Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31630058 aan X.W. en 31772134 aan W.L.).

1. Niet-virulifere insectenkweek
<ol><li>Verzamel WBPHs van rijstvelden en achteraan met rijstzaailingen in glazen bekers van 1 L bedekt met insectenbestendig net in een incubator bij 28 °C met 16 h licht en 8 h donker. Omdat SRBSDV niet via eieren wordt overgedragen, zijn pas uitgekomen nimfen niet virulifer.</li>
	<li>Borstel met een penseelpen insecten voorzichtig uit het bekerglas dat insecten opfokt in een nieuw bekerglas verse rijstzaailingen elke week totdat WBPH-nimfen zijn uitgekomen. Ga door met het grootbre...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

Voor de beste resultaten moeten een paar belangrijke punten worden overwogen. Ten eerste is een hoge verhouding van virulifere insecten onder de totale populatie noodzakelijk. Hoewel de minimale AAP voor SRBSDV door WBPH-nimfen en volwassenen 5 min17 is, moeten de insecten zich gedurende 2 d kunnen voeden met verse SRBSDV-geïnfecteerde rijstplanten om een acquisitie-efficiëntie van maximaal 80% te bereiken. Omdat de SRBSDV-virionen in 80% van de midguts18 kunnen worden ge...

De meeste beschreven plantenvirussen worden overgedragen door insecten uit de orde Hemiptera die bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en tripsomvat 1,2. De piercing-zuigende monddelen van hemipteran-insecten doorboren het plantenweefsel voor het voeden en afscheiden van speeksel, waardoor het virus tegelijkertijd efficiënt wordt overgedragen2. Verschillende overdrachtsmechanismen van plantenvirussen door vectorinsecten zijn beschreven. Deze omvatten niet-persistent, semipersistent en persistent. Het persistente type is niet-propagatief of voortplantingsf3,4, maar voor beide typen moet het overgedragen virus door het lichaam van het insect bewegen. In de persistent-propagatieve modus infecteren en repliceren virussen aanvankelijk in de epitheelcellen van de darm van het insect, verspreiden zich vervolgens in verschillende weefsels en uiteindelijk in de speekselklieren, van waaruit ze vervolgens via het speeksel in een plant kunnen worden geïntroduceerd tijdens insectenvoeding 5,6. Persistente overgedragen virussen bewegen zich door verschillende organen en repliceren in hun insectenvectoren, wat specifieke interacties tussen virus- en vectorcomponenten in verschillende stadia vereist 7,8.
Virale eiwitten en insecteneiwitten moeten interageren om kritieke processen voor virusherkenning, infectie, replicatie of verspreiding in de vectorinsectente vergemakkelijken 9,10. Hoewel optische microscopie kan worden gebruikt om cellulaire structuren bij insecten te observeren, kan het geen virionverdeling, cellulaire lokalisatie of colocalisatie van virale eiwitten en insecteneiwitten, of de ultrastructuur van insectenweefsels en -cellen laten zien. Immunofluorescentie-etikettering werd voor het eerst uitgevoerd door Coons et al. in de fagocytische cellen van de muis door middel van het labelen van specifieke fluoresceïne-antilichamen, en nu wordt het op grote schaal gebruikt11. De immunofluorescentietechniek, ook bekend als de fluorescentie-antilichaamtechniek, is een van de vroegste immunologische etiketteringstechnieken die is ontwikkeld en is gebaseerd op de specifieke bindingsreactie tussen het antigeen en het antilichaam11,12. Het bekende antilichaam wordt eerst gelabeld met fluoresceïne, dat wordt gebruikt als een sonde om de overeenkomstige antigenen in de cellen of weefsels te detecteren13,14. Nadat het fluoresceïne-gelabelde antilichaam zich bindt aan het overeenkomstige antigeen in cellen of weefsels, zal de sonde heldere fluorescentie uitzenden wanneer bestraald met excitatiegolflengten en bekeken met een fluorescentiemicroscoop om het antigeen15 te lokaliseren.
De meeste vectorinsecten van plantenvirussen zijn hemipterans. Een hogere populatiedichtheid van vectorinsecten met een hoge transmissie-efficiëntie voor het plantenvirus kan leiden tot virusepidemieën5. Zuidelijk rijstzwart gestreept dwergvirus (SRBSDV, geslacht Fijivirus, familie Reoviridae), een van de ernstigste ziekteverwekkers van rijst, heeft zich snel verspreid over rijstteeltgebieden in Oost- en Zuidoost-Azië en veroorzaakte ernstige opbrengstverliezen sinds 201016,17. Volwassenen en nimfen van de witrugplanthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) brengen SRBSDV op rijst over op een persistent-vermeerderingsve manier met een hoge efficiëntie. Veldstudies hebben aangetoond dat uitbraken van SRBSDV-geïnduceerde rijstzwart gestreepte dwergziekte meestal samenvallen met massale langeafstandsmigratie van WBPHs, een cruciale factor in SRBSDV-epidemieën 7,8,18. Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) is een oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment protein receptor (SNARE), die het transport van stoffen via vesikelfusie kan bemiddelen. VAMP7 interageert in vitro met het buitenste belangrijke capsid-eiwit van SRBSDV, wat aangeeft dat VAMP7 nauw geassocieerd kan zijn met virusoverdracht16.
In het hier gepresenteerde protocol hebben we de darm uit virulifere WBPH weggesneden als voorbeeld om SRBSDV-virionen en VAMP7 in midgut-epitheelcellen te labelen16. Als de eerste invasieplaats van het virus speelt het midgut-epitheel een vitale rol bij virusinfectie, replicatie en overdracht. Eerst hebben we de stappen beschreven om de darm te verwijderen van nimfen en volwassenen van WBPHs. Ten tweede gebruikten we specifieke fluoresceïne-gelabelde antilichamen om SRBSDV-virionen en VAMP7 in darmepitheelcellen te labelen. Vervolgens observeerden we epitheelcellen en de cellulaire locatie van de virionen en VAMP7 via een laserscannende confocale microscoop. De resultaten toonden aan dat SRBSDV-virionen en VAMP7 konden colokaliseren in het cytoplasma van de midgutepitheelcellen, wat suggereert dat de specifieke functie van VAMP7 gerelateerd kan zijn aan de verspreiding van virionen uit midgutepitheelcellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

De meeste plantenvirussen in de natuur worden van de ene plant op de andere overgedragen door hemipteran insecten. Een hoge bevolkingsdichtheid van de vectorinsecten die zeer efficiënt zijn in virusoverdracht speelt een sleutelrol bij virusepidemieën in velden. Het bestuderen van virus-insect vectorinteracties kan ons begrip van virusoverdracht en epidemieën verbeteren met als doel nieuwe strategieën te ontwerpen om plantenvirussen en hun vectorinsecten te beheersen. Immunofluorescentie-etikettering is op grote schaal gebruikt om interacties tussen pathogenen en gastheren te analyseren en wordt hier gebruikt in de white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), die efficiënt het zuidelijke rijstzwart gestreepte dwergvirus (SRBSDV, genus Fijivirus, familie Reoviridae) overbrengt, om de virionen en insecteneiwitten in de midgutepitheelcellen te lokaliseren. Met behulp van laserscanning confocale microscopie bestudeerden we de morfologische kenmerken van midgut-epitheelcellen, cellulaire lokalisatie van insecteneiwitten en de colocalisatie van virionen en een insecteneiwit. Dit protocol kan worden gebruikt om virusactiviteiten bij insecten, functies van insecteneiwitten en interacties tussen virus en vectorinsect te bestuderen.

Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, excisie van de darm, immunofluorescente etikettering en het maken van de dia.
Weggesneden WBPH-darmen van volwassenen werden gefixeerd in 4% (m/v) paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met 2% (v/v) Triton X-100 en vervolgens geïncubeerd met Dylight 633 falloidine10,18. De laserscanning confocale micrograaf in <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Dit protocol voor immunofluorescente etikettering van zowel plantaardige viruseiwitten als vectorinsecteneiwitten in weggesneden insectendarmen kan worden gebruikt om interacties tussen virus- en vectorinsecten, insecteneiwitfuncties en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan virusoverdracht te bestuderen.

Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Dit protocol kan worden gebruikt om verschillende bewegingen in insecten, functies van insecteneiwitten en interacties tussen virus en vectorinsect in vivo te bestuderen. Deze methode is efficiënt en informatief. De structuren van de insectendarm en de hulpcellen worden duidelijk gevisualiseerd wanneer ze worden bekeken met de laserscannende confocale microscopie.Lu Zhang, PhD van ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, breng niet-virulifere insecten over van glazen bekers naar vers zuidelijk rijstzwart gestreept dwergvirus, SRBSDV, geïnfecteerde rijstplanten bedekt met een insectenbestendig net voor een toegangsperiode van twee dagen tot virusverwerving. Verzamel vervolgens de insecten in glazen bekers met verse rijstzaailingen.Verzamel na twee dagen de insecten uit de glazen bekers met behulp van een handmatige aspirator voor dissectie en excisie van de darm. Bereid 0,01 kies PBS, 4% paraformaldehyde en 2% Triton X-100 voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik een pipetter om 100 microliter PBS op een glazen dia te plaatsen en plaats de dia op het podium van een optische microscoop.Gebruik handmatige aspirator om de SRBSDV-geïnfecteerde volwassenen uit de glazen bekers te verzamelen en plaats ze in een buis van 1,5 milliliter op ijs om de insecten te verlammen. Breng een verlamde volwassene over in de 100 microliter PBS op de glijbaan met de buik omhoog. Gebruik een pincet om het lichaam vast te klemmen en verwijder het hoofd met een ander pincet.Klem met een pincet de zijkanten van de buik vast en klem de legboor of het copulatorische orgaan van de staart met de andere set vast en trek vervolgens voorzichtig aan het intersegmentale membraan van een buiksegment om de darm in de buik langzaam bloot te leggen. Ga door met het wegscheuren van het membraan en trek geleidelijk de volledige darm uit de buik. Trek voorzichtig de staart af die verbonden is met het uiteinde van de darm om de volledige darm te verwijderen.Plaats weggesneden ingewanden in een centrifugebuis van 200 microliter. Voeg 200 microliter PBS toe aan de buis en gebruik een pipet om de ingewanden grondig te wassen. Gebruik een pipetter om 100 microliter PBS op een glazen dia te plaatsen en plaats de dia op het podium van een optische microscoop.Gebruik handmatige aspirator om de SRBSDV-geïnfecteerde nimfen uit glazen bekers te verzamelen en plaats ze in een buis van 1,5 milliliter die op ijs is geplaatst om de insecten te verlammen. Breng een verlamde nimf over in de 100 microliter buffer op de glijbaan met de buik naar boven gericht. Maak de staart van de nimf los, klem vervolgens het insectenlichaam vast om het voorzichtig te fixeren en gebruik het andere paar om het hoofd te klemmen.Trek het hoofd voorzichtig weg van het lichaam terwijl je nog steeds zijn aanhechting aan de darm behoudt, zodat het hoofd loskomt van het lichaam, maar de darm nog steeds vastzit aan de thorax en de buik. Met het pincet nog steeds klemmend op het lichaam, gebruik je het andere paar om het hoofd voorzichtig te bewegen en geleidelijk de darm eruit te trekken. Maak de darm los van het hoofd om een intacte darm te verkrijgen zonder het lichaam te beschadigen.Plaats de weggesneden ingewanden in een buis. Voeg PBS toe aan de buis en zuig zachtjes de oplossing los met een pipet om de ingewanden grondig te wassen. Bereid de antilichamen en het montagemedium voor zoals beschreven in het tekstmanuscript.Plaats de vers uitgesneden en PBS gewassen WBPH-darmen in 100 microliter 4% paraformaldehyde in een centrifugebuis van 200 microliter bij kamertemperatuur. Vervang na twee uur de paraformaldehyde-oplossing door 200 microliter PBS. Verwijder na 10 minuten de PBS om paraformaldehyde te verwijderen en herhaal de PBS-wasstap twee keer.Voeg na twee PBS-wasbeurten 200 microliter niet-ionisch wasmiddel Triton X-100 toe om de monsters bij kamertemperatuur te permeabiliseren. Verwijder na 30 minuten de Triton X-100 en was het resterende wasmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Verdun de gelabelde antilichamen één tot 50 met 50 microliter bull serum albumine.Voeg de verdunde antilichamen toe aan de buis en incubeer de monsters 's nachts bij vier graden Celsius. Spoel op de ochtend na het verwijderen van het antilichaam het resterende antilichaamverdunningsmiddel weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Verdun een microliter DyLight 633-falloidine met 50 microliter PBS en voeg 50 microliter verdund falloïdine toe aan de buis voor een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur.Na het verwijderen van falloïdine, spoel de resterende falloidine grondig weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS. Plaats een druppel montagemedium met DAPI op een microscoopglaasje. Breng de ingewanden over op het medium en plaats het afdekglas voorzichtig over het monster zonder bubbels te creëren.De representatieve laserscanning confocale micrografie van weggesneden WBPH-darmen van volwassenen na etikettering met falloidine toonde drie secties: het foregut, midgut en hindgut. Onder deze, midgut is de initiële infectie plaats van SRBSDV. De monolaagse epitheelcelstructuur van de darm vergemakkelijkt de studie van de cellulaire lokalisatie van insecteneiwitten en colocalisatie van virale en insecteneiwitten.Weggesneden WBPH-darmen met DyLight 488 gelabeld anti-VAMP-7 en SRBSDV-virionen met DyLight 549 gelabeld anti-SRBSDV-antilichaam worden hier getoond. VAMP-7- en SRBSDV-virionen bleken samen te lokaliseren in het cytoplasma, wat suggereert dat VAMP-7 een rol kan spelen bij virusoverdracht in vivo. Permeabilized darmen moeten grondig worden gereinigd na incubatie met luciferine geconjugeerde antilichamen om de achtergrond en niet-specifieke binding te verminderen.Dit is een betrouwbare methode om de lokalisatie van virussen, andere pathogenen en insecteneiwitten in insecten te bekijken. Het biedt de basis voor verdere studies van de relatie tussen pathogenen en insecten.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...