Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31630058 ל- X.W. ו- 31772134 ל- W.L).

1. גידול חרקים לא אלימים
<ol><li>אספו WBPHs משדות אורז ומאחור עם שתילי אורז בכוסות זכוכית 1 L המכוסות ברשת חסינת חרקים באינקובטור ב 28 ° C עם 16 שעות אור ו 8 שעות כהה. מכיוון ש- SRBSDV אינו מועבר באמצעות ביצים, נימפות שזה עתה בקעו אינן ארסיות.</li>
	<li>בעזרת עט מברשת, הברישו בעדינות חרקים מהכד שמגדל חרקים לכוס...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לקחת בחשבון מספר נקודות מפתח. ראשית, יש צורך ביחס גבוה של חרקים אלימים בקרב כלל האוכלוסייה. למרות AAP המינימלי עבור SRBSDV על ידי נימפות WBPH ומבוגרים הוא 5 דקות17, חרקים צריך להיות מותר להאכיל על צמחי אורז טריים נגועים SRBSDV עבור 2 D כדי להשיג יעילות רכישה ש?...

רוב הנגיפים הצמחיים המתוארים מועברים על ידי חרקים מסדר Hemiptera הכולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, planthoppers, ו thrips 1,2. חלקי הפה המוצצים של חרקים המיפטרניים מנקבים את רקמת הצמח לצורך הזנה והפרשת רוק, ובמקביל מעבירים ביעילות את הנגיף2. תוארו מנגנוני העברה שונים של וירוסים צמחיים על ידי חרקים וקטוריים. אלה כוללים לא מתמיד, מתמיד למחצה ומתמיד. הסוג המתמיד אינו מתפשט או מתפשט3,4, אך עבור שני סוגים אלה, הנגיף המועבר חייב לנוע בכל גופו של החרק. במצב התפשטות מתמשך, נגיפים מדביקים ומשתכפלים בתחילה בתאי האפיתל של מעי החרק, לאחר מכן מפיצים לרקמות שונות, ובסופו של דבר לבלוטות הרוק, משם הם יכולים להיות מוחדרים לצמח דרך הרוק במהלך הזנת חרקים 5,6. וירוסים עקשניים המועברים עוברים דרך איברים שונים ומשתכפלים בווקטורי החרקים שלהם, מה שדורש אינטראקציות ספציפיות בין רכיבי הנגיף והווקטור בשלבים שונים 7,8.
חלבונים נגיפיים וחלבוני חרקים חייבים לקיים אינטראקציה כדי להקל על תהליכים קריטיים לזיהוי וירוסים, זיהום, שכפול או הפצה בחרקים הווקטוריים 9,10. למרות שמיקרוסקופ אופטי יכול לשמש לצפייה במבנים תאיים בחרקים, הוא אינו יכול להראות התפלגות נגיפים, לוקליזציה תאית או קו-לוקליזציה של חלבונים נגיפיים וחלבון חרקים, או את מבנה העל של רקמות ותאים של חרקים. תיוג Immunofluorescence בוצע לראשונה על ידי Coons et al. בתאים phagocytic של העכבר באמצעות תיוג נוגדנים פלואורסצאין ספציפיים, ועכשיו זה נמצא בשימוש נרחב11. טכניקת האימונופלואורסצנטיות, הידועה גם בשם טכניקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים, היא אחת מטכניקות הסימון האימונולוגיות המוקדמות ביותר שפותחו והיא מבוססת על תגובת הקישור הספציפית בין האנטיגן לנוגדן11,12. הנוגדן הידוע מסומן לראשונה עם פלואורסצאין, המשמש כבדיקה כדי לזהות את האנטיגנים המתאימים בתאים או ברקמות13,14. לאחר שהנוגדן המסומן בפלואורסצאין נקשר לאנטיגן המתאים בתאים או ברקמות, הגשושית תפלוט פלואורסצנטיות בהירה כאשר היא מוקרנת באורכי גל עירור ונצפית במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי למקם את האנטיגן15.
רוב החרקים הווקטוריים של וירוסים צמחיים הם המיפטרנים. צפיפות אוכלוסייה גבוהה יותר של חרקים וקטוריים בעלי יעילות העברה גבוהה לנגיף הצמח עלולה להוביל למגיפות וירוסים5. וירוס ננסי שחור פסים של אורז דרומי (SRBSDV, סוג פיג'יוירוס, משפחה Reoviridae), אחד הפתוגנים החמורים ביותר של אורז, התפשט במהירות באזורי גידול האורז במזרח ובדרום מזרח אסיה, וגרם להפסדי יבול חמורים מאז 201016,17. בוגרים ונימפות של הפלנטהופר לבן הגב (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) מעבירים SRBSDV לאורז באופן מתמיד-מתפשט עם יעילות גבוהה. מחקרי שדה הראו כי התפרצויות של מחלת ננס שחור פסים אורז המושרה על ידי SRBSDV בדרך כלל חופפות להגירה המונית למרחקים ארוכים של WBPHs, גורם מכריע במגיפות SRBSDV 7,8,18. חלבון קרום הקשור לשלפוחית 7 (VAMP7) הוא קולטן חלבון חיבור לגורם רגיש N-ethylmaleimide-sensitive (SNARE), אשר יכול לתווך את הובלת החומרים באמצעות איחוי שלפוחית. VAMP7 מקיים אינטראקציה עם חלבון הקפסיד העיקרי החיצוני של SRBSDV במבחנה, מה שמצביע על כך ש- VAMP7 עשוי להיות קשור קשר הדוק עם העברת וירוסים16.
בפרוטוקול המוצג כאן, הוצאנו את המעי מ-WBPH אלים כדוגמה כדי לתייג נגיפים SRBSDV ו-VAMP7 בתאי אפיתל באמצע המעי16. כאתר הפלישה הראשוני של הנגיף, אפיתל המעי התיכון ממלא תפקידים חיוניים בזיהום, שכפול והעברה של הנגיף. ראשית, פירטנו את השלבים לכריתת המעיים מנימפות ומבוגרים של WBPHs. שנית, השתמשנו בנוגדנים ספציפיים עם תווית פלואורסצאין כדי לתייג נגיפים של SRBSDV ו-VAMP7 בתאי אפיתל של המעי. לאחר מכן צפינו בתאי אפיתל ובמיקום התאי של הנגיפים ושל VAMP7 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התוצאות הראו כי נגיפים של SRBSDV ו-VAMP7 יכולים לבצע לוקליזציה בציטופלסמה של תאי האפיתל של המעי, מה שמרמז על כך שהפונקציה הספציפית של VAMP7 עשויה להיות קשורה להפצת נגיפים מתאי אפיתל של אמצע המעי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

רוב הנגיפים הצמחיים בטבע מועברים מצמח אחד לאחר על ידי חרקים המיפטרניים. צפיפות אוכלוסין גבוהה של חרקים וקטוריים היעילים מאוד בהעברת וירוסים ממלאת תפקיד מפתח במגיפות וירוסים בשדות. חקר אינטראקציות וקטוריות בין וירוסים לחרקים יכול לקדם את הבנתנו של העברת וירוסים ומגיפות במטרה לעצב אסטרטגיות חדשניות לשליטה בנגיפים צמחיים ובחרקים הווקטוריים שלהם. תיוג אימונופלואורסנציה נמצא בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות בין פתוגנים ופונדקאים, והוא משמש כאן בפלנטהופר לבן הגב (WBPH, Sogatella furcifera), אשר מעביר ביעילות את נגיף הננס השחור של האורז הדרומי (SRBSDV, סוג פיג'יוירוס, משפחה Reoviridae), כדי לאתר את הנגיפים וחלבוני החרקים בתאי האפיתל של אמצע המעי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר חקרנו את המאפיינים המורפולוגיים של תאי אפיתל במרכז המעי, לוקליזציה תאית של חלבוני חרקים וקולוקליזציה של נגיפים וחלבון חרקים. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר פעילות וירוסים בחרקים, תפקודים של חלבוני חרקים ואינטראקציות בין וירוס וחרק וקטורי.

איור 1 מדגים את כל השלבים בפרוטוקול הזה: גידול חרקים, רכישת וירוסים, כריתה של המעי, תיוג אימונופלואורסצנטי ויצירת השקופית.
מעי WBPH שנכרת ממבוגרים היה קבוע ב-4% (m/v) paraformaldehyde, חדור עם 2% (v/v) Triton X-100, ולאחר מכן הודגר עם Dylight 633 phalloidin10,18. ה...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

פרוטוקול זה לתיוג אימונופלואורסצנטי של חלבוני וירוסים צמחיים וחלבוני חרקים וקטוריים במעי חרקים שנכרתו יכול לשמש לחקר אינטראקציות בין חרקים נגיפים ווקטוריים, פונקציות חלבון חרקים ומנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העברת הנגיף.

תיוג אימונופלואורסצנטי של חלבונים וקטוריים של וירוסים צמחיים וחרקים במעיים המיפטרניים

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר תנועות שונות בחרקים, פונקציות של חלבוני חרקים, ואינטראקציות בין וירוס וחרק וקטורי in vivo. שיטה זו יעילה ואינפורמטיבית. המבנים של מעי החרק ותאי העזר מוצגים בבירור כאשר מסתכלים עליהם במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.מי שידגים את ההליך יהיה לו ג'אנג, דוקטור מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, העבירו חרקים לא אלימים מכוסות זכוכית לנגיף ננסי טרי מפוספס שחור אורז דרומי, SRBSDV, צמחי אורז נגועים המכוסים ברשת חסינת חרקים לתקופת גישה של יומיים לרכישת וירוסים. לאחר מכן לאסוף את החרקים בכוסות זכוכית המכילות שתילי אורז טריים.לאחר יומיים, אספו את החרקים מכוסות הזכוכית באמצעות שאיפה ידנית לנתיחה וכריתה של המעיים. הכינו PBS מולארי 0.01, 4% פרפורמלדהיד ו-2% טריטון X-100 כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש בפיטר כדי להניח 100 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית ומקם את המגלשה על הבמה של מיקרוסקופ אופטי.השתמש בשואב ידני כדי לאסוף את המבוגרים הנגועים ב- SRBSDV מכוסות הזכוכית ולהניח אותם בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח כדי לשתק את החרקים. העבר מבוגר משותק לתוך 100 מיקרוליטר של PBS על המגלשה עם הבטן למעלה. השתמש פינצטה כדי להדק את הגוף ולהסיר את הראש עם קבוצה אחרת של פינצטה.עם קבוצה אחת של פינצטה, להדק את הצדדים של הבטן להדק את ovipositor או את האיבר copulatory של הזנב עם קבוצה אחרת, ולאחר מכן בזהירות למשוך את הקרום intersegmental של קטע בטן אחד כדי לחשוף לאט את המעיים בבטן. ממשיכים לקרוע את הקרום ולשלוף בהדרגה את כל המעיים מהבטן. משכו בעדינות את הזנב המחובר לקצה המעי כדי להסיר את כל המעי.הכניסו את המעיים שנכרתו לתוך צינור צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר. הוסף 200 מיקרוליטר של PBS לצינור ולהשתמש פיפטה כדי לשטוף היטב את המעיים. השתמש בפיטר כדי להניח 100 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית ומקם את המגלשה על הבמה של מיקרוסקופ אופטי.השתמש בשואב ידני כדי לאסוף את הנימפות הנגועות SRBSDV מכוסות זכוכית והניחו אותן בצינור 1.5 מיליליטר המונח על קרח כדי לשתק את החרקים. העבירו נימפה משותקת לתוך 100 מיקרוליטר החיץ במגלשה כשהבטן פונה כלפי מעלה. נתקו את זנב הנימפה, ואז הדקו את גוף החרק כדי לתקן אותו בעדינות והשתמשו בזוג השני כדי להדק את הראש.משכו בעדינות את הראש הרחק מהגוף תוך שמירה על חיבורו למעיים כך שהראש מנותק מהגוף, אך המעיים עדיין מחוברים לבית החזה ולבטן. כאשר הפינצטה עדיין מהדקת את הגוף, השתמש בזוג השני כדי להזיז את הראש בזהירות ולשלוף בהדרגה את המעיים. נתקו את המעיים מהראש כדי לקבל מעי שלם מבלי לפגוע בגוף.הכניסו את המעיים שנכרתו לתוך צינור. מוסיפים PBS לצינור ומוצצים בעדינות לשחרר את התמיסה עם פיפטה כדי לשטוף את המעיים ביסודיות. הכינו את הנוגדנים ואת אמצעי ההרכבה כמתואר בכתב היד של הטקסט.הניחו את מעי ה-WBPH שזה עתה נכרת ושטוף PBS ב-100 מיקרוליטר של 4% פרפורמאלדהיד בצינור צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, להחליף את הפתרון paraformaldehyde עם 200 מיקרוליטר של PBS. לאחר 10 דקות, הסר את PBS כדי לסלק כל paraformaldehyde וחזור על שלב השטיפה PBS פעמיים.לאחר שתי שטיפות PBS, הוסיפו 200 מיקרוליטר של חומר ניקוי לא יוני Triton X-100 כדי לחדור את הדגימות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הסירו את Triton X-100 ושטפו את שאריות חומר הניקוי בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. לדלל את הנוגדנים המסומנים אחד עד 50 עם 50 מיקרוליטר של אלבומין בסרום שור.מוסיפים את הנוגדנים המדוללים לצינורית ודגרים על הדגימות במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר לאחר הסרת הנוגדן, שטפו את שאריות הנוגדנים המדללות בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. לדלל מיקרוליטר אחד של DyLight 633-Phalloidin עם 50 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 50 מיקרוליטר של phalloidin מדולל לצינור עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת הפלואידין, שטפו היטב את יתרת הפלואידין בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה המכילים DAPI על שקופית מיקרוסקופ. מעבירים את המעיים למדיום ומניחים בעדינות את זכוכית הכיסוי על הדגימה מבלי ליצור בועות.המיקרוגרף הקונפוקלי המייצג לסריקת לייזר של מעי WBPH שנכרת ממבוגרים לאחר התיוג עם פאלואדין הראה שלושה חלקים: המעי הקדמי, המעי התיכון והמעי האחורי. בין אלה, אמצע המעי הוא אתר הזיהום הראשוני של SRBSDV. מבנה תאי האפיתל החד-שכבתי של המעי מאפשר את חקר הלוקליזציה התאית של חלבוני חרקים וקולוקליזציה של חלבונים נגיפיים וחרקים.מעי WBPH שנכרת עם DyLight 488 המסומן כנוגדן אנטי-VAMP-7 ו-SRBSDV עם נוגדן DyLight 549 המסומן נגד SRBSDV מוצגים כאן. נגיפי VAMP-7 ו-SRBSDV הוכחו כבעלי מיקום משותף בציטופלסמה, דבר המצביע על כך ש-VAMP-7 עשוי למלא תפקיד בהעברת וירוסים in vivo. מעיים חדירים יש לנקות ביסודיות לאחר הדגירה עם נוגדנים מצומדים luciferin כדי להפחית את הרקע ואת מחייב לא ספציפי.זוהי שיטה אמינה לצפייה בלוקליזציה של וירוסים, פתוגנים אחרים וחלבוני חרקים בחרקים. הוא מספק את הבסיס למחקרים נוספים על הקשר בין פתוגנים וחרקים.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...