Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630058 إلى X.W. و 31772134 إلى WL).

1. تربية الحشرات غير المميتة
<ol><li>اجمع WBPHs من حقول الأرز والخلفية مع شتلات الأرز في أكواب زجاجية سعة 1 لتر مغطاة بشبكة مقاومة للحشرات في حاضنة عند 28 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة و 8 ساعات مظلمة. نظرا لأن SRBSDV لا ينتقل عن طريق البيض ، فإن الحوريات حديثة الفقس ليست خبيثة.</li>
	<li>باستخدام قلم فرشاة ، قم ?...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

للحصول على أفضل النتائج ، ينبغي النظر في بعض النقاط الرئيسية. أولا ، من الضروري وجود نسبة عالية من الحشرات الخبيثة بين إجمالي السكان. على الرغم من أن الحد الأدنى من AAP ل SRBSDV بواسطة حوريات WBPH والبالغين هو 5 دقائق17 ، يجب السماح للحشرات بالتغذي على نباتات الأرز الطازجة المصابة ب SRBS...

تنتقل معظم فيروسات النباتات الموصوفة عن طريق الحشرات من رتبة Hemiptera التي تشمل حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس1،2. تخترق أجزاء الفم الماصة للحشرات النصفية الأنسجة النباتية لتغذية وإفراز اللعاب ، وفي نفس الوقت تنقل الفيروسبكفاءة 2. تم وصف آليات انتقال مختلفة للفيروسات النباتية بواسطة الحشرات الناقلة للأمراض. وتشمل هذه غير الثابتة وشبه الثابتة والمستمرة. النوع الثابت إما غير تكاثري أو تكاثري 3,4 ، ولكن بالنسبة لكلا النوعين ، يجب أن يتحرك الفيروس المنقول في جميع أنحاء جسم الحشرة. في وضع التكاثر المستمر ، تصيب الفيروسات في البداية وتتكاثر في الخلايا الظهارية لأمعاء الحشرة ، ثم تنتشر في أنسجة مختلفة ، وفي النهاية إلى الغدد اللعابية ، حيث يمكن بعد ذلك إدخالها في النبات من خلال اللعاب أثناء تغذية الحشرات 5,6. تنتقل الفيروسات المنقولة باستمرار عبر أعضاء مختلفة وتتكاثر في نواقل الحشرات ، الأمر الذي يتطلب تفاعلات محددة بين الفيروس ومكونات الناقل في مراحل مختلفة 7,8.
يجب أن تتفاعل البروتينات الفيروسية وبروتينات الحشرات لتسهيل العمليات الحرجة للتعرف على الفيروسات أو العدوى أو التكاثر أو الانتشار في الحشرات الناقلة 9,10. على الرغم من أنه يمكن استخدام الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل الخلوية في الحشرات ، إلا أنه لا يمكن أن يظهر توزيع virion أو التوطين الخلوي أو التمركز المشترك للبروتينات الفيروسية وبروتين الحشرات أو البنية التحتية لأنسجة وخلايا الحشرات. تم إجراء وضع العلامات المناعية لأول مرة بواسطة Coons et al. في الخلايا البلعمية للفأر عن طريق تسمية أجسام مضادة فلوريسئين محددة ، والآن يتم استخدامه على نطاق واسع11. تعد تقنية التألق المناعي ، والمعروفة أيضا باسم تقنية الأجسام المضادة الفلورية ، واحدة من أقدم تقنيات وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها وتستند إلى تفاعل الربط المحدد بين المستضد والجسم المضاد11,12. يتم تمييز الجسم المضاد المعروف أولا بالفلوريسئين ، والذي يستخدم كمسبار للكشف عن المستضدات المقابلة في الخلايا أو الأنسجة13,14. بعد أن يرتبط الجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين بالمستضد المقابل في الخلايا أو الأنسجة ، سيصدر المسبار مضانا ساطعا عند تشعيعه بأطوال موجية للإثارة وعرضه باستخدام مجهر مضان لتحديد موقع المستضد15.
معظم الحشرات الناقلة للفيروسات النباتية هي hemipterans. يمكن أن تؤدي الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة التي تتمتع بكفاءة انتقال عالية لفيروس النبات إلى أوبئة الفيروس5. انتشر فيروس قزم الأرز الجنوبي الأسود (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، أحد أخطر مسببات الأمراض للأرز ، بسرعة في جميع أنحاء مناطق زراعة الأرز في شرق وجنوب شرق آسيا ، وتسبب في خسائر فادحة في الغلة منذ عام 201016,17. ينقل البالغون والحوريات من نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera Horváth) SRBSDV إلى الأرز بطريقة إكثارية مستمرة بكفاءة عالية. أظهرت الدراسات الميدانية أن تفشي مرض القزم الأسود المستحث ب SRBSDV يتزامن عادة مع الهجرة الجماعية لمسافات طويلة من WBPHs ، وهو عامل حاسم في أوبئة SRBSDV7،8،18. البروتين الغشائي المرتبط بالحويصلة 7 (VAMP7) هو مستقبل بروتين ارتباط عامل حساس للذوبان N-ethylmaleimide (SNARE) ، والذي يمكنه التوسط في نقل المواد عبر اندماج الحويصلة. يتفاعل VAMP7 مع بروتين القفيصة الرئيسي الخارجي ل SRBSDV في المختبر ، مما يشير إلى أن VAMP7 قد يكون مرتبطا ارتباطا وثيقا بانتقال الفيروس16.
في البروتوكول المقدم هنا ، قمنا باستئصال القناة الهضمية من WBPH الخبيث كمثال لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى16. كموقع غزو أولي للفيروس ، تلعب ظهارة الأمعاء الوسطى أدوارا حيوية في الإصابة بالفيروس وتكاثره وانتقاله. أولا ، قمنا بتفصيل خطوات استئصال القناة الهضمية من الحوريات والبالغين من WBPHs. ثانيا ، استخدمنا أجساما مضادة محددة تحمل علامة الفلوريسئين لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية المعوية. ثم لاحظنا الخلايا الظهارية والموقع الخلوي للفيروسات و VAMP7 عبر مجهر المسح بالليزر. أظهرت النتائج أن فيروسات SRBSDV و VAMP7 يمكن أن تتمركز في سيتوبلازم الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، مما يشير إلى أن الوظيفة المحددة ل VAMP7 قد تكون مرتبطة بنشر الفيروسات من الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

تنتقل معظم فيروسات النباتات في الطبيعة من نبات إلى آخر عن طريق الحشرات النصفية. تلعب الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة ذات الكفاءة العالية في انتقال الفيروس دورا رئيسيا في أوبئة الفيروسات في الحقول. يمكن لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والحشرات أن تعزز فهمنا لانتقال الفيروس والأوبئة بهدف تصميم استراتيجيات جديدة للسيطرة على فيروسات النباتات وحشراتها الناقلة لها. تم استخدام وضع العلامات المناعية على نطاق واسع لتحليل التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيفين ويستخدم هنا في نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera) ، الذي ينقل بكفاءة فيروس القزم الأسود المخطط للأرز الجنوبي (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، لتحديد موقع الفيروسات وبروتينات الحشرات في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر ، درسنا الخصائص المورفولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، والتوطين الخلوي لبروتينات الحشرات ، والتمركز المشترك للفيروسات وبروتين الحشرات. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنشطة الفيروس في الحشرات ، ووظائف بروتينات الحشرات ، والتفاعلات بين الفيروس والحشرة الناقلة.

يوضح الشكل 1 جميع الخطوات في هذا البروتوكول: تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، واستئصال الأمعاء ، ووضع العلامات المناعية ، وصنع الشريحة.
تم تثبيت أحشاء WBPH المستأصلة من البالغين في 4٪ (م / حجم) بارافورمالدهيد ، وتخلل مع 2٪ (v / v) Triton X-100 ، ثم حضنت مع Dylight 633 phalloidin<su...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

يمكن استخدام هذا البروتوكول الخاص بوضع العلامات المناعية لكل من بروتينات الفيروسات النباتية وبروتينات الحشرات الناقلة في أمعاء الحشرات المستأصلة لدراسة التفاعلات بين الحشرات الفيروسية والحشرات الناقلة ، ووظائف بروتين الحشرات والآليات الجزيئية الكامنة وراء انتقال الفيروس.

وضع العلامات المناعية للفيروسات النباتية وبروتينات ناقلات الحشرات في الأمعاء النصفية

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الحركات المختلفة في الحشرات ، ووظائف بروتينات الحشرات ، والتفاعلات بين الفيروس والحشرة الناقلة في الجسم الحي. هذه الطريقة فعالة وغنية بالمعلومات. يتم تصور هياكل أمعاء الحشرات والخلايا المساعدة بوضوح عند عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر.سيكون إظهار الإجراء لو تشانغ ، دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، انقل الحشرات غير الخبيثة من الأكواب الزجاجية إلى فيروس قزم أسود مخطط للأرز الجنوبي الطازج ، SRBSDV ، نباتات الأرز المصابة المغطاة بشبكة مقاومة للحشرات لفترة الوصول إلى اكتساب الفيروس لمدة يومين. ثم جمع الحشرات في أكواب زجاجية تحتوي على شتلات الأرز الطازجة.بعد يومين ، اجمع الحشرات من الأكواب الزجاجية باستخدام شفاط يدوي لتشريح واستئصال الأمعاء. قم بإعداد 0.01 مولار PBS و 4٪ بارافورمالدهايد و 2٪ Triton X-100 كما هو موضح في مخطوطة النص. استخدم جهاز سحب لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية ووضع الشريحة على مسرح المجهر الضوئي.استخدم الشافطة اليدوية لجمع البالغين المصابين ب SRBSDV من الكئوس الزجاجية ووضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر على الثلج لشل الحشرات. نقل شخص بالغ مشلول إلى 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على الشريحة مع البطن لأعلى. استخدم الملقط لتثبيت الجسم وإزالة الرأس بمجموعة أخرى من الملقط.باستخدام مجموعة واحدة من الملقط ، قم بتثبيت جانبي البطن وتثبيت ovipositor أو العضو التناسلي للذيل مع المجموعة الأخرى ، ثم اسحب بعناية الغشاء البيني لجزء واحد من البطن لفضح الأمعاء ببطء في البطن. استمر في تمزيق الغشاء واسحب الأمعاء بالكامل تدريجيا من البطن. اسحب الذيل المتصل بنهاية القناة الهضمية برفق لإزالة القناة الهضمية بالكامل.ضع الشجاعة المستأصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب واستخدم ماصة لغسل الشجاعة جيدا. استخدم جهاز سحب لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية ووضع الشريحة على مسرح المجهر الضوئي.استخدم الشافطة اليدوية لجمع الحوريات المصابة ب SRBSDV من أكواب زجاجية ووضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يوضع على الثلج لشل الحشرات. انقل حورية مشلولة إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت على الشريحة مع توجيه البطن لأعلى. افصل ذيل الحورية ، ثم قم بتثبيت جسم الحشرة لإصلاحه برفق واستخدم الزوج الآخر لتثبيت الرأس.اسحب الرأس برفق بعيدا عن الجسم مع الحفاظ على ارتباطه بالقناة الهضمية بحيث يتم فصل الرأس عن الجسم ، لكن القناة الهضمية لا تزال متصلة بالصدر والبطن. مع استمرار الملقط في تثبيت الجسم ، استخدم الزوج الآخر لتحريك الرأس بعناية وسحب القناة الهضمية تدريجيا. افصل القناة الهضمية عن الرأس للحصول على أمعاء سليمة دون الإضرار بالجسم.ضع الأحشاء المستأصلة في أنبوب. أضف برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب وامتصه برفق حرر المحلول باستخدام ماصة لغسل الأحشاء جيدا. تحضير الأجسام المضادة ووسط التركيب كما هو موضح في مخطوطة النص.ضع أحشاء WBPH المستأصلة حديثا والمغسولة في 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين ، استبدل محلول بارافورمالدهايد ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة PBS للتخلص من أي بارافورمالدهيد وكرر خطوة غسل PBS مرتين.بعد غسلتين من PBS ، أضف 200 ميكرولتر من المنظفات غير الأيونية Triton X-100 لاختراق العينات في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة Triton X-100 واغسل أي منظف متبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS. تمييع الأجسام المضادة المسمى واحد إلى 50 مع 50 ميكرولتر من ألبومين مصل الثور.أضف الأجسام المضادة المخففة إلى الأنبوب واحتضن العينات طوال الليل عند أربع درجات سلزية. في صباح اليوم التالي لإزالة الجسم المضاد ، اغسل مخفف الجسم المضاد المتبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. تمييع ميكرولتر واحد من DyLight 633-Phalloidin مع 50 ميكرولتر من PBS وإضافة 50 ميكرولتر من phalloidin المخفف إلى الأنبوب لمدة ساعتين الحضانة في درجة حرارة الغرفة.بعد إزالة phalloidin ، اغسل القضيب المتبقي جيدا بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS. ضع قطرة من وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على شريحة مجهر. انقل الأحشاء إلى الوسط وضع غطاء الزجاج برفق فوق العينة دون إنشاء فقاعات.أظهرت الصورة المجهرية التمثيلية للمسح بالليزر للأحشاء WBPH المستأصلة من البالغين بعد وضع العلامات باستخدام phalloidin ثلاثة أقسام: الأمعاء الأمامية والأمعاء الوسطى والأمعاء الخلفية. من بين هؤلاء ، الأمعاء الوسطى هي موقع العدوى الأولي ل SRBSDV. تسهل بنية الخلية الظهارية أحادية الطبقة للأمعاء دراسة التوطين الخلوي لبروتينات الحشرات والتوطين المشترك للبروتينات الفيروسية والحشرية.يتم عرض أحشاء WBPH المستأصلة مع DyLight 488 المسمى مضاد VAMP-7 و SRBSDV virions مع DyLight 549 المسمى بالجسم المضاد ل SRBSDV هنا. تبين أن فيروسات VAMP-7 و SRBSDV تتركز بشكل مشترك في السيتوبلازم مما يشير إلى أن VAMP-7 قد يلعب دورا في انتقال الفيروس في الجسم الحي. يجب تنظيف الأمعاء المتداخلة جيدا بعد الحضانة باستخدام الأجسام المضادة المترافقة لوسيفيرين لتقليل الخلفية والربط غير المحدد.هذه طريقة موثوقة لعرض توطين الفيروس ومسببات الأمراض الأخرى وبروتينات الحشرات في الحشرات. يوفر الأساس لمزيد من الدراسات حول العلاقة بين مسببات الأمراض والحشرات.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

التعبير عابرة والخلوية توطين البروتينات المؤتلف في الخلايا مثقف الحشرات

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

التلقيح الزراعي المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن مع فيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخات المعدية

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد اللعابية Drosophila

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...