Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (31630058 til X.W. og 31772134 til W.L.).

1. Ikke-viruliferous insektoppdrett
<ol><li>Samle WBPHs fra rismarker og bak med risplanter i 1 L glassbeger dekket med insektsikkert nett i en inkubator ved 28 ° C med 16 t lys og 8 h mørk. Fordi SRBSDV ikke overføres via egg, er nyklekte nymfer ikke viruliferous.</li>
	<li>Med en penselpenn børster du forsiktig insekter fra begeroppdrettsinsektene i et nytt beger med ferske risplanter hver uke til WBPH-nymfene har klekket. Fortsett oppdrett disse klekkede nonviruliferous nymfer til 2- eller 3-instar. NOTAT: B?...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

For best resultat, bør noen viktige punkter vurderes. For det første er et høyt forhold av viruliferous insekter blant den totale befolkningen nødvendig. Selv om minimum AAP for SRBSDV av WBPH-nymfer og voksne er 5 min17, bør insektene få lov til å mate på friske SRBSDV-infiserte risplanter i 2 d for å oppnå en oppkjøpseffektivitet på opptil 80%. Siden SRBSDV-virionene kan påvises i 80% av midguts18, fjernet og merket vi viruliferous insekter ved 2 d etter en 2...

De fleste beskrevne plantevirus overføres av insekter fra ordenen Hemiptera som inkluderer bladlus, hvitefugler, bladhoppere, plantehoppere og trips 1,2. De piercing-sugende munndelene av hemipteraninsekter gjennomsyrer plantevevet for fôring og utskillelse av spytt, samtidig som viruset overføres effektivt2. Ulike overføringsmekanismer av plantevirus av vektorinsekter er beskrevet. Disse inkluderer ikke-vedvarende, semipersistent og vedvarende. Den vedvarende typen er enten ikke-propagativ eller propagativ3,4, men for begge disse typene må det overførte viruset bevege seg gjennom hele insektets kropp. I vedvarende-propagativ modus infiserer virus først og replikerer i epitelceller i insektets tarm, forplanter seg deretter i forskjellige vev, og til slutt inn i spyttkjertlene, hvorfra de deretter kan innføres i en plante gjennom spytt under insektfôring 5,6. Vedvarende overførte virus beveger seg gjennom forskjellige organer og replikerer i insektvektorene, noe som krever spesifikke interaksjoner mellom virus- og vektorkomponenter i forskjellige stadier 7,8.
Virale proteiner og insektproteiner må samhandle for å lette kritiske prosesser for virusgjenkjenning, infeksjon, replikasjon eller spredning i vektorinsekter 9,10. Selv om optisk mikroskopi kan brukes til å observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller kolokalisering av virale proteiner og insektprotein, eller ultrastruktur av insektvev og celler. Immunfluorescensmerking ble først utført av Coons et al. i fagocytiske celler i musen ved å merke spesifikke fluoresceinantistoffer, og nå brukes den mye11. Immunfluorescensteknikken, også kjent som fluorescensantistoffteknikken, er en av de tidligste immunologiske merkingsteknikkene som er utviklet og er basert på den spesifikke bindingsreaksjonen mellom antigenet og antistoffet11,12. Det kjente antistoffet er først merket med fluorescein, som brukes som en sonde for å oppdage de tilsvarende antigenene i cellene eller vevene13,14. Etter at det fluoresceinmerkede antistoffet binder seg til det tilsvarende antigenet i celler eller vev, vil sonden avgi lys fluorescens når den bestråles med eksitasjonsbølgelengder og ses med et fluorescensmikroskop for å lokalisere antigenet15.
De fleste vektorinsekter av plantevirus er hemipteraner. En høyere befolkningstetthet av vektorinsekter som har høy overføringseffektivitet for planteviruset kan føre til virusepidemier5. Sørlig ris svart stripete dvergvirus (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), en av de mest alvorlige patogener av ris, har raskt spredt seg gjennom risvoksende områder i Øst- og Sørøst-Asia, og forårsaket alvorlige avkastningstap siden 201016,17. Voksne og nymfer av hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende propagativ måte med høy effektivitet. Feltstudier har vist at utbrudd av SRBSDV-indusert ris svart stripete dvergsykdom vanligvis sammenfaller med masse langdistansemigrasjon av WBPHs, en avgjørende faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikkelassosiert membranprotein 7 (VAMP7) er en løselig N-etylmaleimidsensitiv faktorfesteproteinreseptor (SNARE), som kan formidle transport av stoffer via vesikkelfusjon. VAMP7 interagerer med det ytre store kapsidproteinet til SRBSDV in vitro, noe som indikerer at VAMP7 kan være nært forbundet med virusoverføring16.
I protokollen som presenteres her, fjernet vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midttarmepitelceller16. Som det første invasjonsstedet for virus, spiller midttarmepitelet viktige roller i virusinfeksjon, replikasjon og overføring. Først detaljerte vi trinnene for å skille tarmen fra nymfer og voksne av WBPHs. For det andre brukte vi spesifikke fluoresceinmerkede antistoffer for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Deretter observerte vi epitelceller og den cellulære plasseringen av virionene og VAMP7 via et laserskanning konfokalmikroskop. Resultatene viste at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne samlokaliseres i cytoplasmaet til midttarmepitelcellene, noe som tyder på at den spesifikke funksjonen til VAMP7 kan være relatert til spredning av virioner fra midttarmepitelceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en annen av hemipteran insekter. En høy befolkningstetthet av vektorinsekter som er svært effektive ved virusoverføring, spiller en nøkkelrolle i virusepidemier i felt. Studier av virus-insektvektorinteraksjoner kan fremme vår forståelse av virusoverføring og epidemier med sikte på å designe nye strategier for å kontrollere plantevirus og deres vektorinsekter. Immunfluorescensmerking har blitt mye brukt til å analysere interaksjoner mellom patogener og verter og brukes her i hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører det sørlige risstripete dvergviruset (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), for å lokalisere virionene og insektproteinene i midttarmepitelcellene. Ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi studerte vi de morfologiske egenskapene til midttarmepitelceller, cellulær lokalisering av insektproteiner og samlokalisering av virioner og et insektprotein. Denne protokollen kan brukes til å studere virusaktiviteter hos insekter, funksjoner av insektproteiner og interaksjoner mellom virus og vektorinsekt.

Figur 1 illustrerer alle trinnene i denne protokollen: insektoppdrett, virusoppkjøp, eksisjon av tarmen, immunfluorescerende merking og fremstilling av lysbildet.
Utskåret WBPH-tarm fra voksne ble fiksert i 4% (m / v) paraformaldehyd, permeabilisert med 2% (v / v) Triton X-100, og deretter inkubert med Dylight 633 phalloidin10,18. Laserskanningens konfokalmikrograf i figur 2...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Denne protokollen for immunfluorescerende merking av både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i utskåret insekttarm kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus- og vektorinsekter, insektproteinfunksjoner og molekylære mekanismer som ligger til grunn for virusoverføring.

Immunfluorescerende merking av plantevirus og insektvektorproteiner i hemipteran tarm

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Denne protokollen kan brukes til å studere ulike bevegelser i insekter, funksjoner av insektproteiner og interaksjoner mellom virus og vektorinsekt in vivo. Denne metoden er effektiv og informativ. Strukturene i insekttarmen og hjelpecellene visualiseres tydelig når de ses med laserskanning konfokalmikroskopi.Demonstrere prosedyren vil være Lu Zhang, PhD fra vårt laboratorium. For å begynne, overfør ikke-viruliferous insekter fra glassbeger til fersk sørlig ris svart stripet dvergvirus, SRBSDV, infiserte risplanter dekket med et insektsikkert nett for en to-dagers virusoppkjøpstilgangsperiode. Deretter samles insekter i glassbeger som inneholder friske risplanter.Etter to dager, samle insekter fra glassbegerene ved hjelp av en manuell aspirator for disseksjon og utskjæring av tarmen. Forbered 0,01 molar PBS, 4% paraformaldehyd og 2% Triton X-100 som beskrevet i tekstmanuskriptet. Bruk en pipetter til å plassere 100 mikroliter PBS på et lysbilde og plasser lysbildet på scenen av et optisk mikroskop.Bruk manuell aspirator til å samle SRBSDV-infiserte voksne fra glassbegerene og legg dem i et 1,5 milliliter rør på is for å lamme insektene. Overfør en lammet voksen inn i 100 mikroliter PBS på lysbildet med magen opp. Bruk pinsett til å klemme kroppen og fjerne hodet med et annet sett med pinsett.Med ett sett pinsett, klem sidene av magen og klem ovipositoren eller det kopulerende organet i halen med det andre settet, og trekk deretter forsiktig den intersegmentale membranen i ett buksegment for sakte å eksponere tarmen i magen. Fortsett å rive bort membranen og trekk gradvis ut hele tarmen fra magen. Trekk forsiktig av halen som er koblet til enden av tarmen for å fjerne hele tarmen.Plasser utskåret tarm i et 200 mikroliter sentrifugerør. Legg 200 mikroliter PBS til røret og bruk en pipette for å vaske tarmene grundig. Bruk en pipetter til å plassere 100 mikroliter PBS på et lysbilde og plasser lysbildet på scenen av et optisk mikroskop.Bruk manuell aspirator til å samle SRBSDV-infiserte nymfer fra glassbeger og legg dem i 1,5 milliliter rør plassert på is for å lamme insekter. Overfør en lammet nymfe til 100 mikroliter buffer på lysbildet med magen vendt oppover. Løsne halen på nymfen, klem deretter insektslegemet for å fikse det forsiktig og bruk det andre paret til å klemme hodet.Trekk hodet forsiktig bort fra kroppen mens du fortsatt opprettholder vedlegget til tarmen slik at hodet løsnes fra kroppen, men tarmen er fortsatt festet til brystkassen og magen. Med pinsetten fortsatt klemmer kroppen, bruk det andre paret til å bevege hodet forsiktig og gradvis trekke ut tarmen. Løsne tarmen fra hodet for å få en intakt tarm uten å skade kroppen.Plasser den utskårne tarmen i et rør. Tilsett PBS i røret og sug forsiktig løs løsningen med en pipette for å vaske tarmene grundig. Forbered antistoffene og monteringsmediet som beskrevet i tekstmanuskriptet.Plasser de nyskårne og PBS-vaskede WBPH-tarmene i 100 mikroliter 4% paraformaldehyd i et 200 mikroliter sentrifugerør ved romtemperatur. Etter to timer, erstatt paraformaldehydoppløsningen med 200 mikroliter PBS. Etter 10 minutter, fjern PBS for å eliminere paraformaldehyd og gjenta PBS-vasketrinnet to ganger.Etter to PBS-vasker, tilsett 200 mikroliter ikke-ionisk vaskemiddel Triton X-100 for å permeabilisere prøvene ved romtemperatur. Etter 30 minutter, fjern Triton X-100 og vask bort gjenværende vaskemiddel med tre 10-minutters vask med PBS. Fortynn de merkede antistoffene en til 50 med 50 mikroliter bull serum albumin.Legg de fortynnede antistoffene til røret og inkuber prøvene over natten ved fire grader Celsius. Morgenen etter fjerning av antistoffet, vask bort det gjenværende antistofffortynningsmiddelet med tre 10-minutters vask med PBS. Fortynn en mikroliter DyLight 633-Phalloidin med 50 mikroliter PBS og tilsett 50 mikroliter fortynnet phalloidin til røret for en to-timers inkubasjon ved romtemperatur.Etter fjerning av phalloidin, vask grundig bort det gjenværende phalloidin med tre 10-minutters vasker med PBS. Plasser en dråpe monteringsmedium som inneholder DAPI på et lysbilde i mikroskop. Overfør innvollene til mediet og legg dekselglasset forsiktig over prøven uten å skape bobler.Den representative laserskanningen konfokal mikrografi av utskåret WBPH-tarm fra voksne etter merking med falloidin viste tre seksjoner: foregut, midgut og hindgut. Blant disse er midttarm det første infeksjonsstedet for SRBSDV. Den monolags epitelcellestrukturen i tarmen letter studiet av cellulær lokalisering av insektproteiner og samlokalisering av virale og insektproteiner.Utskåret WBPH tarm med DyLight 488 merket anti-VAMP-7 og SRBSDV virioner med DyLight 549 merket anti-SRBSDV antistoff er vist her. VAMP-7 og SRBSDV virioner ble vist å samlokalisere i cytoplasma, noe som tyder på at VAMP-7 kan spille en rolle i virusoverføring in vivo. Permeabilisert tarm bør rengjøres grundig etter inkubering med luciferinkonjugerte antistoffer for å redusere bakgrunnen og ikke-spesifikk binding.Dette er en pålitelig metode for å se lokalisering av virus, andre patogener og insektproteiner i insekter. Det gir grunnlag for videre studier av forholdet mellom patogener og insekter.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiske Recordings og RNA sekvensering av Gustatory vedheng av Yellow-feber Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

En komparativ analyse av rekombinant protein uttrykk i ulike Biofactories: Bakterier, insektsceller og plantesystemer

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Høy throughput CRISPR Vector Konstruksjon og karakterisering av DNA-Modifikasjoner av Generation of Tomato Hårete Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Forbigående Expression og cellulær lokalisering av rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Direkte Agroinoculation av Maize Seedlings ved injeksjon med Rekombinant Foxtail Mosaic Virus og Sugarcane Mosaic Virus Infectious Kloner

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunfluoreserende farging for visualisering av Heterochromatin assosierte proteiner i Drosophila spyttkjertler

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...