Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (National Natural Science Foundation of China)의 보조금으로 지원되었습니다 (31630058에서 X.W.로, 31772134에서 WL로).

1. 무독성 곤충 사육
<ol><li>논에서 WBPH를 수집하고 16시간 밝기와 8시간 어두운 28°C의 인큐베이터에서 방충망으로 덮인 1L 유리 비커에 벼 묘목과 함께 후면에 채취합니다. SRBSDV는 알을 통해 전염되지 않기 때문에 새로 부화한 님프는 독성이 없습니다.</li>
	<li>브러시 펜을 사용하여 WBPH 님프가 부화할 때까지 매주 신선한 벼 묘목의 새 비커에 곤충을 기르는 비커에서 곤충을 부드럽게 빗어냅니다. ?...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

최상의 결과를 얻으려면 몇 가지 핵심 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 전체 인구 중 독성 곤충의 비율이 높아야합니다. WBPH 님프와 성인에 의한 SRBSDV의 최소 AAP는 5 분17 초이지만, 곤충은 최대 80 %의 획득 효율을 달성하기 위해 2 일 동안 신선한 SRBSDV에 감염된 벼를 먹일 수 있어야합니다. SRBSDV 비리온은 중장18의 80%에서 검출될 수 있기 때문에, 우리는 이 프로토?...

대부분의 기술 된 식물 바이러스는 진딧물, 흰 파리, 딱정벌레, 식물 호퍼 및 thrips 1,2를 포함하는 Hemiptera 목의 곤충에 의해 전염됩니다. hemipteran 곤충의 피어싱 빨아 먹는 입 부분은 타액을 먹이고 분비하기 위해 식물 조직을 관통하여 바이러스를 효율적으로 전염시킵니다2. 벡터 곤충에 의한 식물 바이러스의 다양한 전염 메커니즘이 설명되었습니다. 여기에는 비지속적, 반지속적 및 영구가 포함됩니다. 영구 유형은 비 전파 성 또는 전파성 3,4이지만,이 두 유형 모두에 대해 전염 된 바이러스는 곤충의 몸 전체로 이동해야합니다. 영구 전파 모드에서, 바이러스는 처음에는 곤충의 내장의 상피 세포에서 감염 및 복제 된 다음 다른 조직으로 퍼지고 결국에는 타액선으로 퍼져 곤충 먹이 동안 타액을 통해 식물에 도입 될 수 있습니다 5,6. 지속성 전염 바이러스는 서로 다른 기관을 통해 이동하고 곤충 벡터에서 복제되며, 이는 서로 다른 단계에서 바이러스와 벡터 구성 요소 간의 특정 상호 작용을 필요로 합니다 7,8.
바이러스 단백질과 곤충 단백질은 벡터 곤충에서 바이러스 인식, 감염, 복제 또는 보급을 위한 중요한 과정을 촉진하기 위해 상호 작용해야 합니다 9,10. 광학 현미경은 곤충의 세포 구조를 관찰하는 데 사용할 수 있지만 비리온 분포, 바이러스 단백질과 곤충 단백질의 세포 국소화 또는 공동 국소화, 곤충 조직 및 세포의 미세 구조를 보여줄 수 없습니다. 면역형광 표지는 Coons et al.에 의해 특이적 플루오레세인 항체를 표지하는 방법으로 마우스의 식세포에서 처음 수행되었으며 현재는 널리 사용되고 있다11. 형광 항체 기술로도 알려진 면역 형광 기술은 개발 된 최초의 면역 학적 표지 기술 중 하나이며 항원과 항체11,12 사이의 특이 적 결합 반응을 기반으로합니다. 공지된 항체는 먼저 플루오레세인으로 표지되며, 이는 세포 또는 조직13,14에서 상응하는 항원을 검출하기 위한 프로브로서 사용된다. 플루오레세인 표지 항체가 세포 또는 조직의 해당 항원에 결합한 후 여기 파장을 조사하고 형광 현미경으로 볼 때 프로브는 밝은 형광을 방출하여 항원을 국소화합니다15.
식물 바이러스의 대부분의 벡터 곤충은 hemipterans입니다. 식물 바이러스에 대한 전염 효율이 높은 벡터 곤충의 개체군 밀도가 높을수록 바이러스 전염병이 발생할 수 있다5. 벼의 가장 심각한 병원균 중 하나인 남방벼 흑줄무늬난쟁이 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)는 동아시아와 동남아시아의 벼 재배 지역에 빠르게 퍼져 2010년 이후 심각한 수확량 손실을 초래했습니다16,17. 흰등받이식물호퍼(WBPH, Sogatella furcifera Horváth)의 성충과 님프는 SRBSDV를 고효율로 지속적으로 번식하는 방식으로 벼에 전달합니다. 현장 연구에 따르면 SRBSDV에 의해 유발된 벼 검은 줄무늬 왜소병의 발병은 일반적으로 SRBSDV 전염병의 중요한 요소인 WBPH의 대규모 장거리 이동과 일치합니다 7,8,18. VESICLE-associated membrane protein 7(VAMP7)은 소포 융합을 통해 물질의 수송을 매개할 수 있는 가용성 N-에틸말레이미드 민감 인자 부착 단백질 수용체(SNARE)입니다. VAMP7은 시험관 내에서 SRBSDV의 외부 주요 캡시드 단백질과 상호 작용하며, 이는 VAMP7이 바이러스 전파와 밀접하게 연관되어 있음을 나타냅니다16.
여기에 제시된 프로토콜에서 우리는 중장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지하기 위한 예로 독성 WBPH에서 장을 절제했습니다16. 바이러스의 초기 침입 부위인 중장 상피는 바이러스 감염, 복제 및 전파에 중요한 역할을 합니다. 먼저, 우리는 WBPH의 님프와 성인의 내장을 절제하는 단계를 자세히 설명했습니다. 둘째, 특정 플루오레세인 표지 항체를 사용하여 장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지했습니다. 그런 다음 레이저 주사 컨포칼 현미경을 통해 상피 세포와 비리온 및 VAMP7의 세포 위치를 관찰했습니다. 결과는 SRBSDV 비리온과 VAMP7이 중장 상피 세포의 세포질에서 공동 국소화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 VAMP7의 특정 기능이 중장 상피 세포에서 비리온의 보급과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

자연계의 대부분의 식물 바이러스는 hemipteran 곤충에 의해 한 식물에서 다른 식물로 전염됩니다. 바이러스 전파에 매우 효율적인 벡터 곤충의 높은 개체군 밀도는 현장에서 바이러스 전염병에 중요한 역할을 합니다. 바이러스-곤충 벡터 상호 작용을 연구하면 식물 바이러스와 그 벡터 곤충을 제어하기 위한 새로운 전략을 설계하기 위해 바이러스 전파 및 전염병에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 면역형광 표지는 병원체와 숙주 간의 상호작용을 분석하는 데 널리 사용되어 왔으며, 중장 상피 세포에서 비리온과 곤충 단백질을 찾기 위해 남부 쌀 검은 줄무늬 왜성 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)를 효율적으로 전달하는 흰등받이 식물호(WBPH, Sogatella furcifera)에서 사용됩니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 중장 상피 세포의 형태학적 특성, 곤충 단백질의 세포 국소화, 비리온과 곤충 단백질의 공동 국소화를 연구했습니다. 이 프로토콜은 곤충의 바이러스 활동, 곤충 단백질의 기능, 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1은 곤충 사육, 바이러스 획득, 장 절제, 면역형광 표지 및 슬라이드 제작과 같은 이 프로토콜의 모든 단계를 보여줍니다.
성인에서 절제된 WBPH 내장을 4%(m/v) 파라포름알데히드로 고정하고 2%(v/v) Triton X-100으로 투과시킨 다음 Dylight 633 팔로이딘10,18로 배양했습니다. 그림 2의 레이저 ?...

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Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

절제된 곤충 내장에서 식물 바이러스 단백질과 벡터 곤충 단백질 모두의 면역형광 표지를 위한 이 프로토콜은 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용, 곤충 단백질 기능 및 바이러스 전파의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

이 프로토콜은 곤충의 다양한 움직임, 곤충 단백질의 기능, 생체 내에서 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 효율적이고 유익합니다. 곤충 내장과 보조 세포의 구조는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 볼 때 명확하게 시각화됩니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Lu Zhang 박사가 될 것입니다. 시작하려면 유리 비커에서 독성이 없는 곤충을 신선한 남부 쌀 검은 줄무늬 난쟁이 바이러스, SRBSDV, 감염된 벼로 옮기고 이틀 간의 바이러스 획득 접근 기간 동안 방충망으로 덮여 있습니다. 그런 다음 신선한 쌀 묘목이 들어있는 유리 비커에 곤충을 모으십시오.이틀 후, 장의 해부 및 절제를위한 수동 흡인기기를 사용하여 유리 비커에서 곤충을 수집하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 0.01몰 PBS, 4% 파라포름알데히드 및 2% 트리톤 X-100을 준비합니다. 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 PBS를 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 광학 현미경의 무대에 놓습니다.수동 흡인기 사용 유리 비커에서 SRBSDV 감염 성인을 수집하고 얼음 위의 1.5 밀리리터 튜브에 넣어 곤충을 마비시킵니다. 마비 된 성인을 복부를 위로 올린 상태에서 슬라이드의 100 마이크로 리터의 PBS로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 본체를 고정하고 다른 핀셋 세트로 머리를 제거합니다.한 세트의 핀셋으로 복부의 측면을 고정하고 다른 세트로 꼬리의 산란관 또는 교합 기관을 고정시킨 다음 한 복부 세그먼트의 분절 간 막을 조심스럽게 당겨 복부의 내장을 천천히 노출시킵니다. 막을 계속 찢어 내고 복부에서 완전한 내장을 서서히 빼냅니다. 내장 끝에 연결된 꼬리를 부드럽게 당겨 전체 내장을 제거합니다.절제된 내장을 200마이크로리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 200마이크로리터의 PBS를 튜브에 넣고 피펫을 사용하여 내장을 철저히 씻습니다. 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 PBS를 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 광학 현미경의 무대에 놓습니다.수동 흡인기로 SRBSDV 감염 님프를 유리 비커에서 채취하여 얼음 위에 놓인 1.5 밀리리터 튜브에 넣어 곤충을 마비시킵니다. 마비 된 님프를 복부가 위를 향하게하여 슬라이드의 100 마이크로 리터의 완충액으로 옮깁니다. 님프의 꼬리를 떼어 낸 다음 곤충 몸체를 단단히 고정하여 부드럽게 고정하고 다른 쌍을 사용하여 머리를 고정하십시오.머리가 몸에서 분리되더라도 내장은 여전히 흉부와 복부에 붙어 있도록 장에 부착된 상태를 유지하면서 머리를 몸에서 부드럽게 잡아당깁니다. 핀셋이 여전히 몸을 고정하고 있는 상태에서 다른 쌍을 사용하여 머리를 조심스럽게 움직이고 점차적으로 내장을 빼냅니다. 몸을 손상시키지 않고 온전한 내장을 얻기 위해 머리에서 내장을 분리하십시오.절제된 내장을 튜브에 넣습니다. PBS를 튜브에 넣고 피펫으로 용액을 부드럽게 빨아들여 내장을 철저히 씻습니다. 본문 원고에 기술된 바와 같이 항체와 마운팅 배지를 준비한다.갓 절제하고 PBS 세척한 WBPH 내장을 실온에서 200마이크로리터 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 4% 파라포름알데히드에 넣습니다. 2시간 후, 파라포름알데히드 용액을 200 마이크로리터의 PBS로 교체한다. 10분 후, PBS를 제거하여 파라포름알데히드를 제거하고 PBS 세척 단계를 두 번 반복한다.PBS 세척 2회 후 200마이크로리터의 비이온성 세제 Triton X-100을 첨가하여 샘플을 실온에서 투과시킵니다. 30분 후 Triton X-100을 제거하고 PBS로 10분 세척 3회 세척하여 남아 있는 세제를 씻어냅니다. 표지된 항체 1 내지 50을 50 마이크로리터의 황소 혈청 알부민으로 희석한다.희석된 항체를 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 항체를 제거한 다음날 아침에, PBS로 10분간 3회 세척하여 남아있는 항체 희석액을 씻어낸다. 1마이크로리터의 DyLight 633-팔로이딘을 50마이크로리터의 PBS로 희석하고 50마이크로리터의 희석된 팔로이딘을 튜브에 추가하여 실온에서 2시간 동안 배양합니다.팔로이딘을 제거한 후 PBS로 10분 동안 3회 세척하여 남은 팔로이딘을 철저히 씻어냅니다. DAPI가 포함된 장착 매체 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓습니다. 내장을 배지로 옮기고 기포를 생성하지 않고 샘플 위에 커버 유리를 부드럽게 놓습니다.팔로이딘으로 표지한 후 성인의 절제된 WBPH 내장의 대표적인 레이저 스캐닝 공초점 현미경 사진은 전장, 중장 및 후장의 세 부분을 보여주었습니다. 이 중 중장은 SRBSDV의 초기 감염 부위입니다. 장의 단층 상피 세포 구조는 곤충 단백질의 세포 국소화 및 바이러스 및 곤충 단백질의 공동 국소화 연구를 용이하게합니다.DyLight 488 표지 항-VAMP-7 및 DyLight 549 표지 항-SRBSDV 항체가 포함된 SRBSDV 비리온이 포함된 절제된 WBPH 내장이 여기에 표시됩니다. VAMP-7 및 SRBSDV 비리온은 세포질에서 공동 국소화되는 것으로 나타났으며, 이는 VAMP-7이 생체 내에서 바이러스 전파에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 투과화된 내장은 루시페린 접합 항체로 배양한 후 철저히 세척하여 배경과 비특이적 결합을 줄여야 합니다.이것은 곤충에서 바이러스, 기타 병원체 및 곤충 단백질의 국소화를 볼 수 있는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 그것은 병원체와 곤충 사이의 관계에 대한 추가 연구의 기초를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

연구

생물학

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...