Isolevuglandiner har vært involvert i flere sykdommer, spesielt kardiovaskulær sykdom. Denne protokollen ble utviklet for å oppdage isolevuglandiner i vev med D11 alkalisk fosfatasefusjonsprotein og immunfluorescens. Nåværende metoder for deteksjon er dyre eller krever et sekundært antistoff for en E-tag.
Å finne et pålitelig sekundært antistoff er vanskelig, men denne protokollen fjerner det sekundære antistofftrinnet. Fordyp lysbildene av mus og humant parafin-innebygd vev i xylen tre ganger i fem minutter for å deparrafinisere vevet. For å rehydrere vevet, vask vevet to ganger med 95% etanol, etterfulgt av to vasker med 70% etanol og deretter to ganger med 50% etanol tilberedt i vann.
Vask lysbildene i trisbufret saltvann med 0,1 % mellom 20 tre ganger ved å fylle glideholderen med TBST. Kast deretter TBST. Plasser lysbildene i forvarmet natriumcitratbuffer og inkuber i en trykkoker satt til fire minutter på høyt trykk, for en total antigenhentingstid på 20 minutter.
På slutten av inkubasjonen, fjern lysbilder fra trykkkokeren og la dem avkjøles i 20 minutter ved romtemperatur. Gi tre raske vasker til lysbilder med TBST som demonstrert. Blokker lysbildene ved å legge til 2 % BSA oppløst i TBST.
Dekk lysbildene med parafintape og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Etter inkubering, kast blokkbufferen. Tilsett 200 mikroliter D11 alkalisk fosfatase tilberedt i TBST til lysbildene og dekk lysbildene med parafinbånd.
Etter å ha inkubert lysbildene i et fuktet kammer i tre timer ved romtemperatur, vask lysbildene tre ganger med TBST. Utvikle lysbildene med en kalorimetrisk alkalisk fosfataseutvikler for immunhistokjemi, eller en fluorescerende alkalisk fosfataseutvikler for immunfluorescens. Vask lysbilder én gang med TBST for å fjerne overflødig utvikler og forhindre videre fargeutvikling.
Motflekk lysbildene med ett mikrogram per milliliter HEX kjernefysisk flekk fremstilt i PBS for immunfluorescens. Vask deretter lysbildene én gang med TBST for å fjerne overflødig motflekk. Bruk monteringsmediet til å plassere dekselet på de utviklede lysbildene.
Observer lysbildene under et invertert lysmikroskop for immunhistokjemi, eller et konfokal fluorescerende mikroskop for immunfluorescens. Fire negative kontrolleksperimenter kan utføres for å bekrefte spesifisiteten til D11 AP-farging for isolevuglandin. I det første negative kontrolleksperimentet, inkuber vevet med D11 AP fortynnet i TBST, eller TBST alene.
Inkuber deretter vevet med fortynnet D11 AP og bakterielt pariplasmatisk ekstrakt fortynnet i TBST uten D11 AP-linkeren. For konkurranseanalysen, fremstill isoLG og isoLG adduktert til musserumalbumin i et molforhold på åtte til en. Fortynn D11 AP en til 10 i TBST.
Inkuber deretter den fortynnede D11 AP med 50 mikrogram per milliliter isolevuglandin-adduktert MSA, eller ikke-adduktert MSA i en time ved romtemperatur. Legg D11 AP med isolevuglandin MSA eller D11 AP med ikke-adduktert MSA til vev for farging. Bruk et relevant enkeltkjedefragmentvariabelt antistoff D20 for å farge vevet for det endelige negative kontrollsettet.
Immunfluorescens av aorta hos hypertensive og normotensive mus ble studert ved hjelp av denne protokollen. Farging med D11 AP indikerte en økt konsentrasjon av isoLG i aorta hos mus med angiotensin II-indusert hypertensjon sammenlignet med kontrollmusene. D11 AP ble brukt til å oppdage isolevuglandiner tilstede i tarmvevet hos humane pasienter med hypertensjon og normotensive mennesker.
Vevene fra pasientene med hypertensjon hadde forhøyede konsentrasjoner av isolevuglandiner. Vev ble farget med pariplasmatisk ekstrakt og uten D11 AP. Den lysere fargingen ble observert i vevet farget med D11 AP sammenlignet med det pariplasmatiske ekstraktfargede vevet, noe som bekreftet at fargingen ikke skyldtes den ikke-konjugerte bakterielle alkaliske fosfatasen som var tilstede i det pariplasmatiske ekstraktet. I den konkurrerende analysen viste vevet farget med D11 AP pre-inkubert med isoLG-konkurrenten redusert farging, lik fargingen observert i vev med D11 AP, som viser spesifisitet til D11 AP til isolevuglandiner.
I den negative kontrollen resulterte farging av museaorta med D11 AP i sterk farging sammenlignet med D20, noe som indikerer spesifisiteten til D11 AP til isolevuglandiner i den hypertensive aorta. Det er viktig å inaktivere enhver endogen alkalisk fosfatase som er tilstede i vev for å begrense bakgrunnsfarging.
