Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31630058 an X.W. und 31772134 an W.L.) unterstützt.

1. Nichtvirulifere Insektenaufzucht
<ol><li>WBPHs von Reisfeldern sammeln und mit Reissämlingen in 1-Liter-Glasbechern, die mit insektendichtem Netz bedeckt sind, in einem Inkubator bei 28 °C mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit aufziehen. Da SRBSDV nicht über Eier übertragen wird, sind frisch geschlüpfte Nymphen nicht virulifer.</li>
	<li>Bürsten Sie mit einem Pinselstift jede Woche vorsichtig Insekten aus dem Becher, die Insekten aufziehen, in ein neues Becherglas mit frischen Reissämlingen, bis WBPH-Nymphen gesc...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. 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U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten einige wichtige Punkte beachtet werden. Erstens ist ein hoher Anteil viruliferer Insekten an der Gesamtpopulation notwendig. Obwohl der minimale AAP für SRBSDV durch WBPH-Nymphen und Erwachsene 5 min17 beträgt, sollten die Insekten 2 Tage lang von frischen SRBSDV-infizierten Reispflanzen gefressen werden, um eine Erfassungseffizienz von bis zu 80% zu erreichen. Da die SRBSDV-Virionen in 80% des Mitteldarms nachgewiesen werden können<sup class="xref"...

Die meisten beschriebenen Pflanzenviren werden durch Insekten aus der Ordnung Hemiptera übertragen, zu der Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse 1,2 gehören. Die stechend-saugenden Mundwerkzeuge von Hemipteran-Insekten durchbohren das Pflanzengewebe, um Speichel zu füttern und abzusondern, wodurch das Virus gleichzeitig effizient übertragenwird 2. Verschiedene Übertragungsmechanismen von Pflanzenviren durch Vektorinsekten wurden beschrieben. Dazu gehören nonpersistent, semipersistent und persistent. Der persistente Typ ist entweder nicht-propagativ oder propagativ3,4, aber für beide Typen muss sich das übertragene Virus durch den Körper des Insekts bewegen. Im persistent-propagativen Modus infizieren und vermehren sich Viren zunächst in den Epithelzellen des Darms des Insekts, verbreiten sich dann in verschiedenen Geweben und schließlich in den Speicheldrüsen, von wo aus sie dann während der Insektenfütterung über den Speichel in eine Pflanze eingeführt werdenkönnen 5,6. Persistente übertragene Viren bewegen sich durch verschiedene Organe und replizieren sich in ihren Insektenvektoren, was spezifische Wechselwirkungen zwischen Virus- und Vektorkomponenten in verschiedenen Stadien erfordert 7,8.
Virale Proteine und Insektenproteine müssen interagieren, um kritische Prozesse für die Viruserkennung, -infektion, -replikation oder -verbreitung in den Vektorinsektenzu erleichtern 9,10. Obwohl die optische Mikroskopie verwendet werden kann, um zelluläre Strukturen in Insekten zu beobachten, kann sie keine Virionverteilung, zelluläre Lokalisation oder Kolokalisation von viralen Proteinen und Insektenproteinen oder die Ultrastruktur von Insektengeweben und -zellen zeigen. Die Immunfluoreszenzmarkierung wurde zuerst von Coons et al. in den phagozytischen Zellen der Maus mittels Markierung spezifischer Fluorescein-Antikörper durchgeführt und ist heute weit verbreitet11. Die Immunfluoreszenztechnik, auch bekannt als Fluoreszenz-Antikörper-Technik, ist eine der frühesten immunologischen Markierungstechniken und basiert auf der spezifischen Bindungsreaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper11,12. Der bekannte Antikörper wird zunächst mit Fluorescein markiert, das als Sonde zum Nachweis der entsprechenden Antigene in den Zellen oder Geweben verwendet wird13,14. Nachdem der Fluorescein-markierte Antikörper an das entsprechende Antigen in Zellen oder Geweben gebunden hat, emittiert die Sonde eine helle Fluoreszenz, wenn sie mit Anregungswellenlängen bestrahlt und mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wird, um das Antigen15 zu lokalisieren.
Die meisten Vektorinsekten von Pflanzenviren sind Hemipteren. Eine höhere Populationsdichte von Vektorinsekten, die eine hohe Übertragungseffizienz für das Pflanzenvirus aufweisen, kann zu Virusepidemien führen5. Das Südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae), einer der schwerwiegendsten Erreger von Reis, hat sich in den Reisanbaugebieten in Ost- und Südostasien rasch ausgebreitet und seit 2010 schwere Ertragseinbußen verursacht16,17. Erwachsene und Nymphen der Weißrückenzikade (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) übertragen SRBSDV persistent-propagativ mit hoher Effizienz auf Reis. Feldstudien haben gezeigt, dass Ausbrüche der SRBSDV-induzierten Reisschwarzstreifen-Zwergkrankheit in der Regel mit einer Massenmigration von WBPHs über große Entfernungen zusammenfallen, einem entscheidenden Faktor bei SRBSDV-Epidemien 7,8,18. Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) ist ein löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-Bindungsprotein-Rezeptor (SNARE), der den Transport von Substanzen durch Vesikelfusion vermitteln kann. VAMP7 interagiert in vitro mit dem äußeren Hauptkapsidprotein von SRBSDV, was darauf hindeutet, dass VAMP7 eng mit der Virusübertragung assoziiert sein könnte16.
In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir den Darm aus viruliferem WBPH herausgeschnitten, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Mitteldarmepithelzellenzu markieren 16. Als erste Invasionsstelle des Virus spielt das Mitteldarmepithel eine wichtige Rolle bei der Infektion, Replikation und Übertragung von Viren. Zuerst haben wir die Schritte beschrieben, um den Darm von Nymphen und Erwachsenen von WBPHs zu entfernen. Zweitens verwendeten wir spezifische Fluorescein-markierte Antikörper, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Darmepithelzellen zu markieren. Dann beobachteten wir Epithelzellen und die zelluläre Lage der Virionen und VAMP7 über ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass SRBSDV-Virionen und VAMP7 im Zytoplasma der Mitteldarmepithelzellen kolokalisieren können, was darauf hindeutet, dass die spezifische Funktion von VAMP7 mit der Verbreitung von Virionen aus Mitteldarmepithelzellen zusammenhängen könnte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

Die meisten Pflanzenviren in der Natur werden durch Hemipteran-Insekten von einer Pflanze auf eine andere übertragen. Eine hohe Populationsdichte der Vektorinsekten, die bei der Virusübertragung hocheffizient sind, spielt eine Schlüsselrolle bei Virusepidemien auf Feldern. Die Untersuchung von Virus-Insekten-Vektorinteraktionen kann unser Verständnis von Virusübertragung und Epidemien verbessern, mit dem Ziel, neuartige Strategien zur Bekämpfung von Pflanzenviren und ihren Vektorinsekten zu entwickeln. Die Immunfluoreszenzmarkierung ist weit verbreitet, um Interaktionen zwischen Krankheitserregern und Wirten zu analysieren, und wird hier in der Weißrücken-Zikade (WBPH, Sogatella furcifera) verwendet, die das südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae) effizient überträgt, um die Virionen und Insektenproteine in den Epithelzellen des Mitteldarms zu lokalisieren. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die morphologischen Eigenschaften von Mitteldarmepithelzellen, die zelluläre Lokalisation von Insektenproteinen und die Kolokalisation von Virionen und einem Insektenprotein. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Virusaktivitäten in Insekten, Funktionen von Insektenproteinen und Wechselwirkungen zwischen Virus und Vektorinsekt zu untersuchen.

Abbildung 1 veranschaulicht alle Schritte in diesem Protokoll: Insektenaufzucht, Viruserwerb, Exzision des Darms, Immunfluoreszenzmarkierung und Herstellung des Objektträgers.
Exzidierte WBPH-Eingeweide von Erwachsenen wurden in 4% (m/v) Paraformaldehyd fixiert, mit 2% (v/v) Triton X-100 permeabilisiert und dann mit Dylight 633 Phalloidin10,18 inkubiert. Die konfokale Laserscanning-Aufnahme in <strong cla...

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Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Dieses Protokoll zur Immunfluoreszenzmarkierung sowohl von Pflanzenvirusproteinen als auch von Vektorinsektenproteinen in herausgeschnittenen Insektendärmen kann verwendet werden, um Interaktionen zwischen Virus- und Vektorinsekten, Insektenproteinfunktionen und molekulare Mechanismen, die der Virusübertragung zugrunde liegen, zu untersuchen.

Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um verschiedene Bewegungen bei Insekten, Funktionen von Insektenproteinen und Wechselwirkungen zwischen Virus und Vektorinsekt in vivo zu untersuchen. Diese Methode ist effizient und informativ. Die Strukturen des Insektendarms und der Hilfszellen werden bei der Betrachtung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie deutlich sichtbar.Das Verfahren wird von Dr. Lu Zhang aus unserem Labor demonstriert. Übertragen Sie zunächst nicht-virulifere Insekten aus Bechergläsern auf frisches südliches Reisschwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV), infizierte Reispflanzen, die mit einem insektensicheren Netz bedeckt sind, für einen zweitägigen Viruserwerbszeitraum. Sammeln Sie dann die Insekten in Glasbechern mit frischen Reissämlingen.Sammeln Sie die Insekten nach zwei Tagen mit einem manuellen Aspirator aus den Glasbechern zur Dissektion und Exzision des Darms. Bereiten Sie 0,01 molare PBS, 4% Paraformaldehyd und 2% Triton X-100 vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie einen Pipetter, um 100 Mikroliter PBS auf einen Objektträger zu legen und den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops zu legen.Verwenden Sie einen manuellen Absauger, um die SRBSDV-infizierten Erwachsenen aus den Glasbechern zu sammeln und sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis zu legen, um die Insekten zu lähmen. Übertragen Sie einen gelähmten Erwachsenen mit dem Bauch nach oben in die 100 Mikroliter PBS auf dem Objektträger. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Körper festzuklemmen, und entfernen Sie den Kopf mit einer anderen Pinzette.Klemmen Sie mit einer Pinzette die Seiten des Abdomens fest und klemmen Sie den Ovipositor oder das Kopulationsorgan des Schwanzes mit dem anderen Satz fest, dann ziehen Sie vorsichtig an der intersegmentalen Membran eines Bauchsegments, um den Darm langsam im Bauch freizulegen. Reißen Sie die Membran weiter weg und ziehen Sie nach und nach den gesamten Darm aus dem Bauch. Ziehen Sie vorsichtig den Schwanz ab, der mit dem Ende des Darms verbunden ist, um den gesamten Darm zu entfernen.Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in das Röhrchen und waschen Sie den Darm mit einer Pipette gründlich. Verwenden Sie einen Pipetter, um 100 Mikroliter PBS auf einen Objektträger zu legen und den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops zu legen.Verwenden Sie einen manuellen Aspirator, um die SRBSDV-infizierten Nymphen aus Glasbechern zu sammeln und sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu legen, das auf Eis gelegt wird, um die Insekten zu lähmen. Übertragen Sie eine gelähmte Nymphe mit dem Bauch nach oben in die 100 Mikroliter Puffer auf dem Objektträger. Nehmen Sie den Schwanz der Nymphe ab, klemmen Sie dann den Insektenkörper fest, um ihn sanft zu fixieren, und klemmen Sie den Kopf mit dem anderen Paar fest.Ziehen Sie den Kopf vorsichtig vom Körper weg, während Sie seine Befestigung am Darm beibehalten, so dass sich der Kopf vom Körper löst, der Darm jedoch immer noch am Brustkorb und am Bauch befestigt ist. Während die Pinzette den Körper immer noch festklemmt, verwenden Sie das andere Paar, um den Kopf vorsichtig zu bewegen und den Darm allmählich herauszuziehen. Lösen Sie den Darm vom Kopf, um einen intakten Darm zu erhalten, ohne den Körper zu schädigen.Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein Röhrchen. Geben Sie PBS in das Röhrchen und saugen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette ab, um den Darm gründlich zu waschen. Bereiten Sie die Antikörper und das Einlagemedium wie im Textmanuskript beschrieben vor.Legen Sie die frisch herausgeschnittenen und PBS-gewaschenen WBPH-Eingeweide in 100 Mikroliter 4%paraformaldehyd in ein 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Paraformaldehydlösung nach zwei Stunden durch 200 Mikroliter PBS. Entfernen Sie nach 10 Minuten das PBS, um Paraformaldehyd zu entfernen, und wiederholen Sie den PBS-Waschschritt zweimal.Fügen Sie nach zwei PBS-Wäschen 200 Mikroliter des nichtionischen Waschmittels Triton X-100 hinzu, um die Proben bei Raumtemperatur zu permeabilisieren. Entfernen Sie den Triton X-100 nach 30 Minuten und waschen Sie das restliche Waschmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Verdünnen Sie die markierten Antikörper eins bis 50 mit 50 Mikrolitern Bullenserumalbumin.Geben Sie die verdünnten Antikörper in das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie am Morgen nach dem Entfernen des Antikörpers das verbleibende Antikörperverdünnungsmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Verdünnen Sie einen Mikroliter DyLight 633-Phalloidin mit 50 Mikrolitern PBS und geben Sie 50 Mikroliter verdünntes Phalloidin für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur in das Röhrchen.Waschen Sie das verbleibende Phalloidin nach dem Entfernen von Phalloidin gründlich mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Geben Sie einen Tropfen des DAPI-haltigen Trägers auf einen Objektträger. Übertragen Sie die Eingeweide auf das Medium und legen Sie das Deckglas vorsichtig über die Probe, ohne Blasen zu bilden.Die repräsentative konfokale Laserscanning-Aufnahme von herausgeschnittenen WBPH-Eingeweiden von Erwachsenen nach Markierung mit Phalloidin zeigte drei Abschnitte: Vorderdarm, Mitteldarm und Hinterdarm. Unter diesen ist der Mitteldarm die erste Infektionsstelle von SRBSDV. Die einschichtige Epithelzellstruktur des Darms erleichtert die Untersuchung der zellulären Lokalisierung von Insektenproteinen und der Kolokalisierung von Virus- und Insektenproteinen.Hier sind herausgeschnittene WBPH-Eingeweide mit DyLight 488-markierten Anti-VAMP-7- und SRBSDV-Virionen mit DyLight 549-markierten Anti-SRBSDV-Antikörpern dargestellt. Es wurde gezeigt, dass VAMP-7- und SRBSDV-Virionen im Zytoplasma kolokalisiert sind, was darauf hindeutet, dass VAMP-7 eine Rolle bei der Virusübertragung in vivo spielen könnte. Permeabilisierte Eingeweide sollten nach der Inkubation mit Luciferin-konjugierten Antikörpern gründlich gereinigt werden, um den Hintergrund und die unspezifische Bindung zu reduzieren.Dies ist eine zuverlässige Methode, um die Lokalisierung von Viren, anderen Krankheitserregern und Insektenproteinen in Insekten zu untersuchen. Es bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen der Beziehung zwischen Krankheitserregern und Insekten.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Direkte Agroinokulation von Maissämlingen durch Injektion mit rekombinanten Foxtail Mosaic Virus und Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...