Name: assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Bu materyal, A.S.'ye verilen 1942418 No.'luk Hibe kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışmalara ve C.M.B.H.'ye verilen Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu'na, 1644760 No. Hibesi kapsamında dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Yazarlar, lipid vesicle karakterizasyon veri toplama için Dr. Noel Vera-González'e teşekkür ediyor. Yazarlar, Zetasizer'ını kullandığı için Profesör Robert Hurt'a (Brown Üniversitesi) teşekkür eder. Yazarlar, Brown Üniversitesi Kütle Spektrometresi Tesisi'ne, özellikle de Lipid bileşiminin ölçülmesine yardımcı olduğu için Dr. Tun-Li Shen'e teşekkür ediyor.

1. Tek lipid veziklinlerin geliştirilmesi
<ol><li>İnce film hidrasyon yöntemi<ol>
<li>Lipid stok çözeltilerinin hazırlanması ve depolanmasının NOT: Kloroform kullanan tüm adımların kimyasal duman kaputunda gerçekleştirilmesi gerekir. Kloroform her zaman solvent güvenli karbon fiber pipet uçları kullanılarak pipetlenmelidir. Kloroform içeren çözeltiler her zaman cam şişelerde saklanmalıdır.<ol>
<li>Lipit tozunu içeren şişeye uygun kloroform hacmini ekleyerek 10 mg/mL lipit stok çözeltisi...

Bu protokol lipid veziklinlerin, desteklenen lipid bilayerlerin ve askıya alınmış lipid bilayerlerinin oluşumuna izin verir. Burada, bu yapıların her birini oluşturmak için kritik adımlar sunulmaktadır. Lipid veziklin oluştururken, lipit geçiş sıcaklığının üzerinde ekstrüzyonyapmak önemlidir 39. Geçiş sıcaklığının altında olduğunda, lipit fiziksel olarak sipariş edilen jel faz39'dabulunur. Bu sıralı fazda hidrokarbon lipid kuyrukları tamam...

Öncelikle fosfolipidler, kolesterol ve proteinlerden oluşan hücre zarı, tüm canlı hücrelerin önemli bir bileşenidir1. Lipid amfifililiği tarafından yönlendirilen organizasyon ile hücre zarı koruyucu bir bariyer görevi görerek hücrenin çevresindeki çevre ile nasıl etkileşime girdiğini düzenler2. Birkaç hücresel işlem, membranın lipid ve protein bileşimine bağlıdır1,2. Örneğin, hücre zarı etkileşimleri etkili ilaç dağıtımı için önemlidir3. farmasötikler, biyolojikler, nanomalzemeler, biyolojik toksinler ve çevresel toksikler bir hücre zarının bütünlüğünü etkileyebilir, böylece hücresel fonksiyonu etkileyebilir4. Hücre zarlarının lipid bileşimine dayanan in vitro hücre taklit membran modellerinin yapımı, bu malzemelerin hücreler üzerindeki potansiyel etkisinin incelenmesini büyük ölçüde geliştirmek için facile araçları sağlama potansiyeline sahiptir.
Model lipid bilayerler lipid vesicles, desteklenen lipid bilayers ve askı lipid bilayers içerir. Desteklenen lipid bilayerler, desteklenen bir substrat malzemesinde lipid veziküllerinin yırtıldığı biyoteknoloji uygulamalarında yaygın olarak kullanılan fosfolipid hücre zarının bir modelidir5,6,7,8,9. Bilayer oluşumunu izlemek için kullanılan yaygın bir teknik, veziküllerin adsorpsiyonunu yerinde8 , 10 , 11 ,12 ,13,14'ekıyasla inceleyen dağılım izleme (QCM-D) ile kuvars kristal mikro dengedir. . Daha önce, QCM-D, akış koşullarında, yüzeyde fosfatidikolin (PC) lipid veziklinlerinin kritik bir veziklin kapsamı elde edildikten sonra, kendiliğinden sert lipid bilayerlere15. Önceki çalışma ayrıca, değişen lipid bileşimleri 16 , lipid proteinlerinin dahili17,18,19ve polimer yastıklar kullanılarakdesteklenenlipid çift katmanlı oluşumu araştırmıştır20, hücre zarı fonksiyonunun çeşitli yönlerini taklit edebilen desteklenen lipid bilayerleri verir.
Lipid bilayerler fosfolipid, kolesterol ve glikolipid bileşenlerini değiştirerek mitokondrion, kırmızı kan hücresi ve karaciğer hücresi zarları dahil olmak üzere alt hücreselden organ seviyelerine kadar çeşitli biyolojik bariyerleri taklit etmek için kullanılmıştır21. Bu daha karmaşık multi-lipid veziklinler, lipit bileşimine bağlı olarak veziklin yırtılması için ek yöntemler gerektirebilir. Örneğin, önceki çalışmalar, adsorbe lipid veziklin22,23'üistikrarsızlaştırarak bilayer oluşumunu teşvik etmek için hepatit C virüsünün yapısal olmayan proteini 5A'dan elde edilen α-helikal (AH) peptit kullanmıştır. Bu AH peptidi kullanılarak, plasental hücreleri taklit eden desteklenen lipid bilayerler daha önceoluşturulmuştur 24. Biyomedikal uygulamalar için desteklenen lipid bilayerlerin büyük potansiyeli moleküler ve nanopartikül taşımacılığı25 , 26, çevresel toksikan etkileşimleri 27,protein montajı ve fonksiyonu17,18,19,peptit düzenlemesi ve yerleştirilmesi 28 ,29,ilaç tarama30ve mikroakışkan platformlar31'ikapsayan araştırmalarla gösterilmiştir.
Askıya alınmış lipid bilayers, bir lipid bilayer'in gözenekli bir hidrofobik kesici uç 32,33 ,34,35boyunca askıya alındığı paralel bir yapay membran geçirgenliği test (PAMPA) aracılığıyla farmasötik tarama çalışmaları için kullanılmıştır. PAMPA lipid modelleri kan-beyin, bukal, bağırsak ve transdermal arayüzler de dahil olmak üzere farklı biyolojik arayüzler için geliştirilmiştir36. Hem desteklenen lipid bilayer hem de PAMPA tekniklerinin birleştirilmesiyle, istenen bir doku veya hücre tipinin lipit bileşenleri içindeki bileşiklerin adsorpsiyonu, geçirgenliği ve gömülmesi iyice incelenebilir.
Bu protokol, çeşitli moleküler etkileşimleri araştırmak için in vitro hücre zarı lipid bilayer modellerinin imalatını ve uygulanmasını açıklar. Hem tek lipid hem de multi-lipid destekli ve askıda lipid bilayerlerinin hazırlanması ayrıntılı olarak sağlanmıştır. Desteklenen bir lipid bilayer oluşturmak için, lipid vezikülleri ilk olarak ince film hidrasyon ve ekstrüzyon yöntemleri ve ardından fizikokimyasal karakterizasyon kullanılarak geliştirilmiştir. PAMPA'da kullanılmak üzere askıya alınmış lipid membranlarının QCM-D izlemesi ve imalatı kullanılarak desteklenen bir lipid bilayer oluşumu tartışılmaktadır. Son olarak, membranları taklit eden daha karmaşık hücre gelişimi için multi-lipid vesicles incelenir. Her iki tip fabrikasyon lipid zarını kullanarak, bu protokol bu aracın moleküler etkileşimleri incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu teknik yüksek tekrarlanabilirlik ve çok yönlülük ile hücre taklit lipid bilayers oluşturur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine&#160; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&#916;9-Cis) PC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (&#916;9-Cis) PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>890703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Loc syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>W224605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-821-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire</td>
			<td>Waters</td>
			<td>&#160;186002551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67.758.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>36735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSAC472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports, 10 mm</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded capillary zeta cell</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiposoFast &#174; LF-50</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337 - 4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder set with holder/heating block</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45&#160;&#181;m, clear, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAIPS4510</td>
			<td>for PAMPA studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas, ultrapure</td>
			<td>TechAir</td>
			<td>NI T5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td>Size for mini extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS), 10x</td>
			<td>Genesee Scienfitic</td>
			<td>25-507X</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsoft 401 software</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>986561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Dioxide, thin QSensors</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACS5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Safe pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>LSACT1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>TRL01-6X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman drain disc, 25 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>230600</td>
			<td>Size for large extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZS90</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer 7.01 software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly of cell mimicking supported and suspended lipid bilayer models for the study of molecular interactions

Model hücre zarları erken ilaç keşfinden toksisite çalışmalarına kadar birçok uygulama ile faydalı bir tarama aracıdır. Hücre zarı, tüm hücre tipleri için çok önemli bir koruyucu bariyerdir ve iç hücresel bileşenleri hücre dışı ortamdan ayırır. Bu membranlar büyük ölçüde çeşitli proteinler ve kolesterol ile birlikte dış hidrofilik kafa grupları ve iç hidrofobik kuyruk gruplarını içeren bir lipid bilayerden oluşur. Lipitlerin bileşimi ve yapısı, hücreler ve farmasötik, biyolojik toksinler ve çevresel toksik ediciler içerebilecek hücresel mikroçevrici arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere biyolojik işlevin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bu çalışmada lipid bilayerlerini taklit eden tek lipid ve multi-lipid destekli ve askıda hücre formüle etme yöntemleri açıklanmıştır. Daha önce, moleküler etkileşimleri anlamak için tek lipid fosfatidiylcholine (PC) lipid bilayerlerin yanı sıra multi-lipid plasental trophoblast esintili lipid bilayerler geliştirilmiştir. Burada her iki tip bilayer modeline ulaşma yöntemleri sunulacaktır. Hücre taklit eden multi-lipid bilayerler için, istenen lipid bileşimi ilk olarak birincil hücrelerden veya hücre çizgilerinden lipid ekstraksiyonu ve ardından sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile belirlenir. Bu bileşim kullanılarak lipid vesikülleri ince film hidrasyon ve ekstrüzyon yöntemi kullanılarak imal edilir ve hidrodinamik çapı ve zeta potansiyeli karakterize edilir. Desteklenen ve askıya alınan lipid bilayerler daha sonra sırasıyla, dağılım izleme (QCM-D) ile kuvars kristal mikro denge kullanılarak ve paralel bir yapay membran geçirgenlik testinde (PAMPA) kullanılmak üzere gözenekli bir membran üzerinde oluşturulabilir. Temsili sonuçlar in vitro hücreli membran lipid bilayer modellerinin tekrarlanabilirliğini ve çok yönlülüğünü vurgulamaktadır. Sunulan yöntemler, çeşitli moleküllerin ve makromoleküllerin hücre zarı ile geçirgenliği, adsorpsiyonu ve gömmesi gibi etkileşim mekanizmalarının hızlı ve facile değerlendirilmesine yardımcı olabilir, ilaç adaylarının taranmasında ve potansiyel hücresel toksisitenin tahmin edilmesine yardımcı olabilir.

Bu protokolde desteklenen ve askıya alınmış lipid bilayerleri oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır (Şekil 1). Desteklenen bir lipid bilayer oluşturmanın ilk adımı lipid veziklin geliştirmektir. Mini ekstrüder, küçük hacimlerde lipid veziklin hazırlanmasına (1 mL veya daha az) izin verirken, büyük ekstrüder 5-50 mL lipid veziklin tek bir parti halinde hazırlanmasını sağlar. Mini veya büyük ekstrüder tarafından oluşturulan tek lipid veziklin...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions at JoVE.com

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Bu protokolde açıklanan lipid bilayer membranlarının yapımı, membranların farmasötik ajanlar, çevresel toksik maddeler ve hatta biyolojik bileşiklerle etkileşimleri hakkında önemli bilgiler elde etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, değişen sıvı karmaşıklığındaki membranları imal etmek ve membranların içine bileşik geçirgenliği, emilimi ve gömmeyi değerlendirmek için kullanılabilir. Başlamak için, rehidrasyondan sonra mililitre başına 2,5 miligramlık son bir vezikül konsantrasyonu elde etmek için uygun hacimde lipid stok çözeltisini temiz bir cam aşağılığa ekleyin.Azot gazı akışı kullanarak lipid çözeltisinden kloroformu çıkarın. Kloroformun tamamen çıkarılmasını sağlamak için kurutulmuş lipit filmini en az dört saat boyunca vakuma bağlayın. Mililitre başına 2,5 miligramlık son veziklin konsantrasyonu ve yaklaşık 15 ila 30 saniye boyunca girdap elde etmek için kurutulmuş lipid filmini gerekli miktarda Tris sodyum klorür tamponu ile yeniden sulandırın.Vezikli süspansiyonu yaklaşık 30 dakika donana kadar kuru buzlu bir kaba aktarın. Numune tamamen dondurulduktan sonra, süspansiyonu 30 ila 40 santigrat derecelik bir su banyosunda çözün. Çözülmüş veziklin süspansiyonu girdap.Bir mililitre veya daha az vezne yapmak için mini bir ekstrüder elde edin. Bir filtre desteğini ultra saf suyla önceden ıslatın, ardından O halkasının içindeki membran destek yüzeyi üzerine yerleştirin. İkinci iç membran desteği için tekrarlayın.Ekstrüder dış kasasına bir iç membran desteği yerleştirin. Bir adet 100 nanometre polikarbonat membranın doğrudan filtre desteğinin üzerine iç membran desteğine yerleştirin. İkinci iç membran desteğini, polikarbonat membrana bakan O halkası ve filtre destek tarafı ile ekstrüder dış kasaya yerleştirin.Politetrafloroetilen rulmanı tutucu düğümüne takın ve ekstrüder dış kasa ile kapatarak vidalayın. Ekstrüderi ısıtma bloğuna kırpın. Lipid vesicle süspansiyonunu şırıngalardan birine yükleyin ve şırıngayı ekstrüder ısı bloğuna yerleştirin ve iğneyi ekstrüderin bir ucuna tam olarak yerleştirin.İkinci boş şırınnayı karşı tarafa yerleştirin ve ısı bloğundaki kol klipslerini kullanarak her iki şırınnayı da kilitleyin. Veziklin süspansiyonu yavaşça boş şırıngama ve ardından orijinal şırıngama geri itin. Polikarbonat membrandan toplam 21 geçiş için 20 kez daha tekrarlayın.Lipid veziküllerini depolama için temiz bir cam aşağılık içine aktarın. Beş ila 50 mililitre veziklin ekstrüde etmek için, büyük delikli ekran desteğini, ortalanmış diski, drenaj disklerini ve polikarbonat membranını ekstrüder alt desteğindeki boşluğa yerleştirerek büyük ekstrüderi monte edin. Dört vidayı kullanarak ekstrüder üst ve alt desteklerini bağlayın ve sıkın.Ekstrüder ünitesini tabana ovarak ve sabitlemek için bir anahtarla sıkarak numune silindirine takın. Numune silindirini ultra saf suyla doldurun ve numuneyi numune silindirine eklemeden önce suyu ekstrüder ünitesinden geçirin. Lipid vesicle süspansiyonu numune silindirine ekleyin ve üstünü kapalı vidaleyin.Numune ekstrüder ünitesinden temiz bir cam aşağılık içine saniyede yaklaşık iki ila üç damla oranında damlamaya başlayana kadar basıncı yavaşça artırın. Tüm numune ekstrüde edildikten sonra, azot kaynağını kapatın ve basınç tahliye vanasını yavaşça açarak numune silindirindeki basıncı serbest bırakın. Lipid vesicles'ı örnek silindire geri dökün ve toplam 10 ekstrüzyon için önceki adımı dokuz kez daha tekrarlayın.Veziklin süspansiyonu uygun cuvette içine yükleyin ve dinamik ışık saçılma aletine takın, numune ayrıntılarını girin ve ilgili yazılımı kullanarak ölçümü gerçekleştirin. Zeta hücresini numune odasına yerleştirin, elektrotların temas etmesini sağlayın ve numune tutucu kapağını kapatın. İlişkili yazılımda, örnek ayrıntıları girin ve ölçümleri toplayın.Silika kodlu kuvars kristal sensörini akış modülüne yerleştirin, kristal üzerindeki T şeklinin modüldeki T şekliyle hizalanmasını sağlayın ve akış modülini vidalayın. Birden fazla hazneli enstrümanlarda, paralel olarak ek iki katmanlı oluşturulabilir. Giriş ve çıkış borularını akış modülüne ve pompaya bağlayın.Boruyu tutma korumalarına yerleştirin ve analizör sisteminin kapağını kapatın. Harcanan çözeltileri toplamak için pompanın çıkışına bir atık konteyneri yerleştirin. Temizliği yapmak için önce pompayı açın ve akış hızını dakikada 400 mikrolitreye ayarlayın.Giriş borularını ultra saf suya yerleştirin ve modülden beş ila 10 mililitre akar. Boruyu SDS'ye geçirin ve modülden beş ila 10 mililitre akın. Boruyu tekrar ultra saf suya geçirin ve modülden 10 ila 20 mililitre akış.Son olarak, kalan bir çözelti toplanmadan modülün içinden hava akışı. Sensörü akış modülünden çıkarın ve sensörü ultra saf suyla durulayın. Sensörü ve akış modülünü azot gazı akışıyla sürün ve elektronun her zaman herhangi bir sıvı içermemesini sağlamak.Kimyasal duman kaputunda, silika kaplı kuvars kristal sensörunu ultraviyole veya ozon temizleme cihazına yerleştirin. Cihazı açın ve en az iki dakika tedaviye izin verin. Sensörleri dikkatlice çıkarın ve akış modülüne geri döndürün.İlişkili yazılımı bağlamak ve sıcaklığı destekleyici lipid bilayer oluşturmak için istenen değere ayarlamak için analizör aracını açın. Sıcaklığın istenen girişe sabitlenmesine izin verin. Ölçümü yapılandırın ve ölçüme başlamadan önce tüm sensör rezonans frekanslarını ve üç, beş, yedi, dokuz, 11 ve 13'ün aşırı tonları için dağılmasını bulun.Tris sodyum klorürün modülden beş ila 10 dakika akmasına izin vererek taban frekansı değişiminin veya Delta F ve dağılım değişiminin veya sıvıdaki Delta D değerlerinin sabit kalmasını sağlayın. Pompayı durdurun, giriş borularını Tris sodyum klorür çözeltisinden çıkarın ve lipid veziklin çözeltisine dikkatlice yerleştirin. Giriş tüpünden herhangi bir hava kabarcığını çıkarmak için beş saniye boyunca geri akış ve ardından ileri akışa devam edin.Temel sıfırlamak için yazılımdaki ölçümü yeniden başlatın. Veri toplama yazılımında bilayer oluşumu gerçek zamanlı olarak gözlenene kadar lipid vesikles akışı. Daha sonra lipid veziklin giriş borularını Tris sodyum klorür tamponu olarak değiştirmek için bu adımı tekrarlayın.0,45 mikro metre gözenek boyutuna sahip gözenekli polivinylidene difluorid 96 kuyulu çok ekranlı filtre plakası olan donör bölmesine lipid çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Filtre plakasını hemen 300 mikrolitre fosfat tamponlu salin içeren bir taşıma alıcı plakası olan alıcı bölmesine batırın. Taşıma donör bölmesine 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin.Pompayı durdurma ve giriş borularını lipid veziklit çözeltisine dönüştürme ve bilayer oluşumunu gözlemlemenin önceki adımlarını izleyin, ardından giriş borularını alfa sarmal veya AH peptit çözeltisine değiştirin. Yeni çözelti ilavesinden frekans değişimi ve dağılma değişimi gözlenene kadar çözeltiyi akış modülüne sokun. Pompayı durdurun ve AH peptidinin veziklilerle 10 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin.Giriş borularını Tris sodyum klorüre geçirin ve AH peptidi yırtılmış veziklikten çıkarmak için akışı başlatın ve bu da bir lipid bilayerinin başarılı bir şekilde oluşmasına yol açtı. İlk olarak, molekül çözücüyü akışa alın, ardından giriş borularını en az beş dakika boyunca ilgi molekülü ve akış içeren çözeltiye geçirin. İstenirse, akışı durdurun ve istenen molekülü içeren sıvının ikili ile kuluçkaya yatmasına izin verin.Giriş borularını sadece molekül çözücüye değiştirin. En az beş dakika akın, ardından giriş borularını Tris sodyum klorüre geçirin ve en az beş dakika akar. Yazılımda ölçümü durdurun, dosyayı kaydedin ve pompayı durdurun.Tek lipid askıya alınmış bir bilayer veya çok lipid asılı bir bilayer için önceki adımları takip ederek, PBS'yi donör filtre plakası bölmesinden çıkarın ve test çözeltisinin 200 mikrolitresi ile değiştirin. Hemen 300 mikrolitre PBS ile yeni bir taşıma alıcı plakasına batırın. 25 santigrat derecede iki saat boyunca hafif sallanma ile inkübasyondan sonra, donör ve alıcı bölmelerinden çözeltinin 150 mikrolitresini toplayın.Bu molekülün özelliklerine göre uygun bir yöntem kullanarak her iki örnekteki molekül konsantrasyonu ölçülün. Uni-lipid yumurta PC veziklin büyüklüğü, polidispersiti ve Zeta potansiyeli ve iki multi lipid vesicle bileşimi karşılaştırıldı. Yumurta PC vezikülleri ve multi lipid bir veziküllerin boyut dağılımı neredeyse aynıydı.Hem yumurta hem de PC multi-lipid bir veziklin negatif olarak şarj edilirken, multi-lipid iki vesicles pozitif olarak şarj edildi. Tek lipid yumurta PC veziklinler, frekans değişiminin azalması ve dağılma değişimindeki artış ve ardından spontan yırtılma ile gösterildiği gibi yüzeye kolayca emilir. Yüzeye emilen çok lipidli veziklinler, ancak veziklinleri yırtmak için AH peptid eklenmesini gerektirir ve bu da lipid bilayer oluşumuna neden olan.Desteklenen lipid bilayerleri ile, ilgi çekici bir bileşik tanıtılmadan önce ve sonra frekans değişimi ve dağılma değişimi analiz edilebilir. Örneğin, DEHP ve çevresel toksik elementin desteklenen uni ile etkileşimleri ve katmanlar tarafından çok katmanlı olarak araştırılmıştır. Her iki lipid bilayer tipte de benzer deHP emilimi düzeyleri gözlendi.Bununla birlikte, yumurta PC bilayer için görülen daha büyük bir dağılım değişikliği olan bilayerler arasında çoklu lipid bir bilayer ile karşılaştırıldığında dağılım değişiminde farklılıklar gözlenmiştir. Hem tek hem de çok lipidli bir bilayer için az geçirgenlik gözlendi. Bu prosedürden sonra, farmasötiklerden çevresel toksik edicilere kadar çeşitli bileşiklerle moleküler etkileşimlerin hücreden arındırılmış olarak taranmasını sağlamak için çeşitli hücre taklit edici lipid bilayerleri geliştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Monolayer sentezi, Montaj ve Karakterizasyonu Protein Monolayer Elektrokimya Korumalı Altın Nanopartikül Filmler

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...