Name: immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts
Uploaded: 2021-05-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31630058 по X.W. и 31772134 по W.L.).

1. Выращивание невирулиферных насекомых
<ol><li>Соберите WBPH с рисовых полей и вырастите вместе с рассадой риса в стеклянных стаканах объемом 1 л, покрытых сеткой от насекомых, в инкубаторе при температуре 28 ° C при 16 ч света и 8 ч темноты. Поскольку SRBSDV не передается через яйца, только что выл?...

<ol>
	<li>Nault, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+transmission+of+plant+viruses:+a+new+synthesis.">Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis.</a> Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).</li><li>Mitchell, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroptera+as+vectors+of+plant+pathogens.">Heteroptera as vectors of plant pathogens.</a> Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).</li><li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-virus+interactions+in+a+plant+host+and+in+a+hemipteran+vector:+Implications+for+vector+fitness+and+virus+epidemics.">Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics.</a> Virus Research. 286, 198069 (2020).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Hogenhout, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector-mediated+transmission+of+plant+viruses.">Insect vector-mediated transmission of plant viruses.</a> Virology. 479, 278-289 (2015).</li><li>Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+black-streaked+dwarf+virus:+from+multiparty+interactions+among+plant-virus-vector+to+intermittent+epidemics.">Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics.</a> Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).</li><li>Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+vector+transmission+and+epidemiology+of+plant-infecting+fijiviruses.">Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).</li><li>Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+the+transmission+mechanism+of+tenuiviruses+by+their+vector+insects.">New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects.</a> Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).</li><li>Qin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+midgut+epithelial+cells+by+a+persistently+transmitted+virus+is+mediated+by+sugar+transporter+in+its+insect+vector.">Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector.</a> PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).</li><li>Barnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+fluorescence+immunoassays.">The development of fluorescence immunoassays.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+c-Jun+N-terminal+kinase+pathway+of+a+vector+insect+is+activated+by+virus+capsid+protein+and+promotes+viral+replication.">The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication.</a> eLife. 6, 26591 (2017).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-Based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks.">TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).</li><li>Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sogatella+furcifera+proteome+that+interact+with+P10+protein+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Scientific Reports. 6, 32445 (2016).</li><li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+characteristics+of+Southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+by+rice+planthoppers.">Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers.</a> Crop Protection. 41, 71-76 (2012).</li><li>Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+viral+dissemination+from+the+midgut+determines+incompetence+of+small+brown+planthopper+as+a+vector+of+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus.">Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus.</a> Virus Research. 167, 404-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+application+of+the+antibodies+of+Sogatella+furcifera+VAMP7+and+Vti1a+proteins+in+expressed+in+Escherichia+coli.">Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli.</a> Plant Protection. 47, 55-60 (2021).</li><li>Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).</li><li>Tsai, J., Perrier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+digestive+and+reproductive+systems+of+Dalbulus+maidis+and+Graminella+nigrifrons+(Homoptera:+Cicadellidae).">Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae).</a> Fla Entomology. 79, 563 (1996).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Kruse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining'omics+and+microscopy+to+visualize+interactions+between+the+Asian+citrus+psyllid+vector+and+the+Huanglongbing+pathogen+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+in+the+insect+gut.">Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut.</a> PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).</li><li>Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quenching+autofluorescence+of+insect+tissues+for+in+situ+detection+of+endosymbionts.">Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts.</a> Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).</li></ol>

Для достижения наилучших результатов следует учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо высокое соотношение вирулентных насекомых от общей численности населения. Несмотря на то, что минимальный AAP для SRBSDV нимфами и взрослыми особями WBPH составляет 5 мин17,...

Большинство описанных вирусов растений передаются насекомыми из отряда Hemiptera, который включает тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов 1,2. Колюще-сосущий ротовой аппарат полужесткокрылых насекомых прокалывает растительную ткань для питания и выделения слюны, одновременно эффективно передавая вирус2. Описаны различные механизмы передачи вирусов растений насекомыми-переносчиками. К ним относятся нестойкие, полуперсистирующие и персистирующие. Персистирующий тип является либо неразмножающимся, либо размножающимся3,4, но для обоих этих типов передаваемый вирус должен перемещаться по всему телу насекомого. При персистирующе-размножении вирусы сначала заражают и размножаются в эпителиальных клетках кишечника насекомого, затем распространяются в различные ткани и, в конечном итоге, в слюнные железы, откуда затем могут быть введены в растение через слюну во время кормления насекомого 5,6. Персистирующие передаваемые вирусы перемещаются через разные органы и размножаются в своих насекомых-переносчиках, что требует специфических взаимодействий между компонентами вируса и вектора на разных стадиях 7,8.
Вирусные белки и белки насекомых должны взаимодействовать, чтобы облегчить критические процессы распознавания, заражения, репликации или распространения вирусов у насекомых-переносчиков 9,10. Хотя оптическая микроскопия может быть использована для наблюдения клеточных структур у насекомых, она не может показать распределение вирионов, клеточную локализацию или колокализацию вирусных белков и белка насекомых или ультраструктуру тканей и клеток насекомых. Иммунофлюоресцентное мечение было впервые выполнено Coons et al. в фагоцитарных клетках мыши посредством мечения специфических флуоресцеиновых антител, а теперь оно широко используется11. Метод иммунофлуоресценции, также известный как метод флуоресцентных антител, является одним из самых ранних разработанных методов иммунологической маркировки и основан на специфической реакции связывания между антигеном и антителом11,12. Известное антитело сначала мечают флуоресцеином, который используется в качестве зонда для обнаружения соответствующих антигенов в клетках или тканях13,14. После того, как меченное флуоресцеином антитело связывается с соответствующим антигеном в клетках или тканях, зонд будет излучать яркую флуоресценцию при облучении длинами волн возбуждения и просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа для локализации антигена15.
Большинство насекомых-переносчиков вирусов растений являются полужесткокрылыми. Более высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, обладающих высокой эффективностью передачи вируса растений, может привести к вирусным эпидемиям5. Южный вирус черного карликового риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), один из самых серьезных патогенов риса, быстро распространился по районам выращивания риса в Восточной и Юго-Восточной Азии и вызвал серьезные потери урожая с 2010 года16,17. Взрослые особи и нимфы белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) передают SRBSDV рису стойким способом размножения с высокой эффективностью. Полевые исследования показали, что вспышки SRBSDV-индуцированной болезни карликов риса с черными полосами обычно совпадают с массовой миграцией WBPH на большие расстояния, что является решающим фактором эпидемий SRBSDV 7,8,18. Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) представляет собой растворимый рецептор белка прикрепления N-этилмалеимида, чувствительного к фактору присоединения (SNARE), который может опосредовать транспорт веществ посредством слияния везикул. VAMP7 взаимодействует с внешним основным капсидным белком SRBSDV in vitro, что указывает на то, что VAMP7 может быть тесно связан с передачей вируса16.
В протоколе, представленном здесь, мы исключили кишечник из вирулиферного WBPH в качестве примера для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках средней кишки16. Эпителий средней кишки, как начальное место инвазии вируса, играет жизненно важную роль в заражении, репликации и передаче вируса. Во-первых, мы подробно описали шаги по удалению кишечника у нимф и взрослых особей WBPH. Во-вторых, мы использовали специфические антитела, меченные флуоресцеином, для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках кишечника. Затем мы наблюдали эпителиальные клетки и клеточное расположение вирионов и VAMP7 с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Результаты показали, что вирионы SRBSDV и VAMP7 могут колокализоваться в цитоплазме эпителиальных клеток средней кишки, предполагая, что специфическая функция VAMP7 может быть связана с распространением вирионов из эпителиальных клеток средней кишки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Bull serum albumin (BSA)</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1331</td>
			<td>Dilute antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0771-18*18mm</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Beitja</td>
			<td>XTL-7045B1</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM880</td>
			<td>Observe fluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ZBP-7105</td>
			<td>For slide making</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td>Label cell necleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>For tissues fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>A22284</td>
			<td>Label actin of midgut epithiels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0290C484</td>
			<td>For tissues permeation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers (5-SA)</td>
			<td>AsOne</td>
			<td>6-7905-40</td>
			<td>For insect dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling of plant virus and insect vector proteins in hemipteran guts

Большинство вирусов растений в природе передаются от одного растения к другому полужесткокрылыми насекомыми. Высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, которые очень эффективны при передаче вируса, играет ключевую роль в вирусных эпидемиях на полях. Изучение взаимодействия вирусов и насекомых-переносчиков может способствовать нашему пониманию передачи вирусов и эпидемий с целью разработки новых стратегий борьбы с вирусами растений и их насекомыми-переносчиками. Иммунофлуоресцентная маркировка широко используется для анализа взаимодействия между патогенами и хозяевами и используется здесь у белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera), который эффективно передает южный вирус черного карлика риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), чтобы найти вирионы и белки насекомых в эпителиальных клетках средней кишки. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изучены морфологические характеристики эпителиальных клеток средней кишки, клеточная локализация белков насекомых, колокализация вирионов и белка насекомого. Этот протокол может быть использован для изучения активности вирусов у насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком.

На рисунке 1 показаны все этапы этого протокола: выращивание насекомых, приобретение вируса, иссечение кишечника, иммунофлуоресцентная маркировка и изготовление слайда.
Иссеченные кишки WBPH взрослых людей фиксировали в 4% (м/об) параформальдегиде, пермеаб?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts at JoVE.com

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Этот протокол иммунофлуоресцентной маркировки как белков растительных вирусов, так и белков-векторов насекомых в иссеченных кишках насекомых может быть использован для изучения взаимодействий между вирусными и насекомыми-переносчиками, функций белков насекомых и молекулярных механизмов, лежащих в основе передачи вируса.

Иммунофлюоресцентная маркировка белков вирусов растений и насекомых-векторов в полужесткокрылых кишках

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Этот протокол может быть использован для изучения различных движений насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком in vivo. Этот метод эффективен и информативен. Структуры кишечника насекомых и вспомогательных клеток четко визуализируются при просмотре с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.Продемонстрирует процедуру Лу Чжан, доктор философии из нашей лаборатории. Для начала перенесите невирулентных насекомых из стеклянных стаканов на свежий южный рис с черными полосами карликового вируса, SRBSDV, зараженные растения риса, покрытые сеткой, защищающей от насекомых, в течение двухдневного периода доступа к заражению вирусом. Затем соберите насекомых в стеклянные стаканы, содержащие свежие проростки риса.Через двое суток соберите насекомых из стеклянных стаканов с помощью ручного аспиратора для вскрытия и иссечения кишечника. Приготовьте 0,01 моляра PBS, 4% параформальдегида и 2% Triton X-100, как описано в текстовой рукописи. С помощью пипетки поместите 100 микролитров PBS на предметное стекло и поместите предметное стекло на предметное стекло и поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.Используйте ручной аспиратор, чтобы собрать взрослых особей, инфицированных SRBSDV, из стеклянных стаканов и поместить их в 1,5-миллилитровую пробирку на льду, чтобы парализовать насекомых. Перенесите парализованного взрослого человека в 100 микролитров PBS на предметное стекло животом вверх. Используйте пинцет, чтобы зажать тело и удалить голову другим набором пинцета.Одним набором пинцетов зажмите боковые стороны живота и зажмите яйцеклад или копулятивный орган хвоста другим набором, затем осторожно потяните межсегментарную мембрану одного брюшного сегмента, чтобы медленно обнажить кишку в брюшной полости. Продолжайте отрывать оболочку и постепенно вытаскивайте всю кишку из брюшной полости. Осторожно оттяните хвост, который соединен с концом кишки, чтобы удалить всю кишку.Поместите вырезанные кишки в центрифужную пробирку объемом 200 микролитров. Добавьте в тюбик 200 микролитров PBS и с помощью пипетки тщательно промойте кишки. С помощью пипетки поместите 100 микролитров PBS на предметное стекло и поместите предметное стекло на предметное стекло и поместите предметное стекло на столик оптического микроскопа.Используйте ручной аспиратор, чтобы собрать зараженных SRBSDV нимф из стеклянных стаканов и поместить их в 1,5-миллилитровую пробирку, помещенную на лед, чтобы парализовать насекомых. Перенесите парализованную нимфу в буфер объемом 100 микролитров на предметном стекле животом вверх. Отсоедините хвост нимфы, затем зажмите тело насекомого, чтобы аккуратно зафиксировать его, и используйте другую пару, чтобы зажать голову.Осторожно оттяните голову от тела, сохраняя при этом ее прикрепление к кишечнику, чтобы голова была отделена от тела, но кишка все еще была прикреплена к грудной клетке и животу. Пока пинцет все еще зажимает тело, используйте другую пару, чтобы осторожно двигать головой и постепенно вытаскивать кишку. Отделите кишку от головы, чтобы получить неповрежденную кишку, не повреждая тело.Поместите иссеченные кишки в трубочку. Добавьте PBS в тюбик и аккуратно пососите, выпустите раствор пипеткой, чтобы тщательно промыть кишки. Подготовьте антитела и монтажную среду, как описано в текстовой рукописи.Поместите свежеиссеченные и промытые PBS кишки WBPH в 100 микролитров 4% параформальдегида в центрифужную пробирку объемом 200 микролитров при комнатной температуре. Через два часа замените раствор параформальдегида на 200 микролитров PBS. Через 10 минут удалите PBS, чтобы удалить параформальдегид, и повторите этап стирки PBS дважды.После двух стирок PBS добавьте 200 микролитров неионогенного моющего средства Triton X-100, чтобы пропитать образцы при комнатной температуре. Через 30 минут снимите Triton X-100 и смойте остатки моющего средства тремя 10-минутными стирками с PBS. Разбавьте меченые антитела один к 50 50 50 микролитрами бычьего сывороточного альбумина.Добавьте разбавленные антитела в пробирку и инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующее утро после удаления антитела смойте остатки разбавителя антител тремя 10-минутными промывками PBS. Разбавьте один микролитр DyLight 633-фаллоидина 50 микролитрами PBS и добавьте 50 микролитров разбавленного фаллоидина в пробирку для двухчасовой инкубации при комнатной температуре.После удаления фаллоидина тщательно смойте остатки фаллоидина тремя 10-минутными промывками PBS. Поместите каплю монтажного носителя, содержащего DAPI, на предметное стекло микроскопа. Переложите кишки в среду и аккуратно поместите покровное стекло на образец, не образуя пузырьков.Репрезентативная лазерная сканирующая конфокальная микрофотография иссеченных кишок WBPH у взрослых после мечения фаллоидином показала три среза: переднюю, среднюю и заднюю кишки. Среди них средняя кишка является начальным местом заражения SRBSDV. Монослойная эпителиальная клеточная структура кишечника облегчает изучение клеточной локализации белков насекомых и колокализации белков вирусов и насекомых.Здесь показаны иссеченные кишки WBPH с мечеными DyLight 488 анти-VAMP-7 и вирионами SRBSDV с мечеными DyLight 549 антителами против SRBSDV. Было показано, что вирионы VAMP-7 и SRBSDV локализуются в цитоплазме, что позволяет предположить, что VAMP-7 может играть роль в передаче вируса in vivo. Пермеабилизированные кишки следует тщательно очищать после инкубации с люцифериновыми конъюгированными антителами для снижения фона и неспецифического связывания.Это надежный метод просмотра локализации вируса, других патогенов и белков насекомых у насекомых. Это обеспечивает основу для дальнейших исследований взаимосвязи между патогенами и насекомыми.

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Вирус-индуцированные генов (VIGS) в Nicotiana benthamiana И томатный

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine ​​датчика в клетках

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров<em&gt; Комар желтолихорадочный</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Сравнительный анализ рекомбинантного белка слова в разных биофабрик: бактерии, клетках насекомых и растительных систем

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Прямая агроинокуляция саженцев кукурузы путем инъекции рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста и инфекционного клона вируса мозаики сахарного тростника

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...