Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630058 para X.W. e 31772134 para W.L.).

1. Criação de insetos não virulíferos
<ol><li>Coletar WBPHs de campos de arroz e traseira com mudas de arroz em copos de vidro de 1 L cobertos com rede à prova de insetos em uma incubadora a 28 °C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Como o SRBSDV não é transmitido através de ovos, as ninfas recém-eclodidas não são virulíferas.</li>
	<li>Com uma caneta de escova, escove suavemente os insetos do copo que cria insetos em um novo copo de mudas de arroz fresco a cada semana até que as ninfas WBPH tenham eclod...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

Para melhores resultados, alguns pontos-chave devem ser considerados. Primeiro, uma alta proporção de insetos virulíferos entre a população total é necessária. Embora o AAP mínimo para SRBSDV por ninfas e adultos WBPH seja de 5 min17, os insetos devem ser autorizados a se alimentar de plantas de arroz frescas infectadas com SRBSDV por 2 d para alcançar uma eficiência de aquisição de até 80%. Como os virions SRBSDV podem ser detectados em 80% dos intestinos médios18<...

A maioria dos vírus de plantas descritos é transmitida por insetos da ordem Hemiptera que inclui pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes 1,2. As partes bucais sugadoras de insetos hemípteros perfuram o tecido vegetal para alimentação e secreção de saliva, concomitantemente transmitindo eficientemente o vírus2. Diferentes mecanismos de transmissão de vírus de plantas por insetos vetores têm sido descritos. Estes incluem não persistente, semipersistente e persistente. O tipo persistente é não propagativo ou propagativo3,4, mas para ambos os tipos, o vírus transmitido deve se mover por todo o corpo do inseto. No modo persistente-propagativo, os vírus inicialmente infectam e se replicam nas células epiteliais do intestino do inseto, depois se disseminam em diferentes tecidos e, finalmente, nas glândulas salivares, de onde podem ser introduzidos em uma planta através da saliva durante a alimentação do inseto 5,6. Os vírus transmitidos persistentemente movem-se através de diferentes órgãos e se replicam em seus insetos vetores, o que requer interações específicas entre o vírus e os componentes do vetor em diferentes estágios 7,8.
Proteínas virais e proteínas de insetos devem interagir para facilitar processos críticos de reconhecimento, infecção, replicação ou disseminação do vírus nos insetos vetores 9,10. Embora a microscopia óptica possa ser usada para observar estruturas celulares em insetos, ela não pode mostrar a distribuição do virion, a localização celular ou colocalização de proteínas virais e proteínas de insetos, ou a ultraestrutura de tecidos e células de insetos. A marcação por imunofluorescência foi realizada inicialmente por Coons e col. em células fagocíticas de camundongos por meio da marcação de anticorpos específicos contra a fluoresceína, e atualmente é amplamente utilizada11. A técnica de imunofluorescência, também conhecida como técnica de fluorescência de anticorpos, é uma das primeiras técnicas de marcação imunológica desenvolvidas e baseia-se na reação de ligação específica entre o antígeno e o anticorpo11,12. O anticorpo conhecido é primeiramente marcado com fluoresceína, que é usada como sonda para detectar os antígenos correspondentes nas células ou tecidos13,14. Após o anticorpo marcado com fluoresceína se ligar ao antígeno correspondente em células ou tecidos, a sonda emitirá fluorescência brilhante quando irradiada com comprimentos de onda de excitação e visualizada com um microscópio de fluorescência para localizar o antígeno15.
A maioria dos insetos vetores de vírus de plantas são hemípteros. Uma maior densidade populacional de insetos vetores que apresentam alta eficiência de transmissão do vírus vegetal pode levar a epidemias virais5. O Southern rice black srakeed dwarf virus (SRBSDV, gênero Fijivirus, família Reoviridae), um dos patógenos mais graves do arroz, tem se espalhado rapidamente por áreas de cultivo de arroz no leste e sudeste da Ásia e causado sérias perdas de rendimento desde 201016,17. Adultos e ninfas da cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmitem SRBSDV ao arroz de forma persistente-propagativa com alta eficiência. Estudos de campo têm mostrado que surtos da doença anã estriada do arroz induzida pelo SRBSDV geralmente coincidem com a migração em massa de HPBHs, um fator crucial em epidemias de SRBSDV 7,8,18. A proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) é um receptor solúvel da proteína de ligação ao fator sensível à N-etilmaleimida (SNARE), que pode mediar o transporte de substâncias via fusão vesicular. O VAMP7 interage com a proteína do capsídeo principal externo do SRBSDV in vitro, o que indica que o VAMP7 pode estar intimamente associado à transmissão do vírus16.
No protocolo aqui apresentado, extirpamos o intestino de WBPH virulífera como exemplo para marcar virions SRBSDV e VAMP7 em células epiteliais do intestinomédio16. Como local inicial de invasão do vírus, o epitélio do intestino médio desempenha papéis vitais na infecção, replicação e transmissão do vírus. Primeiramente, detalhamos os passos para excisar o intestino de ninfas e adultos de WBPHs. Em segundo lugar, usamos anticorpos específicos marcados com fluoresceína para marcar os virions SRBSDV e VAMP7 em células epiteliais intestinais. Em seguida, observamos as células epiteliais e a localização celular dos virions e VAMP7 através de um microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que os virions SRBSDV e VAMP7 podem colocalizar no citoplasma das células epiteliais do intestino médio, sugerindo que a função específica do VAMP7 pode estar relacionada à disseminação de vírions a partir de células epiteliais do intestino médio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

A maioria dos vírus de plantas na natureza é transmitida de uma planta para outra por insetos hemípteros. Uma alta densidade populacional de insetos vetores, que são altamente eficientes na transmissão do vírus, desempenha um papel fundamental nas epidemias de vírus nos campos. O estudo das interações vírus-insetos vetoriais pode avançar na compreensão da transmissão de vírus e epidemias com o objetivo de desenhar novas estratégias para controlar vírus de plantas e seus insetos vetores. A marcação por imunofluorescência tem sido amplamente utilizada para analisar interações entre patógenos e hospedeiros e é usada aqui na cigarrinha-de-dorso-branco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente o vírus anão estriado do arroz do sul (SRBSDV, gênero Fijivirus, família Reoviridae), para localizar os virions e proteínas de insetos nas células epiteliais do intestino médio. Usando microscopia confocal de varredura a laser, estudamos as características morfológicas de células epiteliais do intestino médio, a localização celular de proteínas de insetos e a colocalização de virions e uma proteína de inseto. Este protocolo pode ser usado para estudar atividades virais em insetos, funções de proteínas de insetos e interações entre vírus e inseto vetor.

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição do vírus, excisão do intestino, marcação por imunofluorescência e confecção da lâmina.
Intestinos WBPH excisados de adultos foram fixados em paraformaldeído a 4% (m/v), permeabilizados com Triton X-100 a 2% (v/v) e, em seguida, incubados com faloidina Dylight 63310,18. A micrografia confocal de varredura a laser ...

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Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.

Marcação por imunofluorescência de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de Hemiptera

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Este protocolo pode ser usado para estudar vários movimentos em insetos, funções de proteínas de insetos e interações entre vírus e inseto vetor in vivo. Este método é eficiente e informativo. As estruturas do intestino do inseto e das células auxiliares são claramente visualizadas quando visualizadas com a microscopia confocal de varredura a laser.Quem demonstrará o procedimento será Lu Zhang, PhD do nosso laboratório. Para começar, transfira insetos não virulíferos de copos de vidro para o vírus anão fresco do sul do arroz, SRBSDV, plantas de arroz infectadas cobertas com uma rede à prova de insetos por um período de acesso de aquisição de vírus de dois dias. Em seguida, colete os insetos em copos de vidro contendo mudas frescas de arroz.Após dois dias, coletar os insetos dos copos de vidro usando um aspirador manual para dissecção e excisão do intestino. Preparar PBS 0,01 molar, paraformaldeído a 4% e Tritão X-100 a 2%, conforme descrito no manuscrito do texto. Use um pipetter para colocar 100 microlitros de PBS em uma lâmina de vidro e coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.Use aspirador manual para coletar os adultos infectados SRBSDV dos copos de vidro e colocá-los em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo para paralisar os insetos. Transfira um adulto paralisado para os 100 microlitros de PBS na lâmina com o abdômen para cima. Use uma pinça para prender o corpo e remover a cabeça com outro conjunto de pinças.Com um conjunto de pinças, prenda os lados do abdome e prenda o ovipositor ou o órgão copulatório da cauda com o outro conjunto, em seguida, puxe cuidadosamente a membrana intersegmentar de um segmento abdominal para expor lentamente o intestino no abdômen. Continue rasgando a membrana e gradualmente retire o intestino completo do abdômen. Puxe suavemente a cauda que está conectada à extremidade do intestino para remover o intestino completo.Coloque as vísceras excisadas em um tubo de centrífuga de 200 microlitros. Adicione 200 microlitros de PBS ao tubo e use uma pipeta para lavar bem as vísceras. Use um pipetter para colocar 100 microlitros de PBS em uma lâmina de vidro e coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico.Use aspirador manual para coletar as ninfas infectadas pelo SRBSDV de copos de vidro e coloque-as em tubo de 1,5 mililitro colocado no gelo para paralisar os insetos. Transfira uma ninfa paralisada para os 100 microlitros de tampão na lâmina com o abdômen voltado para cima. Desprenda a cauda da ninfa, em seguida, prenda o corpo do inseto para fixá-lo suavemente e use o outro par para prender a cabeça.Puxe suavemente a cabeça para longe do corpo, mantendo sua fixação ao intestino para que a cabeça esteja desprendida do corpo, mas o intestino ainda está preso ao tórax e ao abdômen. Com a pinça ainda apertando o corpo, use o outro par para mover a cabeça com cuidado e gradualmente puxe o intestino. Separe o intestino da cabeça para obter um intestino intacto sem danificar o corpo.Coloque as vísceras excisadas em um tubo. Adicione PBS ao tubo e suge suavemente a solução com uma pipeta para lavar bem as vísceras. Preparar os anticorpos e o meio de montagem conforme descrito no manuscrito do texto.Coloque as vísceras WBPH recém-excisadas e lavadas em PBS em 100 microlitros de paraformaldeído a 4% em um tubo centrífugo de 200 microlitros à temperatura ambiente. Após duas horas, substituir a solução de paraformaldeído por 200 microlitros de PBS. Após 10 minutos, remova o PBS para eliminar qualquer paraformaldeído e repita a etapa de lavagem PBS duas vezes.Após duas lavagens com PBS, adicionar 200 microlitros de detergente não iônico Triton X-100 para permeabilizar as amostras à temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o Triton X-100 e lave qualquer detergente restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Diluir os anticorpos marcados de um a 50 com 50 microlitros de albumina de soro de touro.Adicione os anticorpos diluídos ao tubo e incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã após a remoção do anticorpo, lave o diluente de anticorpos restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Diluir um microlitro de DyLight 633-Phalloidin com 50 microlitros de PBS e adicionar 50 microlitros de faloidina diluída ao tubo para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente.Depois de remover a faloidina, lave bem a faloidina restante com três lavagens de 10 minutos com PBS. Coloque uma gota de meio de montagem contendo DAPI em uma lâmina de microscópio. Transfira as vísceras para o meio e coloque suavemente o vidro de cobertura sobre a amostra sem criar bolhas.A micrografia confocal representativa de varredura a laser de intestinos WBPH excisados de adultos após marcação com faloidina mostrou três seções: intestino anterior, intestino médio e intestino posterior. Dentre estes, o intestino médio é o sítio inicial de infecção do SRBSDV. A estrutura celular epitelial monocamada do intestino facilita o estudo da localização celular de proteínas de insetos e colocalização de proteínas virais e de insetos.Intestinos WBPH excisados com DyLight 488 marcado anti-VAMP-7 e virions SRBSDV com anticorpo anti-SRBSDV marcado com DyLight 549 são mostrados aqui. Os virions VAMP-7 e SRBSDV foram mostrados para co-localizar no citoplasma, sugerindo que VAMP-7 pode desempenhar um papel na transmissão do vírus in vivo. Os intestinos permeabilizados devem ser cuidadosamente limpos após a incubação com anticorpos conjugados de luciferina para reduzir o fundo e a ligação inespecífica.Este é um método confiável para ver a localização de vírus, outros patógenos e proteínas de insetos em insetos. Ele fornece a base para novos estudos da relação entre patógenos e insetos.

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Mancha imunofluorescente para visualização de proteínas associadas à heterocromatina em glândulas salivares drosophila

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...