Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31630058 til X.W. og 31772134 til W.L.).

1. Nonviruliferous insektopdræt
<ol><li>Saml WBPH'er fra rismarker og bagside med risplanter i 1 L glasbægre dækket med insektsikkert net i en inkubator ved 28 °C med 16 timers lys og 8 timers mørke. Fordi SRBSDV ikke overføres via æg, er nyklækkede nymfer ikke viruliferous.</li>
	<li>Med en børstepen børstes insekter forsigtigt fra bægerglasset, der opdrætter insekter, til et nyt bægerglas med friske risplanter hver uge, indtil WBPH-nymfer er klækket. Fortsæt med at opdrætte disse klækkede nonvirulife...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

For de bedste resultater bør et par nøglepunkter overvejes. For det første er et højt forhold mellem viruliferous insekter blandt den samlede befolkning nødvendig. Selvom den mindste AAP for SRBSDV af WBPH-nymfer og voksne er 5 min17, skal insekterne have lov til at fodre på friske SRBSDV-inficerede risplanter i 2 d for at opnå en erhvervelseseffektivitet på op til 80%. Da SRBSDV-virionerne kan påvises i 80% af midguts18, udskårne og mærkede vi de viruliferous in...

De mest beskrevne plantevira overføres af insekter fra rækkefølgen Hemiptera, der inkluderer bladlus, hvidfluer, løvhopper, plantehoppere og thrips 1,2. De piercing-sugende munddele af hemipteran insekter gennemborer plantevævet til fodring og udskillelse af spyt, samtidig med at virussen overføres effektivt2. Forskellige transmissionsmekanismer af plantevirus af vektorinsekter er blevet beskrevet. Disse omfatter ikke-vedvarende, semipersistente og vedvarende. Den persistente type er enten ikke-propagativ eller propagativ3,4, men for begge disse typer skal den overførte virus bevæge sig gennem insektets krop. I den vedvarende formeringstilstand inficerer vira oprindeligt og replikerer i epitelcellerne i insektets tarm, spredes derefter i forskellige væv og til sidst ind i spytkirtlerne, hvorfra de derefter kan indføres i en plante gennem spyt under insektfodring 5,6. Persistente overførte vira bevæger sig gennem forskellige organer og replikerer i deres insektvektorer, hvilket kræver specifikke interaktioner mellem virus- og vektorkomponenter på forskellige stadier 7,8.
Virale proteiner og insektproteiner skal interagere for at lette kritiske processer til virusgenkendelse, infektion, replikation eller spredning i vektorinsekterne 9,10. Selvom optisk mikroskopi kan bruges til at observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller colokalisering af virale proteiner og insektprotein eller ultrastrukturen af insektvæv og celler. Immunofluorescensmærkning blev først udført af Coons et al. i musens fagocytiske celler ved hjælp af mærkning af specifikke fluoresceinantistoffer, og nu bruges den bredt11. Immunofluorescensteknikken, også kendt som fluorescensantistofteknikken, er en af de tidligste immunologiske mærkningsteknikker, der er udviklet og er baseret på den specifikke bindingsreaktion mellem antigenet og antistoffet11,12. Det kendte antistof mærkes først med fluorescein, som bruges som sonde til at detektere de tilsvarende antigener i cellerne eller vævene13,14. Efter at det fluoresceinmærkede antistof binder til det tilsvarende antigen i celler eller væv, udsender sonden lys fluorescens, når den bestråles med excitationsbølgelængder og ses med et fluorescensmikroskop for at lokalisere antigenet15.
De fleste vektorinsekter af plantevirus er hemipteraner. En højere populationstæthed af vektorinsekter, der har en høj transmissionseffektivitet for plantevirussen, kan føre til virusepidemier5. Sydlig ris sort stribet dværgvirus (SRBSDV, slægt Fijivirus, familie Reoviridae), en af de mest alvorlige patogener af ris, har hurtigt spredt sig over risdyrkningsområder i Øst- og Sydøstasien og forårsaget alvorlige udbyttetab siden 201016,17. Voksne og nymfer af den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende-formidlende måde med høj effektivitet. Feltundersøgelser har vist, at udbrud af SRBSDV-induceret ris sort stribet dværgsygdom normalt falder sammen med massemigration over lange afstande af WBPH'er, en afgørende faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikelassocieret membranprotein 7 (VAMP7) er en opløselig N-ethylmaleimidfølsom faktorbindingsproteinreceptor (SNARE), som kan formidle transport af stoffer via vesikelfusion. VAMP7 interagerer med det ydre store capsidprotein i SRBSDV in vitro, hvilket indikerer, at VAMP7 kan være tæt forbundet med virusoverførsel16.
I protokollen, der præsenteres her, udskar vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midgut-epitelceller16. Som det første invasionssted for virus spiller midgutepitelet afgørende roller i virusinfektion, replikation og transmission. Først detaljerede vi trinene til at punktafgifter tarmen fra nymfer og voksne af WBPH'er. For det andet brugte vi specifikke fluoresceinmærkede antistoffer til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Derefter observerede vi epitelceller og den cellulære placering af virionerne og VAMP7 via et laserscanningskonfokalmikroskop. Resultaterne viste, at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne colokalisere i cytoplasmaet i midgut-epitelcellerne, hvilket tyder på, at VAMP7's specifikke funktion kan være relateret til spredning af virioner fra midgut-epitelceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en anden af hemipteran insekter. En høj populationstæthed af vektorinsekterne, der er yderst effektive til virusoverførsel, spiller en central rolle i virusepidemier på marker. Undersøgelse af virus-insektvektorinteraktioner kan fremme vores forståelse af virusoverførsel og epidemier med det formål at designe nye strategier til bekæmpelse af plantevira og deres vektorinsekter. Immunofluorescensmærkning er blevet brugt i vid udstrækning til at analysere interaktioner mellem patogener og værter og bruges her i den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører den sydlige ris sorte stribede dværgvirus (SRBSDV, slægten Fijivirus, familie Reoviridae), for at lokalisere virioner og insektproteiner i midgutepitelcellerne. Ved hjælp af laserscanningskonfokalmikroskopi studerede vi de morfologiske egenskaber ved midgutepitelceller, cellulær lokalisering af insektproteiner og colokalisering af virioner og et insektprotein. Denne protokol kan bruges til at studere virusaktiviteter i insekter, funktioner af insektproteiner og interaktioner mellem virus og vektorinsekt.

Figur 1 illustrerer alle trin i denne protokol: insektopdræt, virusopkøb, udskæring af tarmen, immunfluorescerende mærkning og fremstilling af diaset.
Udskårne WBPH-tarme fra voksne blev fikseret i 4% (m/v) paraformaldehyd, permeabiliseret med 2% (v/v) Triton X-100 og derefter inkuberet med Dylight 633 phalloidin10,18. Den laserscanningskonfokale mikrograf i figur 2 viser...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Denne protokol til immunfluorescerende mærkning af både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i udskårne insekttarme kan bruges til at studere interaktioner mellem virus- og vektorinsekter, insektproteinfunktioner og molekylære mekanismer, der ligger til grund for virusoverførsel.

Immunofluorescerende mærkning af plantevirus og insektvektorproteiner i hemipteran tarme

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Denne protokol kan bruges til at studere forskellige bevægelser i insekter, funktioner af insektproteiner og interaktioner mellem virus og vektorinsekt in vivo. Denne metode er effektiv og informativ. Strukturerne i insekttarmen og hjælpecellerne visualiseres tydeligt, når de ses med laserscanningskonfokalmikroskopi.Demonstration af proceduren vil være Lu Zhang, ph.d. fra vores laboratorium. Til at begynde med skal du overføre ikke-viruliferous insekter fra glasbægre til frisk sydlig ris sort stribet dværgvirus, SRBSDV, inficerede risplanter dækket med et insektsikkert net i en to-dages virusopkøbsadgangsperiode. Saml derefter insekterne i glasbægerglas, der indeholder friske risplanter.Efter to dage samles insekterne fra glasbægrene ved hjælp af en manuel aspirator til dissektion og udskæring af tarmen. Forbered 0,01 molær PBS, 4% paraformaldehyd og 2% Triton X-100 som beskrevet i tekstmanuskriptet. Brug en pipetter til at placere 100 mikroliter PBS på et glasglas og placere diaset på scenen i et optisk mikroskop.Brug manuel aspirator til at samle de SRBSDV-inficerede voksne fra glasbægrene og læg dem i et 1,5 ml rør på is for at lamme insekterne. Overfør en lammet voksen til de 100 mikroliter PBS på diaset med maven op. Brug pincet til at klemme kroppen og fjern hovedet med et andet sæt pincet.Med et sæt pincet skal du klemme siderne af maven og klemme ovipositoren eller det copulatoriske organ i halen med det andet sæt, og træk derefter forsigtigt den intersegmentale membran i et abdominalsegment for langsomt at udsætte tarmen i maven. Fortsæt med at rive membranen væk og træk gradvist hele tarmen ud af maven. Træk forsigtigt halen af, som er forbundet med enden af tarmen for at fjerne hele tarmen.Anbring udskårne tarme i et 200 mikroliter centrifugerør. Tilsæt 200 mikroliter PBS til røret og brug en pipette til grundigt at vaske tarmene. Brug en pipetter til at placere 100 mikroliter PBS på et glasglas og placere diaset på scenen i et optisk mikroskop.Brug manuel aspirator til at samle de SRBSDV-inficerede nymfer fra glasbægre og læg dem i 1,5 ml rør placeret på is for at lamme insekterne. Overfør en lammet nymfe til 100 mikroliter buffer på diaset med maven opad. Fjern nymfens hale, klem derefter insektlegemet for at fikse det forsigtigt og brug det andet par til at klemme hovedet.Træk forsigtigt hovedet væk fra kroppen, mens du stadig opretholder dets fastgørelse til tarmen, så hovedet løsnes fra kroppen, men tarmen stadig er fastgjort til brystkassen og maven. Når pincetten stadig klemmer kroppen, skal du bruge det andet par til at bevæge hovedet forsigtigt og gradvist trække tarmen ud. Fjern tarmen fra hovedet for at opnå en intakt tarm uden at beskadige kroppen.Anbring de udskårne tarme i et rør. Tilsæt PBS til røret og sug forsigtigt, slip opløsningen med en pipette for at vaske tarmene grundigt. Forbered antistofferne og monteringsmediet som beskrevet i tekstmanuskriptet.Anbring de nyligt udskårne og PBS-vaskede WBPH-tarme i 100 mikroliter 4% paraformaldehyd i et 200 mikroliter centrifugerør ved stuetemperatur. Efter to timer udskiftes paraformaldehydopløsningen med 200 mikroliter PBS. Efter 10 minutter fjernes PBS for at fjerne paraformaldehyd, og PBS-vasketrinnet gentages to gange.Efter to PBS-vaske tilsættes 200 mikroliter nonionisk vaskemiddel Triton X-100 for at permeabilisere prøverne ved stuetemperatur. Efter 30 minutter fjernes Triton X-100, og eventuelt resterende vaskemiddel vaskes væk med tre 10-minutters vaske med PBS. Fortynd de mærkede antistoffer en til 50 med 50 mikroliter tyreserumalbumin.Tilsæt de fortyndede antistoffer til røret og inkuber prøverne natten over ved fire grader Celsius. Morgenen efter fjernelse af antistoffet vaskes det resterende antistoffortyndingsmiddel væk med tre 10-minutters vaske med PBS. Fortynd en mikroliter DyLight 633-Phalloidin med 50 mikroliter PBS og tilsæt 50 mikroliter fortyndet phalloidin til røret til en to-timers inkubation ved stuetemperatur.Efter fjernelse af phalloidin vaskes det resterende phalloidin grundigt med tre 10-minutters vaske med PBS. Anbring en dråbe monteringsmedium indeholdende DAPI på et mikroskopglas. Overfør tarmene til mediet og læg forsigtigt dækglasset over prøven uden at skabe bobler.Den repræsentative laserscanningskonfokale mikrografi af udskårne WBPH-tarme fra voksne efter mærkning med phalloidin viste tre sektioner: fortarmen, midgut og bagtarmen. Blandt disse er midgut det oprindelige infektionssted for SRBSDV. Tarmens enkeltlags epitelcellestruktur letter undersøgelsen af den cellulære lokalisering af insektproteiner og colokalisering af virale og insektproteiner.Udskårne WBPH-tarme med DyLight 488-mærkede anti-VAMP-7- og SRBSDV-virioner med DyLight 549-mærket anti-SRBSDV-antistof er vist her. VAMP-7 og SRBSDV virioner viste sig at co-lokalisere i cytoplasmaet, hvilket tyder på, at VAMP-7 kan spille en rolle i virusoverførsel in vivo. Permeabiliserede tarme skal rengøres grundigt efter inkubation med luciferinkonjugerede antistoffer for at reducere baggrunden og den ikke-specifikke binding.Dette er en pålidelig metode til at se lokalisering af virus, andre patogener og insektproteiner i insekter. Det danner grundlag for yderligere undersøgelser af forholdet mellem patogener og insekter.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolisk mærkning og membranfraktionering for Komparativ proteomiske analyse af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiske Recordings og RNA-sekventering af smags- Vedhæng i gul-feber Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

En sammenlignende analyse af rekombinant protein udtryk gennem forskellige Biofactories: Bakterier, insektceller og Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion og karakterisering af DNA Ændringer af Generation of Tomato Behårede Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient ekspression og Cellulær Lokalisering af rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Direkte agroinokulering af majsplanter ved injektion med rekombinant foxtail mosaikvirus og sukkerrør mosaikvirus infektiøse kloner

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunfluorescerende farvning til visualisering af heterochromatin associerede proteiner i Drosophila Spytkirtler

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...