una membrana celular, ayudando en la detección de candidatos a fármacos y la predicción de la toxicidad celular potencial.

Este protocolo detalla los métodos para formar bicapas lipídicas soportadas y suspendidas (Figura 1). El primer paso para formar una bicapa lipídica soportada es desarrollar vesículas lipídicas. La mini extrusora permite preparar pequeños volúmenes de vesículas lipídicas (1 ml o menos), mientras que la extrusora grande permite preparar 5-50 ml de vesículas lipídicas en un lote. Las distribuciones de tamaño de las vesículas unilipídicas formadas por la extrusora mini o grande se...

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Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

La construcción de membranas bicapa lipídicas descritas en este protocolo se puede utilizar para obtener información crucial sobre las interacciones de la membrana con agentes farmacéuticos, tóxicos ambientales e incluso compuestos biológicos. Estas técnicas se pueden utilizar para fabricar membranas de complejidad líquida variable y para evaluar la permeabilidad, absorción e incrustación de compuestos dentro de las membranas. Para comenzar, agregue el volumen apropiado de solución de almacenamiento de lípidos en un vidrio limpio vil para lograr una concentración final de vesícula de 2.5 miligramos por mililitro después de la rehidratación.Elimine el cloroformo de la solución lipídica, utilizando una corriente de gas nitrógeno. Para garantizar la eliminación completa del cloroformo, conecte la película lipídica seca al vacío durante al menos cuatro horas. Rehidrate la película lipídica seca con un volumen requerido de tampón de cloruro de sodio Tris para producir la concentración final de vesícula de 2.5 miligramos por mililitro, y vórtice durante aproximadamente 15 a 30 segundos.Transfiera la suspensión de vesículas a un recipiente con hielo seco hasta que se congele durante aproximadamente 30 minutos. Después de que la muestra esté completamente congelada, descongele la suspensión en un baño de agua de 30 a 40 grados centígrados. Vórtice la suspensión de vesícula descongelada.Para hacer un mililitro o menos de vesículas, obtenga una mini extrusora. Moje previamente un soporte de filtro con agua ultra pura, luego colóquelo en la superficie de soporte de la membrana dentro del anillo O. Repita para el segundo soporte de membrana interna.Coloque un soporte de membrana interna en la carcasa exterior del extrusor. Coloque una membrana de policarbonato de 100 nanómetros sobre el soporte de la membrana interna directamente sobre el soporte del filtro. Coloque el segundo soporte de membrana interna en la carcasa exterior del extrusor con el anillo O y el lado de soporte del filtro frente a la membrana de policarbonato.Fije el rodamiento de politetrafluoroetileno en el nudo de retención y atorníllelo cerrado con la carcasa exterior del extrusor. Enganche la extrusora en el bloque de calentamiento. Cargue la suspensión de vesícula lipídica en una de las jeringas y coloque la jeringa en el bloque de calor del extrusor, insertando la aguja completamente en un extremo del extrusor.Inserte la segunda jeringa vacía en el lado opuesto y bloquee ambas jeringas con los clips para el brazo en el bloque de calor. Empuje lentamente la suspensión de la vesícula en la jeringa vacía y luego vuelva a la jeringa original. Repita 20 veces más para un total de 21 pasadas a través de la membrana de policarbonato.Transfiera las vesículas lipídicas a un vidrio limpio vil para su almacenamiento. Para extruir de cinco a 50 mililitros de vesículas, ensamble la extrusora grande colocando el soporte de la pantalla de orificio grande, el disco centrado, los discos de drenaje y la membrana de policarbonato en el espacio en el soporte inferior del extrusor. Conecte los soportes superior e inferior de la extrusora con los cuatro tornillos y apriete.Conecte la unidad extrusora al cilindro de muestra frotándola hasta la parte inferior y apretándola con una llave inglesa para asegurarla. Llene el cilindro de muestra con agua ultrapura y extruya el agua a través de la unidad extrusora antes de agregar la muestra al cilindro de muestra. Agregue la suspensión de vesícula lipídica en el cilindro de muestra y cierre la parte superior.Aumente lentamente la presión hasta que la muestra comience a gotear desde la unidad extrusora a una velocidad de aproximadamente dos o tres gotas por segundo en un vidrio limpio vil. Una vez que toda la muestra haya sido extruida, apague el suministro de nitrógeno y libere la presión en el cilindro de muestra abriendo lentamente la válvula de alivio de presión. Vierta las vesículas lipídicas de nuevo en el cilindro de muestra y repita el paso anterior nueve veces más para un total de 10 extrusiones.Cargue la suspensión de vesícula en la cubeta apropiada e insértela en el instrumento de dispersión dinámica de luz, ingrese los detalles de la muestra y realice la medición utilizando el software asociado. Coloque la celda zeta en la cámara de muestra, asegurándose de que los electrodos estén en contacto, y cierre la tapa del portamuestras. En el software asociado, ingrese los detalles de la muestra y recopile las mediciones.Inserte el sensor de cristal de cuarzo codificado con sílice en el módulo de flujo, asegurándose de que la forma de T en el cristal se alinee con la forma de T en el módulo y cierre el módulo de flujo. En instrumentos con múltiples cámaras, se pueden formar bicapas adicionales en paralelo. Conecte el tubo de entrada y salida al módulo de flujo y a la bomba.Coloque el tubo en los protectores de sujeción y cierre la tapa del sistema analizador. Coloque un contenedor de residuos en la salida de la bomba para recoger las soluciones gastadas. Para realizar la limpieza, primero encienda la bomba y ajuste la velocidad de flujo a 400 microlitros por minuto.Inserte el tubo de entrada en agua ultra pura y fluya de cinco a 10 mililitros a través del módulo. Cambie el tubo a SDS y fluya de cinco a 10 mililitros a través del módulo. Vuelva a cambiar el tubo a agua ultra pura y fluya de 10 a 20 mililitros a través del módulo.Finalmente, fluya el aire a través del módulo hasta que no se recoja ninguna solución restante. Retire el sensor del módulo de flujo y enjuague el sensor con agua ultra pura. Impulse el sensor y el módulo de flujo con una corriente de gas nitrógeno, asegurándose de que el electrodo siempre permanezca libre de cualquier líquido.En una campana de humos químicos, inserte el sensor de cristal de cuarzo recubierto de sílice en un instrumento de limpieza ultravioleta u ozono. Encienda el instrumento y permita el tratamiento durante al menos dos minutos. Retire los sensores con cuidado y devuélvalos al módulo de flujo.Encienda el instrumento analizador para conectar el software asociado y establecer la temperatura al valor deseado para formar la bicapa lipídica de apoyo. Permita que la temperatura se estabilice a la entrada deseada. Configure la medición y busque todas las frecuencias de resonancia del sensor, y la disipación para los sobretonos tres, cinco, siete, nueve, 11 y 13 antes de comenzar la medición.Permita que el cloruro de sodio Tris fluya a través del módulo durante cinco a 10 minutos, asegurando que el cambio de frecuencia basal o Delta F y el cambio de disipación o los valores de Delta D en líquido permanezcan estables. Detenga la bomba, retire el tubo de entrada de la solución de cloruro de sodio Tris e insértelo cuidadosamente en la solución de vesícula lipídica. Reflujo durante cinco segundos para eliminar cualquier burbuja de aire del tubo de entrada y luego continuar el flujo hacia adelante.Reinicie la medición en el software para poner a cero la línea base. Flujo de vesículas lipídicas hasta la formación de bicapa que se observa en tiempo real en el software de adquisición de datos. Luego repita este paso para cambiar el tubo de entrada de las vesículas lipídicas a un tampón de cloruro de sodio Tris.Agregue cinco microlitros de la solución lipídica al compartimiento donante, que es una placa de filtro multipantalla de polivinilideno poroso 96 pozos con un tamaño de poro de 0,45 micrómetros. Sumerja inmediatamente la placa de filtro en el compartimento aceptor, que es una placa receptora de transporte que contiene 300 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Añadir 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato al compartimento del donante de transporte.Siga los pasos anteriores para detener la bomba y cambiar el tubo de entrada a una solución de vesícula lipídica y observar la formación de bicapas, luego cambie el tubo de entrada en la solución alfa helicoidal o de péptido AH. Introduzca la solución en el módulo de flujo hasta que se observe el cambio de frecuencia y el cambio de disipación a partir de la nueva adición de solución. Detenga la bomba y deje que el péptido AH se incube con las vesículas durante 10 minutos.Cambie el tubo de entrada a cloruro de sodio Tris e inicie el flujo para eliminar el péptido AH de las vesículas rotas, lo que lleva a la formación exitosa de una bicapa lipídica. Primero, fluya el disolvente de la molécula, luego, cambie el tubo de entrada a la solución que contiene la molécula de interés y fluya durante al menos cinco minutos. Si lo desea, detenga el flujo y permita que el líquido que contiene la molécula deseada se incube con la bicapa.Cambie el tubo de entrada de nuevo a la molécula disolvente solo. Fluya durante al menos cinco minutos, luego cambie el tubo de entrada a cloruro de sodio Tris y fluya durante al menos cinco minutos. En el software, detenga la medición, guarde el archivo y detenga la bomba.Inmediatamente después de los pasos anteriores para una bicapa suspendida unilipídica o para una bicapa suspendida multilipídica, retire el PBS del compartimiento de la placa del filtro donante y reemplácelo con 200 microlitros de la solución de prueba. Sumergirse inmediatamente en una nueva placa receptora de transporte con 300 microlitros de PBS. Después de la incubación con balanceo suave durante dos horas a 25 grados centígrados, recolecte 150 microlitros de la solución de los compartimentos donante y aceptor.Medir la concentración de moléculas en ambas muestras utilizando un método apropiado basado en las propiedades de esta molécula. Se compararon el tamaño, la polidispersidad y el potencial Zeta de las vesículas PC de huevo unilipídicas y dos composiciones de vesículas multilipídicas. La distribución del tamaño de las vesículas PC del huevo y las vesículas multilipídicas fueron casi idénticas.Tanto las vesículas de huevo como las de PC multilipídicas se cargaron negativamente, mientras que las vesículas multilipídicas de dos se cargaron positivamente. Las vesículas PC de huevo unilipídicas se absorben fácilmente en la superficie, como lo demuestra la disminución del cambio de frecuencia y el aumento del cambio de disipación, seguido de una ruptura espontánea. Las vesículas multilipídicas se absorben en la superficie, pero requieren la adición de péptido AH para romper las vesículas, lo que resulta en la formación de bicapa lipídica.Con las bicapas lipídicas soportadas, el cambio de frecuencia y el cambio de disipación se pueden analizar antes y después de la introducción de un compuesto de interés. Por ejemplo, se investigaron las interacciones del DEHP y el tóxico ambiental con capas uni y multicapa soportadas. Se observaron niveles similares de absorción de DEHP para ambos tipos de bicapa lipídica.Sin embargo, se observaron diferencias en el cambio de disipación entre las bicapas con un cambio de disipación mayor observado para la bicapa PC del huevo en comparación con la bicapa multilipídica. Se observó poca permeación para las bicapas uni-y multi-lipídicas una. Después de este procedimiento, se puede desarrollar una variedad de bicapas lipídicas que imitan a las células para permitir la detección libre de células de las interacciones moleculares con compuestos que van desde productos farmacéuticos hasta tóxicos ambientales.

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Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...