Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under Grant No. 1942418 som tilldelats A.S., och en National Science Foundation Graduate Research Fellowship som tilldelas C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter. Författarna tackar Dr. Noel Vera-González för lipid vesikel karakterisering data förvärv. Författarna tackar professor Robert Hurt (Brown University) för användningen av hans Zetasizer. Författarna tackar Brown University Mass Spectrometry Facility, i synnerhet Dr. Tun-Li Shen för hjälp med att kvantifiera lipidkomposition.

1. Utveckla uni-lipid blåsor
<ol><li>Tunnfilmshydreringsmetod<ol>
<li>Beredning och lagring av lipidlagerlösningar OBS: Alla steg med kloroform måste utföras i en kemisk rökhuv. Kloroform ska alltid pipetteras med lösningsmedelssäkra rörettspetsar för kolfiber. Lösningar som innehåller kloroform bör alltid förvaras i glasflaskor.<ol>
<li>Förbered en 10 mg/ml lipidbuljonglösning genom att tillsätta lämplig volym kloroform i injektionsflaskan som innehåller lipidpulvret och blanda väl. Tillsätt til...

Detta protokoll möjliggör bildandet av lipidblåsor, stöds lipidbilayers och suspenderade lipidbilayers. Här presenteras kritiska steg för att bilda var och en av dessa strukturer. Vid formning av lipidblåsor är det viktigt att extrudera över övergångstemperaturen för lipiden39. När den är under övergångstemperaturen är lipiden fysiskt närvarande i sin beställda gelfas39. I denna beställda fas är kolvätefettsvansarna helt utsträckta vilket möjliggör ...

Cellmembranet, som huvudsakligen består av fosfolipider, kolesterol och proteiner, är en avgörande komponent i alla levande celler1. Med organisation driven av lipidamfifilicitet fungerar cellmembranet som en skyddande barriär och reglerar hur cellen interagerar med sin omgivande miljö2. Flera cellulära processer är beroende av lipid- och proteinsammansättningen i membranet1,2. Till exempel är cellmembraninteraktioner viktiga för effektiv läkemedelsleverans3. Läkemedel, biologiska läkemedel, nanomaterial, biologiska toxiner och miljögifter kan påverka integriteten hos ett cellmembran och därmed påverka cellulär funktion4. Konstruktionen av in vitro-cellimitionsmodeller baserade på cellmembranens lipidsammansättning har potential att tillhandahålla enkla verktyg för att kraftigt förbättra studien av dessa materials potentiella inverkan på celler. 
Modell lipidbilayers inkluderar lipidblåsor, stöds lipidbilayers och suspenderade lipidbilayers. Lipidbilayers som stöds är en modell av fosfolipidcellmembranet som vanligtvis används i biotekniktillämpningar där lipidblåsor bryts på ett substratmaterial som stöds5,6,7,8,9. En vanlig teknik som används för att övervaka bilayerbildning är kvartskristallmikrobalans med dissipationsövervakning (QCM-D), som undersöker adsorptionen av blåsor i jämförelse med bulkvätskans egenskaper in situ8,10,11,12,13,14 . Tidigare har QCM-D använts för att visa att under flödesförhållanden, när en kritisk vesikeltäckning av fosfatidylkolin (PC) lipidblåsor uppnås på ytan, brister de spontant i styv lipidbilayers15. Tidigare arbete har också undersökt stödd lipidbilayerbildning med varierande lipidkompositioner16, införlivande av lipidproteiner17,18,19, och användning av polymerkuddar20, vilket ger stödda lipidbilayers som kan efterlikna olika aspekter av cellmembranfunktionen.
Lipidbilayers har använts för att efterlikna olika biologiska barriärer från subcellulära till organnivåer inklusive mitokondri, röda blodkroppar och levercellmembran genom att ändra fosfolipid-, kolesterol- och glykolipidkomponenterna21. Dessa mer komplexa multi-lipid blåsor kan kräva ytterligare metoder för att uppnå vesikel bristning, beroende på lipid sammansättning. Till exempel har tidigare studier använt en α-spiralformad (AH) peptid som härrör från hepatit C-virusets icke-strukturella protein 5A för att inducera bilayerbildning genom att destabilisera adsorberade lipidblåsor22,23. Med hjälp av denna AH-peptid har stödda lipidbilayers som efterliknar placentaceller tidigare bildats24. Den stora potentialen hos lipidbilayers som stöds för biomedicinska tillämpningar har visats med undersökningar som spänner över molekylär- och nanopartikeltransport25,26,interaktioner med miljögifter27,proteinmontering och funktion17,18,19, peptidarrangemang och införande28,29,läkemedelsscreening30och mikrofluidiska plattformar31.
Suspenderade lipidbilayers har använts för läkemedelsscreeningsstudier via en parallell artificiell membranpermeabilitetsanalys (PAMPA) där en lipidbilayer suspenderas över ett poröst hydrofobiskt skär32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller har utvecklats för olika biologiska gränssnitt inklusive blod- hjärn-, buccal-, tarm- och depotplåster36. Genom att kombinera både den stödda lipidbilayer och PAMPA tekniker, adsorption, permeabilitet, och inbäddning av föreningar inom lipidkomponenter av en önskad vävnad eller celltyp kan studeras noggrant.
Detta protokoll beskriver tillverkning och tillämpning av in vitro cell membran lipid bilayer modeller för att undersöka flera molekylära interaktioner. Beredning av både uni-lipid och multi-lipid stöds och suspenderade lipidbilayers är detaljerad. För att bilda en stödd lipidbilayer utvecklas lipidblåsor först med tunnfilmshydrering och extruderingsmetoder följt av fysikalisk-kemiska karakterisering. Bildandet av en lipidbilayer som stöds med QCM-D övervakning och tillverkning av suspenderade lipidmembran för användning i PAMPA diskuteras. Slutligen undersöks multi-lipid vesiklar för utveckling av mer komplexa cell härma membran. Med hjälp av båda typerna av tillverkade lipidmembran visar detta protokoll hur detta verktyg kan användas för att studera molekylära interaktioner. Sammantaget konstruerar denna teknik cell som efterliknar lipidbilayers med hög reproducerbarhet och mångsidighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Modellcellmembran är ett användbart screeningverktyg med tillämpningar som sträcker sig från tidig läkemedelsupptäckt till toxicitetsstudier. Cellmembranet är en avgörande skyddsbarriär för alla celltyper och separerar de inre cellulära komponenterna från den extracellulära miljön. Dessa membran består till stor del av en lipidbilayer, som innehåller yttre hydrofila huvudgrupper och inre hydrofoba svansgrupper, tillsammans med olika proteiner och kolesterol. Lipidernas sammansättning och struktur spelar en avgörande roll för att reglera den biologiska funktionen, inklusive interaktioner mellan celler och cellulär mikromiljö, som kan innehålla läkemedel, biologiska toxiner och miljögifter. I denna studie beskrivs metoder för att formulera uni-lipid och multi-lipid stöds och suspenderad cell som efterliknar lipid bilayers. Tidigare utvecklades uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipidbilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirerade lipidbilayers för användning för att förstå molekylära interaktioner. Här kommer metoder för att uppnå båda typerna av bilayermodeller att presenteras. För cell som efterliknar multi-lipid bilayers bestäms den önskade lipidkompositionen först via lipidextraktion från primära celler eller cellinjer följt av flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS). Med hjälp av denna komposition tillverkas lipidblåsor med hjälp av en tunnfilmshydrerings- och extruderingsmetod och deras hydrodynamiska diameter och zetapotential kännetecknas. Stödda och suspenderade lipidbilayers kan sedan bildas med hjälp av kvartskristallmikrobalans med dissipationsövervakning (QCM-D) respektive på ett poröst membran för användning i en parallell artificiell membranpermeabilitetsanalys (PAMPA). De representativa resultaten belyser reproducerbarheten och mångsidigheten hos in vitro-cellmembranfettbiayermodeller. De metoder som presenteras kan bidra till snabb, lätt bedömning av interaktionsmekanismer, såsom permeation, adsorption och inbäddning, av olika molekyler och makromolekyler med ett cellmembran, vilket hjälper till att screening av läkemedelskandidater och förutsägelse av potentiell cellulär toxicitet.

Detta protokoll beskriver metoder för att bilda stödda och suspenderade lipidbilayers (figur 1). Det första steget för att bilda en stödd lipidbilayer är att utveckla lipidblåsor. Mini extrudern gör det möjligt att förbereda små volymer lipidblåsor (1 ml eller mindre), medan den stora extrudern gör det möjligt att förbereda 5-50 ml lipidblåsor i en sats. Storleksfördelningar av uni-lipid vesiklar som bildas av antingen mini eller stor extruder visas i fi...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Detta protokoll beskriver bildandet av cell härma uni-lipid och multi-lipid vesicles, stöds lipid bilayers och suspenderade lipid bilayers. Dessa in vitro-modeller kan anpassas för att införliva en mängd olika lipidtyper och kan användas för att undersöka olika interaktioner mellan molekyler och makromolekyler.

Montering av cellimitering stöds och suspenderade lipid bilayer modeller för studie av molekylära interaktioner

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Konstruktionen av lipidbilayermembran som beskrivs i detta protokoll kan användas för att få viktig information om membraninteraktioner med farmaceutiska medel, miljögifter och till och med biologiska föreningar. Dessa tekniker kan användas för att tillverka membran av varierande flytande komplexitet, och för att bedöma sammansatta permeabilitet, absorption och inbäddning i membran. Till att börja med, tillsätt lämplig volym av lipidbuljonglösning i ett rent glas avsky för att uppnå en slutlig blåsor koncentration på 2,5 milligram per milliliter efter rehydrering.Ta bort kloroform från lipidlösning med hjälp av en ström av kvävegas. För att säkerställa fullständig borttagning av kloroform, anslut den torkade lipidfilmen till vakuumet i minst fyra timmar. Rehydrera den torkade lipidfilmen med en erforderlig volym Tris natriumkloridbuffert för att ge den slutliga blåsorrationens koncentration på 2,5 milligram per milliliter och virvel i cirka 15 till 30 sekunder.Överför blåsbandsupphängningen till en behållare med torr is tills den är frusen i cirka 30 minuter. När provet är helt fruset, tina suspensionen i ett 30 till 40 grader Celsius vattenbad. Virvel den tinade vesikel suspensionen.För att göra en milliliter eller mindre av blåsor, skaffa en mini extruder. Förpa ett filterstöd med ultrarent vatten och placera det sedan på membranstödytan inuti O-ringen. Upprepa för det andra inre membranstödet.Placera ett internt membranstöd i extruderns yttre hölje. Placera ett 100 nanometer polykarbonatmembran på det inre membranstödet direkt över filterstödet. Placera det andra inre membranstödet i extruderns yttre hölje med O-ringen och filterstödsidan vänd mot polykarbonatmembranet.Fäst polytetrafluoretylenlagret i fästknuten och skruva fast det med extruderns yttre hölje. Fäst extrudern i värmeblocket. Ladda lipidblåsanhängningen i en av sprutorna och placera sprutan i extrudervärmeblocket och för in nålen helt i ena änden av extrudern.För in den andra tomma sprutan på motsatt sida och lås båda sprutorna med hjälp av armklämmorna på värmeblocket. Tryck långsamt in vesikelsuspensionen i den tomma sprutan och sätt sedan tillbaka i den ursprungliga sprutan. Upprepa ytterligare 20 gånger i totalt 21 passerar genom polykarbonatmembranet.Överför lipidblåsorna till ett rent glas vidr för förvaring. För att extrudera fem till 50 milliliter blåsor, montera den stora extrudern genom att placera det stora hålskärmsstödet, den centrerade skivan, dräneringsskivorna och polykarbonatmembranet i utrymmet i extruderns nedre stöd. Anslut extruderns övre och nedre stöd med de fyra skruvarna och dra åt.Fäst extruderenheten på provcylindern genom att skrubba den i botten och dra åt med en skiftnyckel för att säkra. Fyll provcylindern med ultrapurvatten och extrudera vattnet genom extruderenheten innan provet tillsätts i provcylindern. Tillsätt lipidblåseupphängningen i provcylindern och skruva fast toppen.Öka långsamt trycket tills provet börjar droppa från extruderenheten med en hastighet av cirka två till tre droppar per sekund i ett rent glas avskyvärt. När allt prov har extruderats stänger du av kvävetillförseln och släpper ut trycket i provcylindern genom att långsamt öppna tryckavlastningsventilen. Häll tillbaka lipidblåsorna i provcylindern och upprepa föregående steg nio gånger till för totalt 10 profiler.Ladda vesikelfjädringen i lämplig cuvette och sätt in i det dynamiska ljusspridningsinstrumentet, mata in provinformationen och utför mätningen med hjälp av tillhörande programvara. Placera zetacellen i provkammaren, se till att elektroderna är i kontakt och stäng provhållarens lock. I den tillhörande programvaran matar du in exempelinformationen och samlar in mätningar.Sätt in den kiselkodade kvartskristallsensorn i flödesmodulen, se till att T-formen på kristallen överensstämmer med T-formen på modulen och skruva fast flödesmodulen. I instrument med flera kammare kan ytterligare bilayers bildas parallellt. Anslut inlopps- och utloppsslangarna till flödesmodulen och pumpen.Placera slangen i hållskydden och stäng locket på analyssystemet. Placera en avfallsbehållare vid pumpens utlopp för att samla in förbrukade lösningar. För att utföra rengöringen, slå först på pumpen och ställ in flödeshastigheten på 400 mikroliter per minut.För inloppsslangen i ultrarent vatten och flöda fem till 10 milliliter genom modulen. Byt slangar till SDS och flöda fem till tio milliliter genom modulen. Byt tillbaka slangen till ultrarent vatten och flöda 10 till 20 milliliter genom modulen.Slutligen strömmar du luft genom modulen tills ingen återstående lösning har samlats in. Ta bort sensorn från flödesmodulen och skölj sensorn med ultrarent vatten. Driv sensorn och flödesmodulen med en kvävegasström och se till att elektroden alltid förblir fri från vätska.Sätt in den kiselbelagda kvartskristallsensorn i ett ultraviolett eller ozonreningsinstrument i en kemisk rökhuv. Slå på instrumentet och låt behandlingen i minst två minuter. Ta försiktigt bort sensorerna och sätt tillbaka dem i flödesmodulen.Slå på analysinstrumentet för att ansluta den tillhörande programvaran och ställa in temperaturen till önskat värde för att bilda den stödjande lipidbilayer. Låt temperaturen stabiliseras vid önskad ingång. Konfigurera mätningen och hitta alla sensorresonansfrekvenser och avledning för övertoner tre, fem, sju, nio, 11 och 13 innan mätningen påbörjas.Låt Tris natriumklorid flöda genom modulen i fem till tio minuter, vilket säkerställer att baslinjefrekvensförändringen eller Delta F och avledningsförändringen eller Delta D-värdena i vätska förblir stabila. Stoppa pumpen, ta bort inloppsslangarna från Tris natriumkloridlösning och sätt försiktigt in den i lipidblåslösningen. Återflöde i fem sekunder för att avlägsna eventuella luftbubblor från inloppsslangen och fortsätt sedan det främre flödet.Starta om mätningen i programvaran för att nollställa baslinjen. Flöde lipidblåsor tills bilayerbildning observeras i realtid i dataförvärvsprogramvaran. Upprepa sedan detta steg för att ändra inloppsslangen från lipidblåsor tillbaka till Tris natriumkloridbuffert.Tillsätt fem mikroliter av lipidlösningen till givarfacket, som är en porös polyvinylidendifluorid 96 väl flerskärmsfilterplatta med 0,45 mikrometer porstorlek. Sänk omedelbart ner filterplattan i acceptorfacket, som är en transportmotsplatta som innehåller 300 mikroliter fosfatbuffrad koksaltlösning. Tillsätt 200 mikroliter fosfatbuffrad saltlösning till transportgivarfacket.Följ tidigare steg för att stoppa pumpen och ändra inloppsslangen till lipidblåselösning och observera bilayerbildning och ändra sedan inloppsslangen till alfa-spiral- eller AH-peptidlösningen. Introducera lösningen i flödesmodulen tills frekvensförändring och avledningsändring observeras från det nya lösningstillägget. Stoppa pumpen och låt AH-peptiden inkubera med blåsorna i 10 minuter.Byt inloppsslangen till Tris natriumklorid och starta flödet för att ta bort AH-peptiden från de brusten blåsorna, vilket leder till framgångsrik bildning av en lipidbilayer. Först flöda molekyllösningslösningsmedlet, byt sedan inloppsslangen till lösningen som innehåller molekylen av intresse och flöde i minst fem minuter. Om så önskas, stoppa flödet och låt vätskan som innehåller den önskade molekylen inkubera med bilayer.Byt tillbaka inloppsslangarna till molekylens lösningsmedel ensam. Flöda i minst fem minuter, byt sedan inloppsslangen till Tris natriumklorid och flöda i minst fem minuter. Stoppa mätningen i programvaran, spara filen och stoppa pumpen.Omedelbart efter tidigare steg för en en lipid suspenderad bilayer eller för en multi-lipid suspenderad bilayer, ta bort PBS från givaren filterplåtfacket och ersätt med 200 mikroliter av testlösningen. Doppa omedelbart i en ny transportmottagareplatta med 300 mikroliter PBS. Efter inkubation med mild gungning i två timmar vid 25 grader Celsius, samla 150 mikroliter av lösningen från givaren och acceptorfacken.Mät molekylkoncentrationen i båda proverna med hjälp av en lämplig metod baserad på egenskaperna hos denna molekyl. Storlek, polydispersibilitet och Zeta potential av Uni-lipid ägg PC blåsor och två multi lipid vesikel kompositioner jämfördes. Storleksfördelningen av ägg PC vesiklar och multi lipid en blåsor var nästan identiska.Både ägg och PC multi-lipid en blåsor var negativt laddade, medan multi-lipid två blåsor var positivt laddade. Uni-lipid ägg PC vesiklar absorberas lätt till ytan, vilket framgår av minskningen av frekvensförändringen, och ökning av avledningsförändring, följt av spontan bristning. Multi-lipid vesiklar absorberas till ytan, men kräver tillsats av AH peptid för att spränga blåsorna, vilket resulterar i lipidbilayer bildas.Med stöd lipidbilayers kan frekvensförändring och dissipation förändring analyseras före och efter introduktion av en förening av intresse. Till exempel undersöktes interaktioner mellan DEHP och miljötoxiskt med stödd uni och flerskiktade av lager. Liknande nivåer av DEHP absorption observerades för båda lipid bilayer typer.Skillnader i dissipation förändring observerades dock mellan bilayers med en större dissipation förändring sett för ägg PC bilayer jämfört med multi lipid en bilayer. Liten permeation observerades för både uni-och multi-lipid en bilayers. Efter denna procedur kan en mängd olika celler som efterliknar lipidbilayers utvecklas för att möjliggöra cellfri screening av molekylära interaktioner med föreningar som sträcker sig från läkemedel till miljögifter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Syntes, församling, och karakterisering av monolager skyddade guld nanopartiklar Films för protein monolager Elektrokemi

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Vidhäftning Frekvens analys för In Situ Kinetik Analys av Cross-Junktional Molekylär växelverkan vid cell-cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helical Organisation av koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorör

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Beredning av Mica stöds lipidbiskikten för högupplöst optisk mikroskopi Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatiserad lipidbiskiktmembranet bildning med användning av en Polydimetylsiloxan Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning och montering av 3D mikrokärl

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...